《核酸的結(jié)構(gòu)》PPT課件.ppt

第二節(jié) 核酸的結(jié)構(gòu),一、核酸的一級結(jié)構(gòu),定義 核酸中核苷酸的排列順序。 由于核苷酸間的差異主要是堿基不同，所以也稱為堿基序列。,可以用堿基序列表示核酸的一級結(jié)構(gòu),核酸的一級結(jié)構(gòu),核苷酸間的連接鍵是： 3， 5-磷酸二酯鍵 相間排列的戊糖和磷酸構(gòu)成主鏈，堿基是有秩序連接的側(cè)鏈基團 線性核酸鏈都有一個3-末端和一個5-末端 可以堿基序列表示核酸的一級結(jié)構(gòu),核酸一級結(jié)構(gòu)的簡寫表示,5 pApGpTpGpCpT-OH 3,5 A G T G C T 3,核酸一級結(jié)構(gòu)書寫規(guī)則,用p表示磷酸基團。p在核苷左側(cè)時，表示磷酸與糖環(huán)的5 -羥基結(jié)合；在右側(cè)表示與3 -羥基結(jié)合。 舉例：pApCpGpU pApCp GpU:表示水解后C的3 -羥基連有磷酸基； pApC pGpU:表示水解后C的3 -羥基是游離的 P可省略，用字母表示。pACGU,簡寫式的讀向是從左到右，堿基序列是5到3,二、DNA的二級結(jié)構(gòu)-雙螺旋結(jié)構(gòu),（一）DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的研究背景,堿基組成分析 Chargaff 規(guī)則：A = T G C,堿基的理化數(shù)據(jù)分析 A-T、G-C以氫鍵配對較合理； 其他組合易相互排斥；如 G:T,DNA纖維有相似的X-線衍射圖譜， 說明DNA可能有共同的空間結(jié)構(gòu)。,Chargaff規(guī)則： （1）A=T （2）G=C （3）A+C=G+T （4）A+G=C+T,（二） DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點 （Watson, Crick, 1953）,DNA分子由兩條相互平行但走向相反的脫氧多核苷酸鏈組成，兩鏈以-脫氧核糖-磷酸-為骨架，以右手螺旋方式繞同一公共軸盤。 堿基對糖苷鍵的角度差異，使得形成大溝及小溝相間排列。大溝和小溝處堿基基團分布不同，可以與蛋白質(zhì)特異作用。兩個核苷酸間的夾角36,（二） DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點,堿基垂直螺旋軸居雙螺旋內(nèi)側(cè)，與對側(cè)堿基形成氫鍵配對（互補配對形式：A=T; GC） 。堿基在一條鏈上的排列順序不受任何限制。但根據(jù)堿基配對原則，一條核苷酸鏈序列可決定另一條互補鏈的序列。 雙螺旋的直徑為2nm，相鄰堿基平面距離0.34nm，螺旋一圈螺距3.4nm，一圈10對堿基。DNA分子大小常用堿基對數(shù)（bp）表示,堿基互補配對,T,A,G,C,堿基平面與縱軸垂直，糖環(huán)平面與縱軸平行,（二） DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)模型要點 （Watson, Crick, 1953）,大多數(shù)天然DNA屬于雙鏈DNA,某些病毒中DNA屬于單鏈DNA. 氫鍵維持雙鏈橫向穩(wěn)定性，堿基堆積力維持雙鏈縱向穩(wěn)定性。,DNA，雙螺旋，正反向，互補鏈。 A對T，GC連，配對時，用氫鍵(AT2，GC3) 十堿基，轉(zhuǎn)一圈，螺距34點中間。 堿基力和氫鍵，維持螺旋結(jié)構(gòu)堅。 PS: AT2，GC3：指AT之間二個氫鍵，GC間三個. 螺距34點中間即3.4。,DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)記憶歌訣,堿基堆積力形成疏水環(huán)境（主要因素） 。 堿基配對的氫鍵。GC含量越多，越穩(wěn)定。 磷酸基上的負電荷與介質(zhì)中的陽離子或組蛋白的正離子之間形成離子鍵，中和了磷酸基上的負電荷間的斥力，有助于DNA穩(wěn)定。 堿基處于雙螺旋內(nèi)部的疏水環(huán)境中，可免受水溶性活性小分子的攻擊。,穩(wěn)定雙螺旋結(jié)構(gòu)的因素,類型 結(jié)晶狀態(tài) 螺距 堿基距離 每圈 旋轉(zhuǎn) (nm) (nm) bp數(shù) 方向 A 相對濕度75% 2.3 0.255 11 右手 DNA鈉鹽 B 相對濕度92% 3.4 0.34 10 右手 DNA鈉鹽 C 相對濕度66% 3.1 0.332 9.3 右手 DNA鋰鹽 Z d(GCGCGC) 4.5 0.37 12 左手,三、 DNA二級結(jié)構(gòu)的其他類型,DNA單鍵可以旋轉(zhuǎn)，所以DNA會呈現(xiàn)不同二級結(jié)構(gòu)類型,DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的多樣性,DNA雙螺旋結(jié)構(gòu)的多樣性,Z型DNA,B型DNA,A型DNA,DNA的其他結(jié)構(gòu)類型,二重對稱結(jié)構(gòu)： 一條鏈堿基序列的正讀與另一條鏈 堿基序列的反讀相同。（回文順序） 2. 鏡像重復 此重復序列可能形成三螺旋DNA結(jié)構(gòu)。 三螺旋結(jié)構(gòu)可以阻止DNA的體外合成。 3. 四鏈結(jié)構(gòu) 由串聯(lián)重復的鳥苷酸鏈構(gòu)成。4條主鏈平行排列。,（一）定義 DNA雙螺旋通過扭曲和折疊所形成的特定構(gòu)象。 包括： 不同二級結(jié)構(gòu)單元間的相互作用 單鏈與二級結(jié)構(gòu)單元間的相互作用 DNA的拓撲特征 超螺旋是DNA三級結(jié)構(gòu)的主要形式。,第四節(jié) DNA的高級結(jié)構(gòu),超螺旋結(jié)構(gòu)(supercoil) DNA雙螺旋鏈再盤繞即形成超螺旋結(jié)構(gòu)。 超螺旋DNA結(jié)構(gòu)致密，增加了其穩(wěn)定性。,正超螺旋(positive supercoil) 盤繞方向與DNA雙螺旋方向相同 ,可增加螺旋圈數(shù)。DNA復制時，可在拓撲異構(gòu)酶的作用下消除正超螺旋的扭曲張力。,負超螺旋(negative supercoil) 盤繞方向與DNA雙螺旋方向相反 ，可減少螺旋圈數(shù)。解開負超螺旋，雙螺旋部分區(qū)域會形成單鏈區(qū)。生物體內(nèi)以負超螺旋存在,意義 DNA超螺旋結(jié)構(gòu)整體或局部的拓撲學變化及其調(diào)控對于DNA復制和RNA轉(zhuǎn)錄過程具有關(guān)鍵作用。,（二）環(huán)狀DNA的三種典型構(gòu)象,（1）、 松弛環(huán)形DNA（開環(huán)DNA) 超螺旋DNA的一條鏈斷裂，釋放扭曲張力形成的DNA （2）、 解鏈環(huán)形DNA (線性DNA) 超螺旋DNA的兩條鏈均斷裂形成的DNA （3）、 正超螺旋與負超螺旋DNA,連環(huán)數(shù)（linking number , L） DNA雙螺旋中，一條鏈以右手螺旋繞另一條鏈纏繞的次數(shù) 扭轉(zhuǎn)數(shù)（twisting number , T） DNA分子中的Watson-Crick螺旋數(shù)目，以T表示 超螺旋數(shù)（纏繞數(shù) , writhing number , W）,L=T+W,（三）拓撲異構(gòu)酶 改變DNA拓撲異構(gòu)體的L值。 拓撲異構(gòu)酶酶I（解旋酶） 能使雙鏈負超螺旋DNA轉(zhuǎn)變成松馳形環(huán)狀DNA，每次催化使L值增加1。 拓撲異構(gòu)酶酶II（促旋酶） 能使松馳環(huán)狀DNA轉(zhuǎn)變成負超螺旋形DNA，每次催化使L減少2。,核小體由DNA鏈連在一起形成念珠狀結(jié)構(gòu),（四）真核生物染色體的結(jié)構(gòu),1、染色體,真核生物染色體由DNA和蛋白質(zhì)構(gòu)成，其基本單位是 核小體(nucleosome)。,DNA的存在形式,核小體的組成及性質(zhì),1. 核小體的組成 DNA：在組蛋白核心外面纏繞1.75圈（約146bp） 組蛋白：H1 H2A，H2B H3 H4,2. 核小體核心顆粒含H2A, H2B,H3和H4各兩分子。連接核心顆粒的DNA片段結(jié)合一分子H1,串珠狀核小體結(jié)構(gòu),染色體的形成,串珠狀結(jié)構(gòu),螺線管,突環(huán),微帶,染色體（DNA的長度壓縮近10000倍）,常染色質(zhì)：間期細胞核中壓縮程度較低的，轉(zhuǎn)錄活性較高的染色體 異染色質(zhì)：壓縮程度較高，轉(zhuǎn)錄活性較低的染色體,串珠狀核小體,DNA雙螺旋片段,染色質(zhì)纖維,伸展形染色質(zhì)片段,密集形染色質(zhì)片段,整個染色體,2、序列特異性DNA結(jié)合蛋白（SDBP),指染色體中含有的非組蛋白，其主要與特異的DNA序列結(jié)合,SDBP種類： 高遷移率蛋白（HMG)、轉(zhuǎn)錄因子、DNA聚合酶、RNA聚合酶、參與基因表達調(diào)控的蛋白質(zhì)、染色體骨架蛋白等,DNA的功能,DNA的基本功能是以基因的形式荷載遺傳信息，并作為基因復制和轉(zhuǎn)錄的模板。它是生命遺傳的物質(zhì)基礎(chǔ)，也是個體生命活動的信息基礎(chǔ)。,基因從結(jié)構(gòu)上定義，是指DNA分子中的特定區(qū)段，其中的核苷酸排列順序決定了基因的功能。,第五節(jié) DNA和基因組,一、基因和基因組的概念,基因：一段有功能的DNA片段，生物細胞中DNA分子的最小功能單位（交換單位）。 DNA分子中最小的功能單位,結(jié)構(gòu)基因：為RNA或蛋白質(zhì)編碼的基因,調(diào)節(jié)基因：只有調(diào)節(jié)基因表達的功能，并不轉(zhuǎn)錄 生成RNA的基因 間隔序列：既不轉(zhuǎn)錄生成RNA，也沒有調(diào)節(jié)基因表達功能的序列,基因組：某物質(zhì)所含的全套遺傳物質(zhì),二、病毒和細菌基因組的特點,1、共同點 基因組較小，只有一個環(huán)形或線性的DNA分子 多數(shù)序列用來編碼蛋白質(zhì)，基因間的間隔序列很短 功能相關(guān)的基因常串聯(lián)在一起，由共同的調(diào)控元件調(diào)控，并轉(zhuǎn)錄成同一mRNA分子，指導蛋白質(zhì)合成，稱為操縱子。,2. 病毒基因組的特點,1）病毒基因組可以由DNA或RNA組成，但每種病毒只含一種核酸（單、雙鏈，環(huán)形、線性）。,2）根據(jù)合成蛋白質(zhì)的方式分類：,正鏈病毒：RNA進入宿主細胞后， 直接指導蛋白質(zhì)的合成 負鏈病毒：RNA進入宿主細胞后，先合成與其堿基序列互補的RNA, 再指導蛋白質(zhì)合成 雙鏈病毒：RNA為雙鏈，在宿主細胞中先以負鏈為模板合成正鏈RNA來指導蛋白質(zhì)合成，隨后合成負鏈RNA, 構(gòu)成雙鏈RNA，并和蛋白質(zhì)組裝成新的病毒 逆轉(zhuǎn)錄病毒：RNA進入宿主后，在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下，合成與其互補的DNA（cDNA), cDNA轉(zhuǎn)錄生成mRNA指導蛋白質(zhì)合成。,3）重疊基因 一段可以編碼多個肽鏈的核酸序列 重疊基因普遍存在，超過基因總量的10%,3. 細菌基因組的特點,細菌染色體有一環(huán)形或線性DNA分子，只有一個復制起點 編碼蛋白質(zhì)的基因是單拷貝的，但rRNA基因是多拷貝的 基因組有多種調(diào)控區(qū)和少量重復序列 基因組中存在可移動的DNA序列（轉(zhuǎn)座子）,三、真核生物基因組特點,基因組較大 核基因由多條線性染色體構(gòu)成，每條染色體含有一線性DNA分子，DNA分子含有多個復制起點。 不存在操作子 功能相關(guān)的基因組成基因簇，基因是在多種調(diào)控因子的作用下協(xié)調(diào)表達。,3. 存在大量的重復序列,高度重復序列 中度重復序列 低度重復序列 單一序列（非重復序列）,4. 有斷裂基因,大多數(shù)為蛋白質(zhì)編碼的基因都含有不編碼的內(nèi)含子和編碼的外顯子。 內(nèi)含子將基因分割成斷裂基因（不連續(xù)基因） 真核生物的基因組含有大量重復序列和內(nèi)含子，外顯子所占比例較小。（人類：1.5%）,第六節(jié) RNA的結(jié)構(gòu)與功能,1. 堿基組成 A、G、C、U （AU/GC） 稀有堿基較多，穩(wěn)定性較差，易水解 多為單鏈結(jié)構(gòu); 少數(shù)局部自身回折形成雙螺旋（40%70%), 不能配對的堿基形成突環(huán) 分子較小,組成特點,RNA通常是單鏈線形分子(一級結(jié)構(gòu)) 2. 自身回折形成局部雙螺旋(二級結(jié)構(gòu)) 3. 進而折疊（三級結(jié)構(gòu)） 4.多數(shù)形成核蛋白復合物（四級結(jié)構(gòu)） 如：核糖體、拼接體、編輯體等。,結(jié)構(gòu)特點,核糖核苷酸通過 3，5，-磷酸二酯鍵相連形成長鏈,RNA的種類、分布、功能,除了上述三種RNA外，細胞的不同部位存在的許多其他種類的小分子RNA，統(tǒng)稱為非mRNA小RNA(small non-messenger RNAs, snmRNAs)。,核糖體,RNA,核內(nèi)不均一,RNA,核內(nèi)小,RNA,細胞核和胞液,線粒體,功,能,rRNA,mRNA,mt,rRNA,tRNA,mt,mRNA,mt,tRNA,HnRNA,SnRNA,SnoRNA,scRNA/7SL,-,RNA,核糖體組分,蛋白質(zhì)合成模板,轉(zhuǎn)運氨基酸,成熟,mRNA,的前體,參與,hnRNA,的剪接、轉(zhuǎn)運,rRNA,的加工、修飾,蛋白質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位合成,的信號識別體的組分,RNA,信使RNA,轉(zhuǎn)運RNA,RNA,核內(nèi)小,胞漿小RNA,細胞核和胞液,線粒體,功,能,rRNA,mRNA,mt,rRNA,tRNA,mt,mRNA,mt,tRNA,HnRNA,SnRNA,SnoRNA,scRNA/7SL,-,RNA,蛋白質(zhì)合成模板,轉(zhuǎn)運氨基酸,的前體,的加工、修飾,蛋白質(zhì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)定位合成,的信號識別體的組分,核仁小RNA,含量,80 5 10-15,一、轉(zhuǎn)運RNA的結(jié)構(gòu)與功能,tRNA占細胞RNA總量的15%，在細胞核內(nèi)形成，分子量最?。?tRNA在細胞質(zhì)中將氨基酸轉(zhuǎn)運到核糖體-mRNA中，指導蛋白質(zhì)合成； 細胞內(nèi)有50種以上的tRNA； tRNA分子較小，沉降系數(shù)平均為4S。,由7090個核苷酸組成 含 1020% 稀有堿基 3末端為 CCA-OH 5末端大多數(shù)為G 具有 TC,（一）tRNA的一級結(jié)構(gòu)特點,稀有堿基,（二）tRNA的二級結(jié)構(gòu)三葉草型模型,1,2,3,反密碼子環(huán),反密碼子,載運氨基酸,四環(huán)四臂,氨基酸臂：由7對bp組成，富含G， 末端為CCA，接受活化AA 二氫尿嘧啶環(huán)（D環(huán)） 由814個核苷酸組成，含有二氫尿嘧啶核苷（D），與氨基酰tRNA合成酶的結(jié)合有關(guān) 反密碼環(huán)：識別mRNA上的密碼子 可變環(huán)：大小是tRNA分類的重要指標 假尿嘧啶核苷-胸腺嘧啶核苷環(huán)（T C環(huán)）： 含有保守的T C順序，可識別核蛋白體上的rRNA, 促使tRNA與核蛋白體結(jié)合,（三） tRNA的三級結(jié)構(gòu) 倒L形,tRNA三級結(jié)構(gòu)像倒寫的字母“L” 氨基酸臂和T C臂同軸排列，形成12bp的連續(xù)雙螺旋 反密碼子臂和D臂同軸排列，跟氨基臂所在軸垂直 D環(huán)和T C環(huán)組成倒L的轉(zhuǎn)角，兩環(huán)間的氫鍵和堿基堆積力穩(wěn)定了轉(zhuǎn)角構(gòu)象 D環(huán)， T C環(huán)和可變環(huán)中核苷酸殘基形成了特定的堿基對，穩(wěn)定了tRNA的三級結(jié)構(gòu),tRNA三級結(jié)構(gòu)特點,tRNA的功能： 結(jié)合活化氨基酸（ 3-CCA-OH ），搬運氨基酸到核糖體 識別mRNA密碼子。 參與蛋白質(zhì)的翻譯。,rRNA的特點 rRNA占細胞RNA總量的80%，分子量最大 核糖體由40%的蛋白質(zhì)和60%的rRNA組成 rRNA自身的構(gòu)象決定了核糖體亞基的形態(tài) 催化肽鍵合成的是rRNA 蛋白質(zhì)維持rRNA構(gòu)象，起輔助作用,二、核蛋白體RNA的結(jié)構(gòu)與功能,rRNA的功能 參與組成核蛋白體，催化肽鍵的形成。,rRNA的種類（根據(jù)沉降系數(shù)）,真核生物 5S rRNA 28S rRNA 5.8S rRNA 18S rRNA,原核生物 5S rRNA 23S rRNA 16S rRNA,復雜的多環(huán)多臂結(jié)構(gòu),大腸桿菌16s rRNA,核蛋白體的組成,三、信使RNA的結(jié)構(gòu)與功能,結(jié)構(gòu)特點： 1. mRNA占細胞總RNA的3%-5%，含量最少 2. mRNA編碼區(qū)的核苷酸序列決定蛋白質(zhì)的氨基酸序列 3. mRNA分子中含有非編碼區(qū),4. 大多數(shù)真核mRNA的5末端均在轉(zhuǎn)錄后加上一個7-甲基鳥苷，同時第一個核苷酸的C2也是甲基化，形成帽子結(jié)構(gòu)：m7GpppNm-。 mRNA的帽子結(jié)構(gòu)可保護mRNA免受核酸酶從5端的降解，并在翻譯起始中起重要作用。,5. 大多數(shù)真核mRNA的3末端有200多個腺苷酸殘基的結(jié)構(gòu)，稱為多聚A尾。其作用在于增加mRNA的穩(wěn)定性和維持其翻譯活動。,5末端帽子結(jié)構(gòu)：m7GpppN 3末端有多聚腺苷酸尾巴結(jié)構(gòu)(polyA) 單順反子（一條mRNA鏈上有一個編碼區(qū)）,真核生物、原核生物mRNA一級結(jié)構(gòu)特點,（1）真核細胞mRNA,真核生物mRNA的共價結(jié)構(gòu),原核生物mRNA為多順反子，無修飾堿基。 （多順反子mRNA：一條mRNA鏈上有多個編碼區(qū)）,（2）原核細胞mRNA,原核生物mRNA的轉(zhuǎn)錄和翻譯同時進行，不需剪接和加工，直接指導蛋白質(zhì)合成 真核生物先在核內(nèi)合成包含內(nèi)含子和外顯子的mRNA前體，形成分子大小不均一的核內(nèi)不均一RNA(hnRNA)。 hnRNA通過剪接和加工，轉(zhuǎn)化為成熟的mRNA, 進入細胞質(zhì)，指導蛋白質(zhì)合成。,真核生物、原核生物mRNA成熟過程的特點,內(nèi)含子 (intron),真核生物mRNA成熟過程,外顯子 (exon),真核生物,原核生物,mRNA的功能 把DNA所攜帶的遺傳信息，按堿基互補配對原則，抄錄并傳送至核糖體，用以決定其合成蛋白質(zhì)的氨基酸排列順序。,四、snRNA和snoRNA,核小RNA（ snRNA）含量及分布 主要存在于細胞核中，含量占總RNA量的0.1%1%。 snRNA存在形式及作用 snRNA均與蛋白質(zhì)相連，以核糖核蛋白的形式存在。 在hnRNA的剪接、細胞分裂和分化、細胞內(nèi)物質(zhì)運輸及構(gòu)成染色體等方面起作用。,核仁小RNA（snoRNA)： 位于核仁，幾十幾百個堿基。 snoRNA參與rRNA前體的加工以及部分核苷酸的甲基化修飾。,五、反義RNA和RNA干擾,反義RNA（asRNA)的特性 asRNA在翻譯水平上抑制基因表達，還可抑制DNA復制和轉(zhuǎn)錄。 asRNA穩(wěn)定性較差。 RNA干擾（RNAi) 利用雙鏈RNA抑制特定基因表達的技術(shù)。 （應(yīng)用一段與asRNA序列互補的RNA，兩者構(gòu)成雙鏈，穩(wěn)定性增強，抑制率增加）,六、非編碼RNA的多樣性,高等生物的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物有97%以上是不編碼蛋白質(zhì)的。 非編碼RNA（ncRNA）：不編碼蛋白質(zhì)，以RNA形式發(fā)揮作用。,按ncRNA的功能分類 催化RNA（cRNA)：核酶，有催化功能并參與RNA的加工 類似mRNA的RNA： 指導RNA（gRNA): 指導mRNA編輯的小RNA分子 tmRNA：既可以轉(zhuǎn)運氨基酸，又可以作為模板 端粒酶RNA: 作為染色體端粒復制的模板 信號識別顆粒（SRP）：參與細胞內(nèi)蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)運 微小RNA（miRNA): 參與基因表達和個體發(fā)育的調(diào)控 小干擾RNA（siRNA): 在RNA干擾中介導靶mRNA降解,ncRNA的分類,2. 按ncRNA的分布分類,核小RNA（snRNA） 剪接體snRNA U7-snRNA 核仁小RNA（snoRNA) 最豐富的ncRNA, 參與rRNA及其他RNA的加工成熟 胞質(zhì)小RNA（scRNA） 位于細胞質(zhì)，參與蛋白質(zhì)的合成過程 Cajal 小體小RNA（CBs） 參與核糖甲基化和假尿嘧啶形成,3. 按ncRNA的大小分類,2125nt的ncRNA 包括miRNA家族和小干擾RNA家族，參與基因表達。 100200nt的ncRNA 參與細菌細胞的翻譯調(diào)節(jié) 大于10000nt的ncRNA 參與高級真核生物的基因沉默,RNA既可以作為遺傳物質(zhì)，又可以實現(xiàn)蛋白質(zhì)的使命,RNA可能是DNA和蛋白質(zhì)的共同祖先； 生物進化早期可能是一個由RNA主導的世界,核 酸 的 理 化 性 質(zhì),第 七 節(jié),一、核酸一般理化性質(zhì),（一）核酸的水解,酸、堿、酶水解 水解位點在磷酸二酯鍵和糖苷鍵 DNA/RNA對酸/堿的耐受程度有差別 堿性條件下，RNA可被稀堿水解；而DNA變性，但不被水解；可用此法測定RNA的堿基組成或去除RNA雜質(zhì) 酸性條件下，糖苷鍵不穩(wěn)定，嘌呤與脫氧核糖間的糖苷鍵最易被水解；故對核酸部分水解時，很少采用酸水解,（二）核酸的酸堿性質(zhì),1、堿基的解離,具有芳香環(huán)結(jié)構(gòu)特點，能發(fā)生酮式/烯醇式互變 堿基都具有弱堿性（主要是環(huán)內(nèi)氨基的貢獻）,2、核苷的解離 戊糖可增強堿基的解離 核糖中的羥基也可發(fā)生解離 3、核苷酸的解離 磷酸基使核苷酸具有很強的酸性,核酸為兩性物質(zhì)，通常具有較強的酸性（在中性溶液中帶負電荷）； DNA等電點為44.5；RNA等電點為22.5,DNA是白色線性高分子，粘度極大；RNA為白色粉末，粘度較小 DNA和RNA均微溶于水，不溶于有機溶劑，常用乙醇從溶液中沉淀核酸 加熱時，D核糖濃鹽酸苔黑酚 綠色 D-2脫氧核糖酸二苯胺 藍紫色,（三）核酸的其他理化性質(zhì),二、核酸的紫外吸收性質(zhì),堿基含有共軛雙鍵，可強烈吸收250290nm處的紫外光，最大吸收峰260nm左右 核酸紫外吸收性質(zhì)的應(yīng)用 可利用紫外光照相來定位測定核酸在細胞和組織中的分布 每摩爾堿基在一定PH下的紫外吸收值為定值，故利用此性質(zhì)可定量堿基或堿基衍生物在純?nèi)芤褐械暮?利用堿基的紫外吸收性質(zhì)可確定其在色譜和電泳譜上的位置 載體（淺藍色熒光）， 核酸區(qū)（暗區(qū)）,增色效應(yīng) 將核酸水解為核苷酸，紫外吸收值會增加30%40%，這種現(xiàn)象稱為增色效應(yīng),原因：雙螺旋結(jié)構(gòu)中，堿基有規(guī)律的緊密堆積降低了其對紫外光的吸收,DNA或RNA的定量 OD260=1.0相當于 50g/ml雙鏈DNA 40g/ml單鏈DNA（或41.67g/ml RNA） 20g/ml寡核苷酸 DNA濃度（g/ml)=OD260 50; RNA濃度(g/ml)= OD260 41.67 2.判斷核酸樣品的純度 DNA純品: OD260/OD280 = 1.8 RNA純品: OD260/OD280 = 2.0 含雜蛋白及苯酚，比值會降低,OD260的應(yīng)用,三、 核酸結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性的因素, 堿基堆積力 堿基處于雙螺旋內(nèi)部的疏水環(huán)境中，堿基平面間的范德華力和疏水作用力共同組成堿基堆積力，是結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的主要因素。 堿基配對的氫鍵。GC含量越多，越穩(wěn)定。 環(huán)境中的正離子 磷酸基上的負電荷與介質(zhì)中的正離子或組蛋白的正離子之間形成離子鍵，中和了磷酸基上的負電荷間的斥力，有助于DNA穩(wěn)定。,四、DNA的變性(denaturation),（一）定義：在某些理化因素作用下，雙螺旋區(qū)氫鍵斷裂，DNA雙鏈解開成兩條單鏈無規(guī)則線團狀態(tài)的過程。,變性時，某些理化因素破壞了氫鍵和堿基堆積力，使核酸分子高級結(jié)構(gòu)改變、理化性質(zhì)及生物活性發(fā)生改變。 但不涉及磷酸二酯鍵斷裂，一級結(jié)構(gòu)不變,核酸降解：核苷酸骨架上3，5 -磷酸二酯鍵的斷裂,DNA變性的本質(zhì)是雙鏈間氫鍵的斷裂,DNA變性,影響核酸變性的因素： 過量酸，堿，加熱（一般75）， 變性試劑如尿素、酰胺， 某些有機溶劑（如乙醇、丙酮等）,變性后理化性質(zhì)的改變：,OD260增高、粘度下降、比旋度下降、 浮力密度升高、酸堿滴定曲線改變、 生物活性喪失,RNA變性：從螺旋到線團之間的轉(zhuǎn)變 RNA的變性引起的性質(zhì)變化沒有DNA明顯,核酸變性引起紫外吸收值的增加-增色效應(yīng),DNA的紫外吸收光譜,完全變性后核酸紫外吸收值增加： 天然DNA 2540%、RNA 約1.1% 實質(zhì)：堿基暴露,由于變性或降解引起核酸紫外吸收增加的現(xiàn)象稱增色效應(yīng),OD260 : 單核苷酸單鏈DNA雙鏈DNA,1. 解鏈曲線：如果在連續(xù)加熱DNA稀鹽溶液的過程中以溫度對A260（absorbance，A，A260代表溶液在260nm處的吸光率）值作圖，所得的曲線稱為解鏈曲線。,（二）核酸的熱變性及Tm,變性過程是“躍變式”的，而非漸變,2. Tm：變性是在一個相當窄的溫度范圍內(nèi)完成，在這一范圍內(nèi)，紫外光吸收值達到最大值的50%時的溫度稱為DNA的解鏈溫度，又稱熔解溫度(melting temperature, Tm)。其大小與G+C含量成正比。,雙鏈RNA比雙鏈DNA穩(wěn)定，Tm高大約20 C 一般DNA Tm 值在85 - 90 C之間,3. 影響Tm的因素,G-C含量：G-C含量越高，Tm越高 經(jīng)驗公式:（G+C)%=(Tm-69.3)X2.44 溶液的離子濃度：濃度越低，Tm越低 離子溶液的PH PH大于11.3時，堿基不能形成氫鍵，DNA完全變性；PH小于5.0，DNA易脫嘌呤 變性劑：變性劑可破壞氫鍵，使Tm下降,五、DNA的復性,1. DNA復性(renaturation)的定義 在適當條件下，變性DNA的兩條互補鏈可恢復天然的雙螺旋構(gòu)象，這一現(xiàn)象稱為復性。 DNA復性后，一系列性質(zhì)將得到恢復，但是生物活性一般只能得到部分的恢復，具有減色效應(yīng)。,減色效應(yīng) DNA復性時，其紫外吸收降低,變性和復性是可逆的， 將熱變性的DNA驟然冷卻至低溫時，DNA不可能復性。 熱變性的DNA經(jīng)緩慢冷卻后即可復性，這一過程稱為退火(annealing) 。退火溫度Tm25,2. 影響復性的因素,復性的溫度：Tm25是合適的溫度，不宜太低 單鏈片段的濃度：濃度越高，碰撞頻率越高，復性越快 單鏈片段的長度：片段越大，錯配率越高，復性越慢 單鏈片段的復雜度：重復序列越多，復雜度越小，越易 形成互補區(qū)，復性速度越快 溶液的離子濃度：維持一定的正離子濃度，消除磷酸基負電荷引起的斥力，可加快復性,六、 核酸的分子雜交,熱變性的DNA在復性過程中，具有堿基序列部分互補的不同的DNA之間或DNA與RNA之間形成雜化雙鏈的現(xiàn)象。這樣形成的新分子稱為雜交DNA分子。 核酸的雜交在分子生物學和遺傳學的研究中具有重要意義。,探針,探針技術(shù)：在核酸雜交的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種用于研究和診斷的新技術(shù)。 探針(probe)：經(jīng)同位素或熒光標記的具有特定堿基序列的單鏈核苷酸聚合體。 探針可用于：基因診斷、致病基因的定位、Southern blotting、Northern blotting、原位雜交、DNA芯片技術(shù)等臨床實踐和科研。,核酸分子雜交是根據(jù)兩條核酸單鏈在一定條件下可按堿基互補原則退火形成雙鏈的原理，用已知的單鏈核苷酸片段作為探針檢測樣本中是否存在與其互補的同源核酸序列的方