落新婦苷納米硒的合成及其抗氧化作用

落新婦苷納米硒的合成及其抗氧化作用落新婦苷納米硒的合成及其抗氧化作用摘 要以落新婦苷作為表面修飾劑制備納米硒溶膠，通過紫外可見分光光度法、傅里葉紅外色譜分析法對落新婦苷納米硒進行表征，并利用高效液相色譜法測定落新婦苷納米硒中落新婦苷的具體含量；最后通過對羥自由基、氧自由基清除能力及還原力的測定，評價落新婦苷納米硒溶膠的抗氧化活性。結(jié)果顯示，與落新婦苷原料相比，落新婦苷納米硒的紫外特征吸收峰及傅里葉紅外光譜中的羥基均發(fā)生偏移，證明落新婦苷成功修飾在納米硒表面；通過高效液相色譜法測得落新婦苷納米硒中落新婦苷的濃度為0.197 g/mL；抗氧化實驗中以落新婦苷、Vc做陽性對照，發(fā)現(xiàn)落新婦苷納米硒溶膠對羥自由基和氧自由基的清除力顯著提高，且隨著落新婦苷納米硒濃度的增大而增大，同時落新婦苷納米硒的還原力也有明顯提高。本次實驗說明落新婦苷成功修飾在納米硒材料上后，極大的發(fā)揮了落新婦苷的生物學價值，增加了落新婦苷的利用率，為落新婦苷的生物應(yīng)用提供了新的思路和方法。關(guān)鍵詞：落新婦苷納米硒；高效液相色譜法；紫外可見光光度法；傅里葉紅外色譜分析法；抗氧化性IAbstractNami was prepared by using astilbe chinensis as surface modifier, and the selenium was characterized by UV-vis spectrophotometry and Fourier transform infrared spectroscopy ( FTIR ). the content of astilbe chinensis in Nami was determined by HPLC Finally, the antioxidant activity of astilbe chinensis nanoparticles was evaluated by the determination of hydroxyl free radical, oxygen free radical scavenging and reducing power. The results showed that compared with astilbe chinensis, the ultraviolet characteristic absorption peak of astilbe chinensis and the hydroxyl group in Fourier transform infrared spectrum indicated that astilbe chinensis was successfully modified on the surface of Nami Determination of astilbe chinensis in selenium Nami by high performance liquid chromatography .The concentration of astilbin measured astilbin nano selenium by HPLC was 0.197 mu g/mL; antioxidation experiment in astilbin and Vc as positive control, found that the scavenging capacity of nano selenium sol by astilbin on hydroxyl radical and oxygen free radicals increased significantly, and increases with the drop of astilbin Nanoselenium at the same time, the concentration of the reducing power of astilbin nano selenium can be improved significantly. This experiment shows that astilbin successfully modified in nano selenium material, exerts its biological value of astilbin, increase the utilization rate of astilbin, provides new ideas and methods for the biological application of astilbin.Keywords: astilbin nano selenium; HPLC; ultraviolet visible spectrophotometry; analysis of Fourier transform infrared chromatography; antioxidation14引 言落新婦苷(astilbin，圖1)，2(R):3(R)-3,4,5,7-4羥基黃烷酮-3-L-吡喃鼠李糖苷，是一種從傳統(tǒng)中藥土茯苓(Rhizoma Smilacis Glabrae)中提取的二氫黃酮類化合物，為土茯苓的有效成分之一1。近年研究發(fā)現(xiàn)，落新婦苷廣泛存在于自然界多種植物中，如巴西蕓香（Dimorphandramollis），葡萄，土茯苓，菝葜，黃杞葉，貫葉連翹，草珊瑚等。落新婦苷具有很強的的抗氧化能力，能有效清除超氧陰離子和羥自由基等2，具有抑制輔酶A還原酶，抑制醛糖還原酶，保護肝臟，鎮(zhèn)痛，抗水腫等多種生物學活性，并且具有選擇性免疫抑制作用，可以作為免疫抑制劑用于免疫相關(guān)疾病的治療。落新婦苷易溶于甲醇、乙醇、乙酸乙酯等有機溶劑，但其水溶性極差，25 時溶解度僅為250 g/mL，根據(jù)中國藥典屬極微溶解樣品，這在一定程度上限制了落新婦苷的生物應(yīng)用。硒能以多種化學形式存在于生物體內(nèi),并通過食物鏈影響到人體，硒是人類必需的微量元素，對人體健康有著重要作用4，但其營養(yǎng)劑量和可耐受的最高劑量之間范圍極窄，容易引起硒中毒。相對于無機硒和有機硒，當單質(zhì)硒以納米態(tài)存在時具有很高的生物活性和安全低毒性。納米硒具有抗氧化性和抗癌性，可以預(yù)防和治療多種疾5。因此，無毒且高生物活性的納米硒作為藥物、保健品等被廣泛的用于生物、醫(yī)藥領(lǐng)域。為獲取穩(wěn)定的納米材料,其有效方法之一是加入修飾劑。本實驗選用落新婦苷為修飾劑制備納米硒溶膠，既可以克服落新婦苷水溶性差的特點，又能克服無機硒和有機硒毒性大這一缺點。通過評價落新婦苷納米硒溶膠對羥自由基、氧自由基的清除效果，證明落新婦苷納米硒有望成為一種高效的、穩(wěn)定的新型抗氧化材料，為落新婦苷修飾納米硒這一技術(shù)能更好地運用在食品、醫(yī)療衛(wèi)生等領(lǐng)域提供了理論依據(jù)，也為水溶性極差的落新婦苷的生物應(yīng)用開闊了新的前景。圖1 落新婦苷分子結(jié)構(gòu)1 試驗材料與方法1.1 主要試劑落新婦苷（純度為80%） 南京景竹生物科技有限公司亞硒酸鈉 山東西亞化學工業(yè)有限公司維生素C 上海藍季科技發(fā)展有限公司 鄰苯三酚 天津市大茂化學試劑廠鹽酸 天津市大茂化學試劑廠磷酸二氫鈉 天津市大茂化學試劑廠無水乙醇 天津市大茂化學試劑廠雙氧水 天津市大茂化學試劑廠過硫酸鉀 天津市大茂化學試劑廠綠礬 天津永大化學試劑開發(fā)中心水楊酸 天津永大化學試劑開發(fā)中心磷酸氫二鈉 天津永大化學試劑開發(fā)中心Tris-HCl 北京索萊寶科技有限公司三氯乙酸 天津市福晨化學試劑廠鐵氰化鉀 天津市福晨化學試劑廠三氯化鐵 西隴化工股份有限公司1.2 儀器與設(shè)備超純水機 廈門精藝興業(yè)科技有限公司JD1000-2電子天平 沈陽龍騰電子有限公司GPX-9248干燥箱/培養(yǎng)箱（兩用） 上海躍進醫(yī)療器械有限公司HH-數(shù)顯恒溫攪拌循環(huán)水箱 上海圣科儀器設(shè)備有限公司CL-3型恒溫加熱磁力攪拌器 鞏義市予華儀器有限責任公司UV-5200PC紫外可見分光光度計 上海美析儀器有限公司YP-2壓片機 上海山岳科學儀器有限公司IS5傅里葉紅外光譜儀 上海力晶科學儀器有限公司TGL-16GB臺式離心機 上海書培實驗設(shè)備有限公司TDL-5-A低速大容量離心機 上海安亭科學儀器廠SB-3200DTDN超聲波清洗機 寧波新藝生物科技服份有限公司BDC-215KS電冰箱 青島海爾股份有限公司1.3 主要試劑配制方式 1.3.1 落新婦苷納米硒合成所需溶液1）60乙醇溶液：量取60 mL無水乙醇并加入40 mL的超純水，混勻。2） 25 mM的落新婦苷的乙醇溶液：將純度為80的落新婦苷粉末準確稱取0.35 g，溶于60乙醇中6，定量轉(zhuǎn)入25 mL的容量瓶中，并定容至刻度。3）0.1 M的Na2SeO3溶液：準確稱取0.17 g Na2SeO3粉末，溶于超純水中，轉(zhuǎn)入10 mL容量瓶中，并定容至刻度。1.3.2 清除羥自由基所需溶液1）6 mM的綠礬（FeSO47H2O）溶液：準確稱取0.17 g綠礬晶體，用超純水溶解于燒杯中，轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶，定容至刻度，搖勻。2）6 mM的水楊酸溶液：準確稱取0.03 g水楊酸，用無水乙醇溶于燒杯中，轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶，定容至刻度，搖勻。3）6 mM的雙氧水：準確稱取0.07 g 30H2O2溶液于100 mL容量瓶中，并用超純水定容至刻度，搖勻。1.3.3 還原力測定所需溶液1）磷酸緩沖液（0.2 mol/mL, pH=6.6）：甲液-M（磷酸氫二鈉十二結(jié)合水）：稱取7.16 g溶于燒杯中，用蒸餾水定容于100mL的容量瓶中； 乙液-M（磷酸二氫鈉）：稱取2.5 g溶于燒杯中，用蒸餾水定容于100 mL的容量瓶中,取40 mL甲液，60 mL乙液混合，即配制成目標液。2）鐵氯化鉀溶液（1%）：稱取1 g鐵氰化鉀溶于燒杯中，加蒸餾水定容于100 mL的容量瓶中。3）三氯乙酸溶液（10）：稱取10 g三氯乙酸溶于燒杯中，用蒸餾水定容于100 mL的容量瓶中。4）三氯化鐵溶液（0.1%）：稱取0.1 g的三氯化鐵溶于燒杯中，用蒸餾水定容于100 mL的容量瓶中。1.3.4 清除超氧陰離子所需溶液1）Tris-Hcl溶液（50 mM，pH=8.2）：稱取0.61 g樣品于燒杯中，加入80 mL去離子水，加濃鹽酸調(diào)pH為8.2，再移入100 mL容量瓶中定容。2) 鄰苯三酚溶液（25 mM）：準確稱取鄰苯三酚0.32 g，用超純水溶解于燒杯中，轉(zhuǎn)入100 mL容量瓶，定容至刻度，搖勻。3) HCl溶液（10 mM）：準確吸取0.08 mL濃度為12 mol/L HCl于100 mL容量瓶中，并用超純水定容至刻度，搖勻。1.3.5 標準溶液1) 落新婦苷標準溶液：準確稱取落新婦苷標準品1 mg溶于1 mL 60%乙醇中，搖勻。2) Vc溶液：準確稱取0.02 g Vc，用超純水溶解于燒杯中，轉(zhuǎn)入100 mL棕色容量瓶中，定容至刻度，搖勻，低溫避光保存。2 試驗方法2.1 落新婦苷的納米合成取配制好的0.1 M Na2SeO3溶液0.5 mL，25 mM落新婦苷乙醇溶液8 mL，按順序加入小燒杯中，以450 r/min轉(zhuǎn)速在室溫條件下用CL-3型恒溫加熱磁力攪拌器攪30 min,待溶液由無色變成穩(wěn)定的磚紅色膠體后，將溶膠移入離心管，在6000 r/min的條件下離心10 min，取出上清液，將沉淀用60%乙醇洗滌并重新分散得到穩(wěn)定的納米硒溶膠。2.1.1 高效液相色譜法對落新婦苷納米硒的定性和定量分析色譜條件：色譜柱：C18 Agilent Eclipse Plus；流動相：乙腈（A）-0.1%乙腈水溶液（B）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：290 nm；柱溫：40 ；進樣量：10 L將1 mL落新婦苷標準溶液及其納米硒溶膠用1 mL射器分別注入進樣瓶中，用0.22 m的濾頭過濾，然后放入貯液器準備進樣。當待測樣品從進樣器注入時，流經(jīng)進樣器的流動相將其帶入色譜柱中進行分離，然后進入檢測器，由記錄儀將檢測器送出的信號記錄下來得到色譜圖。2.1.2 紫外可見分光光度法鑒定落新婦苷納米硒的合成將上述重新分散后的落新婦苷納米硒溶膠，用60%的乙醇溶液稀釋成樣液，采用紫外可見光光度法在200-700 nm的波長范圍內(nèi)對樣液進行波譜掃描，以60%乙醇溶液做基準線校正液，將落新婦苷醇溶液與落新婦苷納米硒樣液的紫外光譜進行對比。2.1.3 傅里葉紅外光譜分析法鑒定落新婦苷納米硒的合成將上述重新分散后的落新婦苷納米硒溶膠再次離心10 min后，將所得的沉淀放入干燥箱干燥，以待備用：然后取1-2 mg溴化鉀晶體研細均勻，置于干燥的模具中，壓成透明薄片，用紅外色譜儀掃描以扣除背景影響；接著將落新婦苷原料和干燥后的落新婦苷納米硒分別與溴化鉀研細混勻(顆粒徑小于2 m)，壓成透明薄片，在4000-400 cm-1范圍內(nèi)進行紅外波譜掃描，記錄紅外譜圖。2.2 抗氧化試驗2.2.1 清除羥自由基利用H2O2與FeSO4混合產(chǎn)生OH，在體系內(nèi)加入水楊酸能有效地捕捉OH并產(chǎn)生有色物質(zhì)，該物質(zhì)在波長510 nm處有最大吸收。參照文獻7的方法，在單位體積下，將落新婦苷納米硒溶膠配制成濃度為0、10、20、30、40、50 g/mL的樣液于6支試管中，依次加入 1mL 6mM FeSO4溶液和6 mM H2O2，靜置10 min后加入1 mL水楊酸，混勻靜置30 min，然后在510 nm處測吸光度值A(chǔ)i；其他條件不變，以1 mL超純水代替水楊酸測吸光度Aj；空白對照組以1 mL超純水代替樣品溶液測吸光度A0。以落新婦苷原料、Vc為陽性對照，計算羥自由基的清除率E：羥自由基清除率（%）E=（A0-Ai+Aj）/A0100式中：A0為空白對照組的平均吸光度值，Ai為試樣的平均吸光度值，Aj為超純水代替水楊酸組的平均吸光度值。以樣品濃度為橫坐標，羥自由基清除率為縱坐標建立標準曲線，將三者進行比較，得出他們之間的關(guān)系。2.2.2 清除超氧陰離子采用鄰苯三酚自氧化法測定,鄰苯三酚在堿性條件下，能迅速自氧化產(chǎn)生O2-，在320 nm處有光吸收，加入一定量的自由基消除劑可對O2-產(chǎn)生不同的抑制作用,進而導致吸光值的變化。參照文獻8的方法，將落新婦苷納米硒溶膠配制成濃度為0、2、4、6、8、10 g/mL的樣液，備用；取12支相同規(guī)格的試管，依次加入2.25 mL的TrisHCl（50 mmol/L pH=8.2）溶液和1 mL的超純水，在25 下水浴20 min，之后依次加入1 mL上述配好的待測樣品，再加入0.25 mL 25 mmol/L的鄰苯三酚溶液，混合后在25 oC水浴中反應(yīng)6 min，6 min后加入0.5 mL HCl（10 mmol/L）溶液終止反應(yīng)。在320 nm處測其吸光度值A(chǔ)i，在其他處理不變的情況下，以0.25 mL超純水代替鄰苯三酚測吸光度Aj，以1 mL超純水代替樣品溶液測吸光度A0。以落新婦苷、Vc為陽性對照。超氧陰離子自由基的清除率S的計算公式為： 超氧陰離子自由基清除率（%）S=（A0-Ai+Aj）/A0100式中：A0為空白對照的平均吸光度值，Ai為試樣的平均吸光度值，Aj為超純水代替鄰苯三酚組的平均吸光度值。以樣品濃度為橫坐標，超氧陰離子自由基清除率為縱坐標建立標準曲線，得出他們之間的關(guān)系。2.3 還原力的測定采用普魯士蘭法來評價落新婦苷納米硒溶液的還原力。參照文獻9的方法。在單位體積下，將落新婦苷納米硒溶液配制成濃度為0、10、20、30、40、50 g/mL的樣液置于試管中，依次加入0.2 mol/L磷酸鹽緩沖液1.25 mL和1%的鐵氰化鉀溶液1.25 mL，混勻后于50 水浴中保溫20 min后，快速冷卻，再加入1.0 mL 10%三氯乙酸，以3000 r/min的轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液0.5 mL，加入0.1%的三氯化鐵溶液0.25 mL，再加1.75 mL超純水，充分混勻，靜置10 min，在700 nm處測定其吸光值A(chǔ)i，以落新婦苷、Vc作陽性對照。3 結(jié)果與分析3.1 落新婦苷的納米合成3.1.1 高效液相色譜法對落新婦苷納米硒的定性和定量分析在一定的色譜操作條件下，每種物質(zhì)有一定的保留值，而被測物質(zhì)的質(zhì)量mi與檢測產(chǎn)生的信號色譜峰的面積Ai或峰高hi成正比，即：mi=iAi或mi=ihi式中，i、i為比例常數(shù)，分別成為峰面積和峰高絕對校正因子。圖2.1 落新婦苷標準溶液色譜圖圖2.2 落新婦苷納米硒的色譜圖如圖2.1與2.2所示，落新婦苷標準溶液的峰面積A0=1.11275104 mAu*s，保留時間T0=17.845 min，落新婦苷納米硒的峰面積A=0.0438104mAu*s，T=17.810min。將落新婦苷納米硒的色譜圖與落新婦苷標準溶液的進行對比，發(fā)現(xiàn)其保留時間偏差很小，在同一操作條件下，可將其視為同種物質(zhì)，由此證明落新婦苷成功修飾在納米硒上，其濃度為0.197 g/mL。3.1.2 紫外可見分光光度法鑒定落新婦苷納米硒的合成將落新婦苷納米硒樣液與落新婦苷醇溶液的紫外光譜進行對比，如圖3所示。落新婦苷是一種二氫黃酮醇苷，在291、325 nm處各有一吸收峰10。在其他條件相同的情況下，落新婦苷修飾納米硒后在291 nm處的特征吸收峰發(fā)生位移，往長波方向移動2 nm，即吸收峰紅移。由此可以判斷，落新婦苷成功修飾在納米硒表面。圖3 落新婦苷納米硒與落新婦苷的紫外光譜圖3.1.3 傅里葉紅外光譜分析法鑒定落新婦苷納米硒的合成將落新婦苷納米硒樣液與落新婦苷醇溶液的紅外光譜進行對比，如圖4所示。落新婦苷具有酚羥基、苯環(huán)、羰基的特征吸收峰。落新婦苷原料羥基的峰出現(xiàn)3447.96cm-1處，合成后的落新婦苷納米硒羥基的峰出現(xiàn)在3396.59cm-1處，說明合成后的羥基發(fā)生了藍移，羥基參與了合成，落新婦苷成功修飾在納米硒微表面。圖4 落新婦苷納米硒樣液與落新婦苷醇溶液的紅外光譜3.2 抗氧化試驗3.2.1 羥自由基清除力的測定落新婦苷納米硒溶液、落新婦苷醇溶液、Vc溶液對羥自由基的清除作用如圖5所示。從圖5知，隨著濃度的增大，這三者的清除效果越大，在濃度為50 g/mL時落新婦苷納米硒溶液、落新婦苷醇溶液、Vc溶液對羥基的清除率分別為98.09%、66.69%、47.97%，清除能力為落新婦苷納米硒溶液落新婦苷醇溶液Vc,說明落新婦苷成功修飾在納米硒上后對羥自由基的清除力顯著提高。圖5 落新婦苷納米硒、落新婦苷、Vc對羥自由基的清除作用圖3.2.2 超氧陰離子清除能力的測定落新婦苷納米硒溶液、落新婦苷醇溶液、Vc對超氧陰離子的清除作用如圖6所示。這三種物質(zhì)對超氧陰離子的清除率隨濃度的增大而增大，清除率強弱為：落新婦苷納米硒溶液落新婦苷醇溶液Vc。其中，Vc的清除率隨濃度的增加變化最小，落新婦苷原料變化最大。圖6 落新婦苷納米硒、落新婦苷、Vc對超氧陰離子的清除作用圖3.3 還原力的測定落新婦苷納米硒溶液、落新婦苷醇溶液、Vc溶液還原力比較如圖7所示。這三種物質(zhì)的還原力隨著濃度的增大而增大，還原力強弱為：落新婦苷納米硒Vc落新婦苷醇溶液。其中，落新婦苷納米硒溶液的呈現(xiàn)出顯著的還原力，而落新婦苷原料的還原力最弱，且隨濃度的增大還原力變化最小。圖7 落新婦苷納米硒、落新婦苷、Vc的還原力圖4 結(jié)論通過對落新婦苷納米硒樣品溶液顏色變化的觀察以及運用表征試驗對落新婦苷納米硒進行表征,各個特征峰的偏移說明我們成功的制備出了落新婦苷納米硒。落新婦苷修飾在納米硒的表面，使得所制備的落新婦苷納米硒在水中具有良好的穩(wěn)定的分散體系?？寡趸瘜嶒灡砻髀湫聥D苷修飾后的納米硒對于清除羥自由基、超氧陰離子及還原力都有顯著提高,落新婦苷納米硒具有良好的抗氧化效果。這種方法的操作過程簡便、所選用的試劑無毒、反應(yīng)條件溫和，所制備落新婦苷納米硒作為新型抗氧化劑具有良好的應(yīng)用前景。參考文獻1 張