GB5413.19-2010食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)嬰幼兒食品和乳品中游離生物素的測定.pdf

中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)中華人民共和國國家標(biāo)準(zhǔn)GB 5413.192010中 華 人 民 共 和 國 衛(wèi) 生 部中 華 人 民 共 和 國 衛(wèi) 生 部 發(fā)布 2010-03-26 發(fā)布 2010-06-01 實(shí)施食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中游離生物素的測定 National food safety standard Determination of free biotin in foods for infants and young children, milk and milk products GB 5413.192010 I 前 言 本標(biāo)準(zhǔn)代替GB/T 5413.19-1997嬰幼兒配方食品和乳粉 游離生物素的測定。 本標(biāo)準(zhǔn)附錄A為規(guī)范性附錄。 本標(biāo)準(zhǔn)所代替標(biāo)準(zhǔn)的歷次版本發(fā)布情況為： GB 5413-1985、GB/T 5413.19-1997。 GB 5413.192010 1 食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 嬰幼兒食品和乳品中游離生物素的測定 1 范圍 本標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定了嬰幼兒食品和乳品中游離生物素的測定方法。 本標(biāo)準(zhǔn)適用于嬰幼兒食品和乳品中游離生物素的測定。 2 規(guī)范性引用文件 本標(biāo)準(zhǔn)中引用的文件對于本標(biāo)準(zhǔn)的應(yīng)用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 僅所注日期的版本適用于本標(biāo)準(zhǔn)。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本標(biāo)準(zhǔn)。 3 原理 利用植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum）對游離生物素的特異性和靈敏性，定量測定出試樣中待測物質(zhì)的含量。 在含有除待測物質(zhì)以外所有營養(yǎng)成分的培養(yǎng)基中， 微生物的生長與待測物質(zhì)含量呈線性關(guān)系，根據(jù)透光率與標(biāo)準(zhǔn)工作曲線進(jìn)行比較，即可計(jì)算出試樣中待測物質(zhì)的含量。 4 試劑和材料 除非另有規(guī)定，本方法所用試劑均為分析純，水為 GB/T 6682 規(guī)定的二級水。 4.1 菌株：植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum），ATCC 8014。 4.2 生物素（d-Biotin 或 Vitamin H）標(biāo)準(zhǔn)品（C10H16N2O3S）：純度99 %。 4.3 培養(yǎng)基 4.3.1 乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基：見附錄 A。 4.3.2 乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基：見附錄 A。 4.3.3 生物素測定用培養(yǎng)基：見附錄 A。 注：一些商品化合成培養(yǎng)基效果良好，商品化合成培養(yǎng)基按標(biāo)簽說明進(jìn)行配制。 4.4 乙醇溶液（50 %）。 4.5 硫酸溶液（3 %）：量取 3mL 硫酸加入到水中，定容至 100 mL。 4.6 氫氧化鈉溶液（0.5 mol/L）：稱取 20 g 氫氧化鈉溶于 1000 mL 水中。 4.7 氯化鈉溶液（9 g/L）：稱取 9.0 g 氯化鈉溶解于 1000 mL 水中，分裝試管，每管 10 mL。121滅菌 15 min。 4.8 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 4.8.1 生物素標(biāo)準(zhǔn)貯備液（100 g/mL）：稱取生物素標(biāo)準(zhǔn)品（4.2）用乙醇溶液（4.4）定容至生物素濃度為 100 g/mL，貯于冰箱中。 4.8.2 生物素標(biāo)準(zhǔn)中間液（1 g/mL）：吸取 1 mL 生物素標(biāo)準(zhǔn)貯備液（4.8.1），用乙醇溶液（4.4）定容至 100 mL。 4.8.3 生物素標(biāo)準(zhǔn)工作液（10 ng/mL）：吸取 1 mL 生物素標(biāo)準(zhǔn)中間液（4.8.2），用乙醇溶液（4.4）定容至 100 mL。 4.8.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液 GB 5413.192010 2 分兩個濃度， 高濃度溶液的濃度為 0.2 ng/mL； 低濃度溶液的濃度為 0. 1 ng/mL。 從工作液中 （4.8.3）吸取兩次各 5 mL，用水分別定容到 250 mL 和 500 mL。 注：所有標(biāo)準(zhǔn)溶液要儲存于冰箱內(nèi)。4.8.1、4.8.2、和 4.8.3 保存期三個月，4.8.4 臨用前配制。 5 儀器和設(shè)備 除微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)滅菌及培養(yǎng)設(shè)備外，其他設(shè)備和材料如下： 5.1 天平：感量為 0.1 mg。 5.2 pH 計(jì)：精度0.02。 5.3 分光光度計(jì)。 5.4 渦旋混合器。 5.5 離心機(jī)：轉(zhuǎn)速2000 轉(zhuǎn)/分鐘。 5.6 恒溫培養(yǎng)箱：36 1 。 5.7 冰箱：2 5 。 5.8 無菌吸管：10 mL (具 0.1 mL 刻度) 或微量移液器或吸頭。 5.9 瓶口分液器：0 mL10 mL。 5.10 錐形瓶：200 mL。 5.11 容量瓶（A 類）：100 mL，250 mL，500 mL。 5.12 單刻度移液管（A 類）：容量 5 mL。 5.13 漏斗：直徑 90 mm。 5.14 定量濾紙：直徑 90 mm。 5.15 試管：18mm180 mm。 注：玻璃儀器使用前，用活性劑（月桂磺酸鈉或家用洗滌劑加入到洗滌用水中即可）對硬玻璃測定管及其他必要的玻璃器皿進(jìn)行清洗，清洗之后在 200 干熱 2 h。 6 分析步驟 6.1 接種菌懸液的制備 6.1.1 將凍干菌株（4.1）活化后，轉(zhuǎn)接到乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基（4.3.1）中，36 1 培養(yǎng)過夜。再轉(zhuǎn)接 23 代來增強(qiáng)活力。然后再將其從固體培養(yǎng)上轉(zhuǎn)接到乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基（4.3.2）中培養(yǎng)。 6.1.2 將乳酸桿菌肉湯中的培養(yǎng)液以 2000 轉(zhuǎn)/分鐘離心 2 min3 min，傾出上清液，加入 10 mL 氯化鈉溶液 （4.7） ， 混勻， 再離心 2 min3 min， 如此清洗 3 次4 次， 吸適量該菌懸液于 10 mL 氯化鈉 （4.7）中，待測。 6.1.3 用分光光度計(jì)以氯化鈉溶液（4.7）做空白，于 550 nm 波長下測菌懸液（6.1.2）的透光率，使其透光率在 60 %80 %之間。 6.2 樣品的處理 6.2.1 干粉樣品 稱取一定量樣品（精確至 0.0001 g）于 250 mL 三角瓶中，該樣品應(yīng)含 0.2 g0.5 g 生物素。繼續(xù)6.2.3 步驟。 6.2.2 液體樣品 吸一定量的液體樣品于 250 mL 三角瓶中，該樣品應(yīng)含 0.2 g0.5 g 生物素。繼續(xù) 6.2.3 步驟。 6.2.3 樣品的提取 GB 5413.192010 3 加入硫酸溶液 （4.5） 100 mL， 121 水解 30 min， 冷卻后用氫氧化鈉溶液 （4.6） 調(diào)節(jié) pH 至 4.50.2，定量轉(zhuǎn)到 250 mL 容量瓶中，用水定容，充分混合。用濾紙過濾，棄去最初的幾毫升。吸取濾液 5 mL，加入約 20 mL 水，用氫氧化鈉溶液（4.6）調(diào) pH 為 6.80.2,定量轉(zhuǎn)到 100 mL 容量瓶中，用水定容。 6.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 按表 1 順序加入水、標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液（4.8.4）和生物素測定用培養(yǎng)基（4.3.3）于培養(yǎng)管中，一式三份。 表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 試管號 S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S8 S9 S10 水（mL） 5 5 4 3 2 1 0 2 1 0 標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液 0.1 ng/mL（mL） 0 0 1 2 3 4 5 0 0 0 標(biāo)準(zhǔn)曲線工作液 0.2 ng/mL（mL） 0 0 0 0 0 0 0 3 4 5 培養(yǎng)基（mL） 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 6.4 待測液的制作 按表 2 順序加水、樣品溶液（6.2.3）和生物素測定用培養(yǎng)基（4.3.3）于培養(yǎng)管內(nèi)，一式三份。 每份樣品需帶樣品空白試管一只，管內(nèi)分別加入5 mL待測液和5 mL培養(yǎng)基。 表2 待測液的制作 試管號 1 2 3 4 樣品空白 水（mL） 4 3 2 1 0 樣品溶液（mL） 1 2 3 4 5 培養(yǎng)基（mL） 5 5 5 5 5 6.5 滅菌 將6.3和6.4中所有的試管蓋上試管帽，放入滅菌釜內(nèi)，121 滅菌5 min（商品培養(yǎng)基按標(biāo)簽說明進(jìn)行滅菌）。 6.6 接種 從滅菌釜內(nèi)取出試管，將試管迅速冷卻至30 以下。將接種菌懸液（6.1.2）用滴管或移液器向上述試管中各滴加一滴（約50 L），其中標(biāo)準(zhǔn)曲線管中未接種空白S1和樣品空白除外。 6.7 培養(yǎng) 將試管放入培養(yǎng)箱內(nèi)，36 1 培養(yǎng)19 h20 h。 6.8 測定 對每支試管進(jìn)行視覺檢查，接種空白試管 S1 內(nèi)培養(yǎng)液應(yīng)是澄清的，如果出現(xiàn)渾濁，則結(jié)果無效。 6.8.1 以接種空白試管 S1 做對照，測定最高濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線試管的吸光度，兩小時后重新測定。兩次結(jié)果透光率差值若小于 2 %，則取出全部檢驗(yàn)管測其吸光度 A。 6.8.2 以接種空白試管 S2 為空白，調(diào)節(jié)吸光度為 0，依次讀出其他每支試管的吸光度 A，樣品空白的吸光度 A 一并讀出。 6.8.3 用渦旋混合器充分混合每一支試管（也可以加一滴消泡劑）后，立即將培養(yǎng)液移入比色皿內(nèi)進(jìn)行測定，波長為 550 nm，待讀數(shù)穩(wěn)定 30 s 后，讀出吸光度 A，每支試管穩(wěn)定時間要相同。以生物素標(biāo)準(zhǔn)品的含量為橫坐標(biāo)，吸光度 A 為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線。 6.8.4 待測液培養(yǎng)試管中，樣品空白試管吸光度應(yīng)小于 0.05。若樣品空白試管吸光度大于 0.02，加入待測液 1 mL 的試管的吸光度值要減去其樣品空白試管吸光度值的 1/5， 加入待測液 2 mL 的試管的吸光GB 5413.192010 4 度值要減去其樣品空白試管吸光度值的 2/5，以此類推，作為計(jì)算結(jié)果的依據(jù)。根據(jù)待測液的吸光度 A，從標(biāo)準(zhǔn)曲線中查得該待測液中生物素的濃度， 再根據(jù)稀釋因子和稱樣量計(jì)算出試樣中生物素的含量。 吸光度值超出標(biāo)準(zhǔn)曲線管 S3S10 范圍的試樣管要舍去。 6.8.5 對每個編號的待測液試管，用每支試管的吸光度值計(jì)算每毫升該編號待測液生物素的含量，并計(jì)算該編號待測液的生物素含量平均值，每支試管測得的該濃度不得超過該平均值的15%，超過者要舍去。如果符合該要求的管數(shù)少于所有四個編號待測液總管數(shù)的 2/3，需要重新檢驗(yàn)。如果符合該要求的管數(shù)大于等于原來管數(shù)的 2/3， 重新計(jì)算每一編號的有效試樣管中每毫升測定液生物素含量的平均值，以此平均值計(jì)算全部編號試樣管的總平均值 Cx，用于計(jì)算試樣中的生物素含量。 7 分析結(jié)果的表述 試樣中生物素的含量按公式 (1) 計(jì)算： 1001000=fmCXx (1) 式中： X試樣中生物素的含量，單位為微克每百克（g/100 g） ； Cx6.8.5 中計(jì)算所得的總平均值，單位為納克（ng） ； m試樣的質(zhì)量，單位為克（g） ； f稀釋倍數(shù)。 以重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留兩位有效數(shù)字。 8 精密度 在重復(fù)性條件下獲得的兩次獨(dú)立測定結(jié)果的絕對差值不得超過算術(shù)平均值的 10 %。 9 其他 本標(biāo)準(zhǔn)檢出限為 20.0 g/kg。 GB 5413.192010 5 附錄 A （規(guī)范性附錄） 培養(yǎng)基和試劑 A.1 乳酸桿菌瓊脂培養(yǎng)基 A.1.1 成分 胨化乳 15.0 g，酵母浸膏 5.0 g，葡萄糖 10.0 g，番茄汁 100 mL，磷酸二氫鉀 2.0 g，聚山梨糖單油酸酯 1.0 g，加水至 1000 mL，調(diào)節(jié) pH 至 6.80.2（25 5 ） 。 A.1.2 制法 在 A.1.1 中加入 10.0 g 瓊脂，加熱煮沸，使瓊脂溶化?；旌暇鶆蚝蠓盅b試管，每管 10 mL。121 高壓滅菌 15 min，備用。 A.2 乳酸桿菌肉湯培養(yǎng)基 A.2.1 成分 胨化乳 15.0 g，酵母浸膏 5.0 g，葡萄糖 10.0 g，番茄汁 100 mL，磷酸二氫鉀 2.0 g，聚山梨糖單油酸酯 1.0 g，加水至 1000 mL，調(diào)節(jié) pH 至 6.8 0.2（25 5 ） 。 A.2.2 制法 將 A.2.1 成分加熱煮沸，混合均勻后分裝試管，每管 10 mL。121 高壓滅菌 15 min。 A.3 生物素測定用培養(yǎng)基 A.3.1 成分 維生素測定用酪蛋白氨基酸 12.0 g，葡萄糖 40.0 g，乙酸鈉 20.0 g，L-胱氨酸 0.2 g，DL-色氨酸 0.