醫(yī)學(xué)生畢業(yè)答辯幻燈片樣板.ppt

ING 4和FP 248基因檢測(cè)在白血病和消化道腫瘤中的臨床意義,學(xué)生 李繼剛 導(dǎo)師 許文榮 江蘇大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)與醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院 2008年06月06日,一 研究背景,1. ING 4基因 (1) ING 4基因的生物學(xué)特性及功能,p13.31,ING 4，8個(gè)外顯子,誘導(dǎo)P21表達(dá)上調(diào),（2） ING 4的變異與腫瘤發(fā)生的關(guān)系,神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株,肺 癌 細(xì) 胞 株,乳 腺 癌 細(xì) 胞 株,結(jié)直腸癌細(xì)胞株,ING 4 變異,白血??？,健康人心、腦、肝、肺、腎組織,ING4-V1:30%35% ING4-V2:42%50%,成人及胎兒心、腦、肝、肺、腎 腫瘤組織,白血??？ 消化道腫瘤？,本研究檢測(cè)白血病患者骨髓 中主要剪接方式,(3) ING 4 在多種腫瘤組織中表達(dá)下調(diào),ING 4,神經(jīng)膠質(zhì)瘤,頭頸部鱗狀細(xì)胞癌,肺癌,消化道腫瘤 白血病,？,2.原癌基因FP 248,8q24.3，F(xiàn)P248，3個(gè)外顯子,8,與肝癌有關(guān),FP 248蛋白質(zhì)， 208aa,其他腫瘤 ？,二 研究?jī)?nèi)容和研究意義,1.研究目的 建立檢測(cè)ING 4和FP 248基因的real time RT-PCR和nested RT-PCR方法，并分析ING 4和FP 248基因?qū)Π籽『拖滥[瘤的診斷意義。,3. 研究?jī)?nèi)容,建立采用RT-PCR和real-time RT-PCR檢 測(cè)ING 4和FP 248 mRNA表達(dá)的方法,研究ING 4 和FP 248在多種腫 瘤細(xì)胞株中的表達(dá)水平,ING 4和FP 248基因在 白血病中的臨床意義,ING 4 和FP 248基因在消化道 腫瘤中的臨床意義,3.研究意義 為白血病和消化道腫瘤的診斷和預(yù)后提供新的更為便捷的方 法和指 標(biāo)，也為這些疾病的基因治療提供了兩個(gè)靶基因。,注:A：ING 4 標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線；B：ING 4標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增產(chǎn)物融解曲線，C：ING 4標(biāo)準(zhǔn)曲線 . 圖1. ING 4 標(biāo)準(zhǔn)品,三 方法建立,1.成功建立了采用real-time RT-PCR檢測(cè)ING 4和FP 248基因表達(dá)的方法,注：A：FP 248標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線； B：FP 248標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增產(chǎn)物融解曲線 C：FP 248標(biāo)準(zhǔn)曲線. 圖2. FP 248 標(biāo)準(zhǔn)品,注： A： GAPDH 標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增產(chǎn)物融解曲線； B：GAPDH標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線； C：GAPDH標(biāo)準(zhǔn)曲線。 圖3. GAPDH標(biāo)準(zhǔn)品,2.成功建立了采用Western 印跡技術(shù)檢測(cè)ING 4蛋白質(zhì)表達(dá)的方法； 3.成功建立了采用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測(cè)組織中ING 4蛋白質(zhì)表達(dá)的方法。,表1.real-time RT-PCR關(guān)鍵參數(shù),1.實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì),四、腫瘤細(xì)胞株中ING4 和FP 248基因 表達(dá)檢測(cè),腫瘤細(xì)胞,抽提總RNA,檢測(cè)ING 4 mRNA,檢測(cè)FP248 mRNA,注： A.細(xì)胞株中ING 4基因及部分標(biāo)準(zhǔn)品擴(kuò)增曲線 標(biāo)準(zhǔn)品濃度：102copies/l和103copies/l及 108copies/l.,2.研究結(jié)果,A,B. real-time RT-PCR測(cè)定結(jié)果 1：SW480；2：SGC；3：U937；4：hBM-MSC.,B,C. RT-PCR測(cè)定結(jié)果 1：SW480；2：SGC；3：U937；4：hBM-MSC.,C,圖4. FP248 在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá),注： A.real-time RT-PCR 擴(kuò)增曲線。B. real-time RT-PCR 檢測(cè)FP248 mRNA 實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。 1：U937；2：SGC； 3：hBM-MSC；4：PLA801-95D；5：A549。C. RT-PCR檢測(cè) FP 248 mRNA b：blank；1： U937；2：SGC；3：hBM-MSC；4：PLA801-95D；5：A549；6：PC3；7：SW480；M：DNA marker (100bps DNA Ladder)。 圖5. FP248 在腫瘤細(xì)胞中的表達(dá),A,B,C,五、 ING 4和FP 248基因檢測(cè)在白血 病中的表達(dá)及臨床意義,表.骨髓標(biāo)本和標(biāo)本資料,注：以上標(biāo)本由江蘇大學(xué)附屬醫(yī)院提供,骨髓和外周血,分離單個(gè)核細(xì)胞,抽提總RNA,逆轉(zhuǎn)錄并檢測(cè) ING 4 基因表達(dá),檢測(cè)FP 248 mRNA,分析臨床意義,分析臨床意義,抽提DNA,測(cè)序,測(cè)序,1.研究方案,注：I.部分骨髓及外周血標(biāo)本中ING4基因擴(kuò)增曲線 II：白血病患者骨髓中ING 4表達(dá)水平 1：健康對(duì)照； 2：缺鐵性貧血患者骨髓；3：免疫性血小板減少患者骨髓；4：ALL患者骨髓；5：CLL患者骨髓； 6：CML患者骨髓；7：CML急性變患者骨髓；8：M2骨髓；9： MDS骨髓。III：白血患者外 周血ING 4 1：健康對(duì)照；2：M2； 3：AML；4：CML；5：ALL。IV： Western 印跡檢測(cè)結(jié)果 A1：缺鐵性貧血； A2：AML；B1：缺鐵性貧血；B2：CML；C1：缺鐵性貧血；C2：ALL。 圖6. ING 4基因在白血病患者骨髓及外周血中的表達(dá)水平,I,II,III,2.研究結(jié)果,IV,注：A,B 和C. ING4基因cDNA測(cè)序部分圖譜 框內(nèi)部 分 為第四和第五外顯子接頭處易缺失序列。 A：AML, n=4; B：CML，n=5；C：ALL，n5。,A,B,C,D,圖7. ALL患者骨髓中ING4基因組DNA測(cè)序部分圖譜,D. ALL患者骨髓中ING4基因組DNA測(cè)序部分圖譜 框內(nèi) 部分為第四和第五外顯子接頭處易缺失序列，左為基因組DNA第四外顯子部分序列，右為第五外顯子部分序列，n=5。,注：I.部分白血病標(biāo)本及對(duì)照組標(biāo)本中FP 248定量擴(kuò)增曲線. II. real-time RT- PCR測(cè)定結(jié)果 1：缺鐵性貧血和健 康人骨髓； 2：CML患者骨髓；3.兩例女性CML患者急性變后骨髓；4：兩例女性CML患者急性變骨髓，HA 和DAT化 療2周后； 5：ALL患者骨髓； 6： M2患者骨髓；7：M3患者骨髓；8：5例M2外周血；9：健康體檢者外周血。 III.RT-PCR測(cè)定結(jié)果 A.白血病患者骨髓和外周血中FP 248 mRNA 表達(dá) 1：健康體檢者外周血；2：M2外周血； 3：CML患者骨髓；4：CML急性變患者骨髓；5：ALL患者骨髓；6：M2患者骨髓；7：M3患者骨髓；8-12： 缺鐵性貧血患者骨髓；13：blank；M：DNA marker（DL2000）。 B. ALL患者外周血中FP 248 mRNA表達(dá) 1：健康體檢 者外周血；24：ALL患者外周血；M：DNA marker（DL2000）。C. ALL患者骨髓中FP 248 mRNA表達(dá) 1:blank； 2：ALL骨髓；3：缺鐵性貧血患者骨髓；M：DNA marker（DL2000）。 圖8. 白血病骨髓或外周血中FP 248 mRNA的表達(dá),I,II,表2.白血病標(biāo)本中FP 248 mRNA陽(yáng)性率,III,P0.05,六、ING 4和FP 248基因表達(dá)檢測(cè)在 消化道腫瘤中的臨床意義,表3.消化道腫瘤病例資料,注：示采集手術(shù)前外周血和手術(shù)1周后外周血，健康體檢者外周血資料同第五部分,1.研究方案,胃癌 結(jié)腸癌 直腸癌,組織,檢測(cè)ING4蛋白質(zhì),檢測(cè)ING4 mRNA,外周血,檢測(cè)FP248 mRNA,分 析 臨 床 意 義,檢測(cè)FP248 mRNA,檢測(cè)ING4 mRNA,食道癌組織,A,B,C,D,a,b,注：A .ING 4基因擴(kuò)增曲線 B.ING 4基因相對(duì)定量結(jié)果 1.結(jié)腸癌；2和3為直腸癌；416為胃癌。 C. Western 印跡檢測(cè)ING 4蛋白表達(dá)水平 p：陽(yáng)性對(duì)照；a：胃癌；b.結(jié)腸癌；c：直腸癌；d：食道癌； e：食道癌； 1表示癌旁組織，2表示癌組織。 D.免疫組化技術(shù)檢測(cè) ING 4在胃癌組織中的表 達(dá) （100） a.胃癌旁組織；b.胃癌組織 圖9. ING 4消化道腫瘤組織中表達(dá),2. 研究結(jié)果,注：A.胃癌結(jié)腸癌直腸癌中各分期中ING 4 基因表達(dá) 未見(jiàn)顯著性差異(P0.05)。 B和C. ING4表達(dá)水 平與組織分化程度的關(guān)系 組織分化水平越低，ING 4表達(dá)越低（ P0.05) . D. ING 4表達(dá)水平與 患者預(yù)后的關(guān)系 2年內(nèi)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的患者表達(dá)水平顯著低于未 復(fù)發(fā)的患者（ P0.05) 。 圖10. 消化道腫瘤組織中ING 4基因表達(dá)水平與消化道腫瘤分期、組織分化程度以及患者預(yù)后的關(guān)系,表4.消化道腫瘤分期及組織分化程度,分期方法：Robson 分期法,高分化,中分化,中低分化,低分化,未復(fù)發(fā),復(fù)發(fā),注. I.部分消化道組織中FP248基因擴(kuò)增曲線 IIreal-time定量PCR結(jié)果 a. 胃癌 ，b. 結(jié)腸癌，c. 直腸 癌 。1：癌旁組織； 2：癌組織；3：癌旁淋巴結(jié)；III.RTPCR結(jié)果 1：結(jié)腸癌；2：直腸癌； 38：胃癌；9：食道癌；N：癌旁組織；C：癌組織；L：淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移灶；B：blank；S：標(biāo)準(zhǔn) 品； M：DNA marker (100bps DNA Ladder)。 圖11. real-time定量PCR檢測(cè)FP 248 在 消化道腫瘤中的表達(dá),I,II,III,表5. 癌組織和淋巴結(jié)組織中FP 248 mRNA陽(yáng)性率,注：A.胃癌、結(jié)腸癌和直腸癌中FP 248表達(dá)與病理分期之間的關(guān)系 未見(jiàn)顯著性差異(P0.05). B和C：FP 248 mRNA表達(dá)水平與組織分化程度的關(guān)系 分化程度越低，F(xiàn)P 248 mRNA表達(dá)水平越高(P0.05)。D. FP 248 基因表達(dá)水平與患者預(yù)后的關(guān)系 2年內(nèi)復(fù)發(fā)的患者FP 248基因表達(dá)水平顯著于未復(fù)發(fā)者(P0.05)。 圖12.消化道腫瘤組織中FP 248 基因表達(dá)水平與消化道腫瘤分期、組織分化程度以及患者預(yù)后的關(guān)系,表4.消化道腫瘤分期及組織分化程度,分期方法：Robson 分期法,高分化,中分化,中低分化,低分化,未復(fù)發(fā),復(fù)發(fā),注：A. RT-PCR。B. nested RT-PCR。blank：空白對(duì)照。a、b和c：胃癌; d和e：結(jié)腸癌；f和g：直腸癌；h：marker，DL2000；i：健康體檢。1為手術(shù)前，2為手術(shù)后。 圖13. ING4基因在消化道腫瘤患者外周血單個(gè)盒細(xì)胞中的表達(dá),注：a、b、c為癌組織陽(yáng)性的胃癌患者，d、e、f為 癌組織陽(yáng)性的結(jié)腸癌患者，g、h為癌組織陽(yáng)性的直腸 癌患者，M為 DNA marker (DL2000)。 圖14. nested RT-PCR檢測(cè)消化道腫瘤患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中FP 248的表達(dá),表6.手術(shù)前后外周血單個(gè)核細(xì)胞中FP 248 mRNA陽(yáng)性率,表7. 外周血單個(gè)核細(xì)胞中FP 248 mRNA陽(yáng)性率與預(yù)后的關(guān)系,與健康對(duì)照組相比，P0.05，2檢驗(yàn),與手術(shù)一周后為陰性的患者相比，P0.05，2檢驗(yàn),七.結(jié)論,ING4基因表達(dá)下調(diào)和FP248基因與胃癌等消化道腫瘤和白血病的發(fā)生發(fā)展可能存在相關(guān)性，檢測(cè)這兩個(gè)基因的表達(dá)有助于消化道腫瘤的診斷和預(yù)后。 采用nested RT-PCR檢測(cè)外周血單個(gè)核細(xì)胞中FP248基因是篩選消化道腫瘤的好方法。,致謝,特別感謝許文榮教授的悉心指導(dǎo)！ 衷心感謝錢(qián)暉老師和朱偉老師的關(guān)心和幫助！ 感謝各位專家的百忙之中指導(dǎo)本人答辯！ 感謝我的同學(xué)和師弟師妹們的幫助和支持！,發(fā)表文章,1. 李繼剛， 許文榮， 錢(qián) 暉，朱 偉 ，王 勝，步雪峰，張 蕾 蕾，徐 靜， 司煜安，陳 忠，周忠海，周洪興，施曉鳳. fp 248 mRNA在白血病和腫瘤中的診斷意義. 臨床檢驗(yàn)雜志， 2008 年第3期. 2.Jigang Li, We