GB5413.9-2010食品安全國家標準嬰幼兒食品和乳品中維生素A、D、E的測定.pdf

中華人民共和國國家標準中華人民共和國國家標準GB 5413.92010中 華 人 民 共 和 國 衛(wèi) 生 部中 華 人 民 共 和 國 衛(wèi) 生 部 發(fā)布 2010-03-26 發(fā)布 2010-06-01 實施食品安全國家標準 嬰幼兒食品和乳品中維生素 A、D、E 的測定 National food safety standard Determination of vitamin A, D, E in foods for infants and young children, milk and milk products GB 5413.92010 I 前 言 本標準代替GB/T 5413.9-1997嬰幼兒配方食品和乳粉 維生素A、D、E的測定。 本標準與GB/T 5413.9-1997相比，主要變化如下： 抗氧化劑由原來的焦性沒食子酸改為抗壞血酸； 將處理方法中的加熱回流改為恒溫皂化操作； 增加了標準溶液的校正； 將原有的單點定量改為標準曲線法； 增加了維生素D回收率的測定； 將計算公式進行修改。 本標準附錄A為規(guī)范性附錄，附錄B為資料性附錄。 本標準所代替標準的歷次版本發(fā)布情況為： GB 5413-1985、GB/T 5413.9-1997。 GB 5413.92010 1 食品安全國家標準 嬰幼兒食品和乳品中維生素 A、D、E 的測定 1 范圍 本標準規(guī)定了嬰幼兒食品和乳品中維生素A、D、E的測定方法。 本標準適用于嬰幼兒食品和乳品中維生素A、D、E的測定。 2 規(guī)范性引用文件 本標準中引用的文件對于本標準的應用是必不可少的。 凡是注日期的引用文件， 僅所注日期的版本適用于本標準。凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改單）適用于本標準。 3 原理 試樣皂化后，經(jīng)石油醚萃取，維生素A、E用反相色譜法分離，外標法定量；維生素D用正相色譜法凈化后，反相色譜法分離，外標法定量。 4 試劑和材料 除非另有規(guī)定，本方法所用試劑均為分析純或以上規(guī)格，水為GB/T 6682規(guī)定的一級水。 4.1 -淀粉酶：酶活力1.5 U/mg。 4.2 無水硫酸鈉。 4.3 異丙醇：色譜純。 4.4 乙醇：色譜純。 4.5 氫氧化鉀水溶液：稱取固體氫氧化鉀 250 g，加入 200 mL 水溶解。 4.6 石油醚：沸程 30 60 。 4.7 甲醇：色譜純。 4.8 正己烷：色譜純。 4.9 環(huán)己烷：色譜純。 4.10 維生素 C 的乙醇溶液（15 g/L）。 4.11 維生素 A、D、E 標準溶液 4.11.1 維生素 A 標準儲備液（視黃醇）（100 g/mL）：精確稱取 10 mg 的維生素 A 標準品，用乙醇（4.4）溶解并定容于 100 mL 棕色容量瓶中。 GB 5413.92010 2 4.11.2 維生素 E 標準儲備液（-生育酚）（500 g/mL）：精確稱取 50 mg 的維生素 E 標準品，用乙醇（4.4）溶解并定容于 100 mL 棕色容量瓶中。 4.11.3 維生素 D2標準儲備液（100 g/mL）：精確稱取 10 mg 的維生素 D2標準品，用乙醇（4.4）溶解并定容于 100 mL 棕色容量瓶中。 4.11.4 維生素 D3標準儲備液（100 g/mL）：精確稱取 10 mg 的維生素 D3標準品，用乙醇（4.4）溶解并定容于 100 mL 棕色容量瓶中。 注：維生素A、D、E標準儲備液均須-10以下避光儲存。標準工作液臨用前配制。標準儲備溶液用前需校正，見附錄A。 5 儀器和設備 5.1 高效液相色譜儀，帶紫外檢測器。 5.2 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器。 5.3 恒溫磁力攪拌器：20 80 。 5.4 氮吹儀。 5.5 離心機：轉(zhuǎn)速5000 轉(zhuǎn)/分鐘。 5.6 培養(yǎng)箱：60 2 。 5.7 天平：感量為 0.1 mg。 6 分析步驟 6.1 試樣處理 6.1.1 含淀粉的試樣 稱取混合均勻的固體試樣約5 g或液體試樣約50 g（精確到0.1 mg）于250 mL三角瓶中，加入l g -淀粉酶（4.1），固體試樣需用約50 mL 45 50 的水使其溶解，混合均勻后充氮，蓋上瓶塞，置于60 2 培養(yǎng)箱（5.6）內(nèi)培養(yǎng)30 min。 6.1.2 不含淀粉的試樣 稱取混合均勻的固體試樣約10 g或液體試樣約50 g（精確到0.1 mg）于250 mL三角瓶中，固體試樣需用約50 mL 45 50 水使其溶解，混合均勻。 6.2 測定維生素 D 的試樣需要同時做回收率實驗。 6.3 待測液的制備 6.3.1 皂化：于上述處理的試樣溶液中加入約 100 mL 維生素 C 的乙醇溶液（4.10），充分混勻后加25 mL 氫氧化鉀水溶液（4.5）混勻，放入磁力攪拌棒，充氮排出空氣，蓋上膠塞。1000 mL 的燒杯中加入約 300 mL 的水，將燒杯放在恒溫磁力攪拌器（5.3）上，當水溫控制在 53 2 時，將三角瓶放入燒杯中，磁力攪拌皂化約 45 min 后，取出立刻冷卻到室溫。 6.3.2 提?。河蒙倭康乃畬⒃砘喝哭D(zhuǎn)入 500 mL 分液漏斗中，加入 100 mL 石油醚（4.6），輕輕搖動，排氣后蓋好瓶塞，室溫下振蕩約 10 min 后靜置分層，將水相轉(zhuǎn)入另一 500 mL 分液漏斗中，按上述方法進行第二次萃取。合并醚液，用水洗至近中性。醚液通過無水硫酸鈉過濾脫水，濾液收入 500 mLGB 5413.92010 3 圓底燒瓶中，于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上在 40 2 充氮條件下蒸至近干（絕不允許蒸干）。殘渣用石油醚轉(zhuǎn)移至 10 mL 容量瓶中，定容。 6.3.3 從上述容量瓶中準確移取 2.0 mL 石油醚溶液放入試管 A 中，再準確移取 7.0 mL 石油醚溶液放入另一試管 B 中，將試管置于 40 2 的氮吹儀（5.4）中，將試管 A 和 B 中的石油醚吹干。向試管A 中加 5.0 mL 甲醇（4.7），振蕩溶解殘渣。向試管 B 中加 2.0 mL 正己烷（4.8），振蕩溶解殘渣。再將試管 A 和試管 B 以不低于 5000 轉(zhuǎn)/分鐘的速度離心 10 min，取出靜置至室溫后待測。A 管用來測定維生素 A、E，B 管用來測定維生素 D。 6.4 測定 6.4.1 維生素 A、E 的測定 6.4.1.1 色譜參考條件 色譜柱：C18柱，250 mm 4.6 mm，5 m，或具同等性能的色譜柱。 流動相：甲醇（4.7）。 流速：1.0 mL/min。 檢測波長：維生素A：325 nm；維生素E：294 nm。 柱溫：35 1 。 進樣量：20 L。 6.4.1.2 維生素 A、E 標準曲線的繪制 分別準確吸取維生素 A 標準儲備液（4.11.1）0.50 mL、1.00 mL、1.50 mL、2.00 mL、2.50 mL 于50 mL 棕色容量瓶中，用乙醇定容至刻度混勻。此標準系列工作液濃度分別為 1.00 g/mL、2.00 g/mL、3.00 g/mL、4.00 g/mL、5.00 g/mL。 分別準確吸取維生素 E 標準儲備液（4.11.2）1.00 mL、2.00 mL、3.00 mL、4.00 mL、5.00 mL 于50 mL 棕色容量瓶中，用乙醇定容至刻度混勻。此標準系列工作液濃度分別為 10.0 g/mL、20.0 g/mL、30.0 g/mL、40.0 g/mL、50.0 g/mL。 分別將維生素 A、E 標準工作液注入液相色譜儀中（色譜圖參見附錄 B），得到峰高(或峰面積)。以峰高(或峰面積)為縱坐標，以維生素 A、E 標準工作液濃度為橫坐標分別繪制維生素 A、E 標準曲線。 6.4.1.3 維生素 A、E 試樣的測定 將試液（6.3.3中A管）注入液相色譜儀中，得到峰高(或峰面積)，根據(jù)各自標準曲線得到待測溶液中維生素A、E的濃度。 6.4.2 維生素 D 的測定 6.4.2.1 維生素 D 待測液的凈化 6.4.2.1.1 色譜參考條件。 色譜柱：硅膠柱，150 mm 4.6 mm，或具同等性能的色譜柱。 流動相：環(huán)己烷（4.9）與正己烷（4.8）按體積比1：1混合，并按體積分數(shù)0.8 %加入異丙醇（4.3）。 流速：1 mL/min。 波長：264 nm。 柱溫：35 1 。 進樣體積：500 L。 6.4.2.1.2 取約0.5 mL維生素D標準儲備液于10 mL具塞試管中，在40 2 的氮吹儀（5.4）上吹干。殘渣用5 mL正己烷振蕩溶解。取該溶液50 L注入液相色譜儀中測定，確定維生素D保留時間。然后將500 L待測液（6.3.3中B管）注入液相色譜儀中，根據(jù)維生素D標準溶液保留時間收集維生素D餾分于試管C中。將試管C置于40 2 條件下的氮吹儀中吹干，取出準確加入1.0 mL甲醇（4.7），殘渣振蕩溶解，即為維生素D測定液。 GB 5413.92010 4 6.4.2.2 維生素 D 測定液的測定 6.4.2.2.1 參考色譜條件 色譜柱：C18柱，250 mm 4.6 mm，5m，或具同等性能的色譜柱。 流動相：甲醇（4.7）。 流速：1 mL/min。 檢測波長：264 nm。 柱溫：35 1 。 進樣量：100 L。 6.4.2.2.2 標準曲線的繪制 分別準確吸取維生素 D2（或 D3） 標準儲備液 （4.11.3、 4.11.4） 0.20 mL、 0.40 mL、 0.60 mL、 0.80 mL、1.00 mL 于 100 棕色容量瓶中，用乙醇定容至刻度混勻。此標準系列工作液濃度分別為 0.200 g/mL、0.400 g/mL、0.600 g/mL、0.800 g/mL、1.000 g/mL。 分別將維生素 D2（或 D3）標準工作液注入液相色譜儀中，得到峰高（或峰面積)，參見附錄 B。以峰高(或峰面積)為縱坐標，以維生素 D2（或 D3）標準工作液濃度為橫坐標分別繪制標準曲線。 6.4.2.2.3 維生素 D 試樣的測定 吸取維生素D測定液（6.4.2.1中C管）100 L注入液相色譜儀中（色譜圖參見附錄B），得到峰高（或峰面積），根據(jù)標準曲線得到維生素D測定液中維生素D2（或D3）的濃度。 維生素 D 回收率測定結(jié)果記為回收率校正因子 f，代入測定結(jié)果計算公式（2），對維生素 D 含量測定結(jié)果進行校正。 7 分析結(jié)果的表述 7.1 維生素 A 含量的計算 維生素 A 含量按（1）計算： mcXs10052/10= （1） 式中： X試樣中維生素A的含量，單位為微克每百克（g/100 g） ； cs 從標準曲線得到的維生素 A 待測液的濃度，單位為微克每毫升（g/mL） ； m 試樣的質(zhì)量，單位為克（g）。 注：1 g 視黃醇 = 3.33 IU 維生素 A。 以重復性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留三位有效數(shù)字。 7.2 維生素 D 含量的計算 維生素 D 含量按（2）計算： fmcXs=100227/10（2） 式中： X試樣中維生素D2（或D3）的含量，單位為微克每百克（g/100 g） ； cs從標線得到的維生素 D2（或 D3）待測液的濃度，單位為微克每毫升（g/mL） ； m 試樣的質(zhì)量，單位為克（g） ； GB 5413.92010 5 f 回收率校正因子。 注： 試樣中維生素 D 的含量以維生素 D2和 D3的含量總和計。 以重復性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留三位有效數(shù)字。 7.3 維生素 E 含量 維生素 E 含量按（3）計算： 100010052/10=mcXs（3） 式中： X試樣中維生素E（-生育酚）的含量，單位為毫克每百克（ mg/100 g） ； cs從標準曲線得到的維生素 E 待測液的濃度，單位為微克每毫升（g/mL） ； m試樣的質(zhì)量，單位為克（g） 。 以重復性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的算術(shù)平均值表示，結(jié)果保留三位有效數(shù)字。 8 精密度 在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結(jié)果的絕對差值，維生素A、E不得超過算術(shù)平均值的5%，維生素D不得超過算術(shù)平均值的10 %。 9 其他 本標準檢出限：維生素 A 為 1 g/100 g、維生素 E 為 10.00 g/100 g、維生素 D 為 0.20 g/100 g。 GB 5413.92010 6 附錄 A （規(guī)范性附錄） 標準溶液濃度校正方法 維生素A、D、E標準儲備液配制后需要進行校正，具體操作如下： 分別取維生素A、D、E標準儲備液若干微升，分別注入至含有3.00 mL乙醇的比色皿中，根據(jù)給定波長測定各維生素的吸光值，按表A.1給定的條件進行測定，通過下列公式計算出該維生素的濃度。 表A.1 各維生素吸光值的測定條件 標準品 加入標準儲備液的量 （L）比吸光系數(shù)%1cmE 波長 （nm） 視黃醇（維生素A） V 1835 325 -生育酚（維生素E） V 71 294 麥角鈣化甾醇（維生素D2） V 485 264 膽鈣化醇（維生素D3） V 462 264 濃度計算按式(4)： C =EA31000.31001V(4) 式中： C 維生素A、D、E濃度，單位為克每毫升（g/mL）； A維生素A、D、E的平均紫外吸光值； V加入標準儲備液的量，單位為微升（L）； EA、D、E維生素1 %比色光系數(shù)； 31000. 3V標準儲備液稀釋倍數(shù)。 GB 5413.92010 7 附錄 B （資料性附錄） 標準品液相色譜圖 B.1 維生素 A、E、D3、D2標準品液相色譜圖 維生素 A、E、D3、D2標準品液相色譜圖見圖 B.1圖 B.4。 AU0.0000.0050.0100.0150.0200.0250.030分鐘1.002.003.004.005.006.007.008.009.0010.0011.0012.0013.001