食品中有害有毒物質.ppt

第七章 食品中有害有毒物質,食品中的有毒有害物質：,7.1 農(nóng)藥,7.1.1農(nóng)藥殘留概述 農(nóng)藥殘留物是指由于噴施農(nóng)藥后存留在環(huán)境和農(nóng)產(chǎn)品、食品、飼料、藥材中的農(nóng)藥及其降解代謝產(chǎn)物、雜質，還包括環(huán)境背景中存有的污染或持久性農(nóng)藥的殘留物再次在商品中行成的殘留。 農(nóng)藥殘留物量是指農(nóng)藥本體物及其代謝物的殘留量的總和，并構成不同程度的毒性。,農(nóng)藥的殘留毒性（殘毒）：殘留農(nóng)藥在食物上達到一定的濃度（即殘留量）后，人或其它高等動物長期進食這些食物，就會使農(nóng)藥在體內(nèi)積累起來，引起慢性中毒。 農(nóng)藥的殘毒的三個來源：施用農(nóng)藥后藥劑對作物的直接污染；作物對污染環(huán)境中農(nóng)藥的吸收；生物富集與食物鏈。 農(nóng)藥的殘毒所造成的污染是多方面的。 在農(nóng)藥殘留的分析過程中，分離技術往往占主導地位。由于各種色譜檢測器的選擇性，針對不同類型的有機化合物常需要不同的前處理技術。,7.1.2 農(nóng)藥的分類,根據(jù)防治對象的不同，常將防治害蟲的農(nóng)藥稱為殺蟲劑，防治紅蜘蛛的稱為殺螨劑，防治作物病菌的稱為殺菌劑，防治雜草的稱為除草劑，防治鼠類的稱為殺鼠劑。 根據(jù)化學組成和結構可分為無機農(nóng)藥、有機農(nóng)藥（例如有機氯、有機磷、有機砷、有機氟等）。 主要介紹有機氯殺蟲劑、有機磷殺蟲劑、擬除蟲菊酯殺蟲劑的殘留分析技術。,7.1.3 有機氯殺蟲劑的殘留分析 有機氯農(nóng)藥（Organochlorine pesticides, OCPs)是具有殺蟲活性的氯代烴的總稱。 OCPs分為三種類型：六六六； DDT及其類似物；環(huán)戊二烯衍生物。這三類不同的氯代烴均為神經(jīng)毒性物質，正常環(huán)境下不易分解。易通過食物鏈在生物體脂肪中富集和積累。 從20世紀70年代開始，許多工業(yè)化國家相繼限用或禁用DDT、六六六及狄氏劑。,有機氯殺蟲劑的殘留分析方法在農(nóng)藥殘留中是研究最早的。 在有機氯農(nóng)藥（OCPs）分析領域最為廣泛使用的檢測技術是氣相色譜/電子捕獲檢測器（GC-ECD），它具有靈敏度高、分離效果好、定量準確等特點，是一種經(jīng)典的分析方法。色譜柱通常是弱極性至中級性柱，檢測器一般用ECD。,DDT 1874年Baeyer首次合成。 Mller發(fā)現(xiàn)它的殺蟲作用，獲瑞士專利，并于1948年獲諾貝爾醫(yī)學獎。 對溫血動物急毒性低，對大白鼠的口服急性毒性LD50為250-500mg/kg，但DDT以及主要的代謝物DDE容易在動物脂肪中積累。,六六六（BHC） 六六六的工業(yè)品是多種異構體的混合物，其活性組分-BHC僅占15%左右，其余均為無效組分。 廣譜性殺蟲劑。 -BHC積累體內(nèi)的危險性很小，對大白鼠口服急性毒性LD50為76-200mg/kg，積累在動物脂肪、奶中的BHC能很快排出體外。但工業(yè)品中-BHC積累的可能性和慢性中毒性很大。,-BHC,艾氏劑 艾氏劑具有較高的蒸氣壓，可以以顆粒劑的形式作為土壤殺蟲劑。大鼠口服急性毒性LD50為67mg/kg，由于它在血液中有較高的溶解度，因此容易擴散到所有的組織中，特別是脂肪組織。,有機氯殺蟲劑殘留的分析方法,有關有機氯殺蟲劑的殘留分析方法在農(nóng)藥殘留中是研究最早的，對于僅有BHC和DDT農(nóng)藥的前處理可用濃硫酸磺化法處理，對同時含有艾氏劑、狄氏劑等多種有機氯殺蟲劑時，一般采用氟羅里硅土柱凈化。選用的色譜柱通常是弱極性至中極性柱。檢測器一般用ECD和MSD。,水果、蔬菜中多種有機氯殘留農(nóng)藥的毛細管氣相色譜測定方法： 樣品的提取與凈化 水果、蔬菜類樣品置于組織搗碎機中高速搗碎，作為試驗樣品。稱取樣品20g于250ml具塞三角燒瓶中，加入100ml石油醚丙酮（4：1），振蕩30min。用布氏漏斗抽濾，以適量石油醚洗滌殘渣，濾液合并于500ml分液漏斗中，用水洗滌除去丙酮。上層石油醚經(jīng)無水硫酸鈉脫水收集于三角瓶中，旋轉蒸發(fā)濃縮至5ml。,在2cm（ID）25cm玻璃層析柱中，于底部加入少許玻璃棉，依次加入1cm高的無水硫酸鈉，5gFlorisil和1cm無水硫酸鈉。先以40ml無水乙醚石油醚液（15：85）預洗柱子，棄掉淋出液。把濃縮的樣液移入柱內(nèi)，以適量無水乙醚石油醚液（15：85）洗脫，收集全部洗脫液，于40水浴上減壓濃縮至40ml，以石油醚定容，供色譜分析。,2. 色譜條件 色譜柱：50m 0.25mm（內(nèi)徑）；膜厚0.20um，固定相為CP-Sil 19CB，彈性石英毛細管柱。 氮氣作為流動相，進樣溫度250，檢測器溫度300，采用不分流進樣方式，進樣量1uL，進樣0.75min后吹掃。 柱溫程序：柱溫100，恒溫4min以后以8/min的速率程序升溫至240，繼續(xù)恒溫20min至樣品全部流出。,近幾年來有機氯農(nóng)藥殘留分析結果： 海鳥蛋，海豹，魚粉，魚油：毒殺芬 地表水，橄欖油：硫丹 淡水魚：DDE 飲用水：16種OCPs 水果蔬菜：924種OCPs 藥材：718種OCPs,7.1.4 有機磷殺蟲劑殘留的分析 有機磷農(nóng)藥（OPPs)是含有C-P鍵或C-O-P、C-S-P、C-N-P鍵的有機化合物。 大部分不溶于水，而溶于有機溶劑。在中性和酸性條件下穩(wěn)定，不易水解，在堿性條件下易水解失效。 接觸可造成中毒，它們的毒性依賴于其結構和功能團。例如，含P=O鍵（如敵百蟲、對氧磷）的毒性通常比含P=S（如馬拉硫磷）大。這些化合物主要是抑制生物體內(nèi)膽堿酯酶的酶活性，導致乙酰膽堿這種傳導介質代謝紊亂，產(chǎn)生遲發(fā)性神經(jīng)毒性，引起運動失調、昏迷、呼吸中樞麻痹甚至死亡。 有機磷殺蟲劑由于藥效高，易被水、酶及微生物所降解，很少殘留毒性等，因此目前在殺蟲劑的使用方面，它仍然起主要作用。,目前正式商品化的有機磷農(nóng)藥有上百種，如敵敵畏、敵百蟲、馬拉硫磷等。 敵敵畏（DDV） O，O-二甲基-O-（2，2-二氯）乙烯基磷酸酯 無色液體，有芳香味，在水中約能溶1%，能與大部分有機溶劑相溶。 DDV是一種觸殺和胃毒殺蟲劑。對蠅、蚊、飛蛾等擊倒速度很快。 對雄大鼠的口服急性毒性LD50為80mg/kg，在溫血動物體內(nèi)很快降解。,敵百蟲 O，O-二甲基-1-羥基-2，2，3-三氯乙基磷酸酯 敵百蟲是一種觸殺和胃毒殺蟲劑。對雙翅目昆蟲很有效。 敵百蟲本身對乙酰膽堿酯酶抑制力很弱，但它在生理pH條件下就能轉變成強抑制劑DDV。,樂果 O,O-二甲基-S-（N-甲基氨基甲酰甲基）二硫代磷酸酯 第一個對哺乳動物低毒的有機磷內(nèi)吸殺蟲劑。 樂果是一種觸殺性和內(nèi)吸性殺蟲殺螨劑。 樂果在貯存中不很穩(wěn)定，特別在溫度高和存在堿及二硫代磷酸二甲酯時會分解，主要是發(fā)生烷基化反應。鐵可加速其分解。,檢測方法,檢測有機磷的分析方法有波譜法、色譜法、酶抑制法三大類。 波譜法是跟據(jù)有機磷農(nóng)藥中某些官能團或水解、還原產(chǎn)物與特殊的顯色劑在一定的條件下，發(fā)生氧化、磺酸化、酯化、配合等化學反應，產(chǎn)生特定波長的顏色反應來進行定性和定量測定，檢測限在g級水平。,色譜法 (1) 薄層色譜法是一種比較成熟的、廣泛應用的微量快速檢測方法，檢出限達0.10.01g。 GC AOAC在20世紀80年代就對大部分有機磷農(nóng)藥建立了氣相色譜分析方法，我國食品理化檢驗國家標準方法也采用了氣相色譜檢測有機磷殺蟲劑。隨著氣相色譜儀的普及，對可能存在有機磷農(nóng)藥殘留的樣品，如食品、果蔬、飼料、水產(chǎn)品、土壤、水體及血液、化妝品等都建立了氣相色譜分析方法。,(3) HPLC 對氣相色譜不能檢測的高沸點或熱不穩(wěn)定、易裂解變質的有機磷農(nóng)藥可以采用HPLC法檢測。AOAC中有近半數(shù)的有機磷農(nóng)藥都建立了HPLC法，研究報道也較多。 當使用GC或HPLC發(fā)現(xiàn)違規(guī)的農(nóng)藥殘留時，必須使用其它方法來確認。 可以利用GC借助其在兩根或多根極性不同的柱子上的保留時間來確認，也可以用GC/MS。,酶抑制法是利用有機磷殺蟲劑的毒理性質建立的一種快速檢測方法。 由于有機磷能抑制乙酰膽堿酯酶的活性，使該酶分解乙酰膽堿的速度減慢或停止，再利用一些特定的顏色反應來反映被抑制程度，從而達到檢測目的。 操作簡單、速度快，不需昂貴儀器，特別適合現(xiàn)場檢測以及大批量樣品的篩選。 靈敏度、重復性和回收率相對較差。 新方法：酶抑制-生物芯片分析法。,茶葉中多種有機磷農(nóng)藥殘留量測定方法： 提取 稱取0.5g粉碎茶葉于試管中，加入2ml蒸餾水和無水硫酸鈉，在混勻器上混勻，加入2ml乙酸乙酯，混勻，離心，取上清液。殘渣用乙酸乙酯和正己烷（1：1）混合液再提取一次，合并兩次提取液，過活性炭小柱，用乙酸乙酯：正己烷（1：1）混合液洗脫，將洗脫液低溫濃縮至0.5ml，供氣相色譜分析。外標法峰面積定量。,色譜條件 色譜柱：HP-1石英毛細管柱，氮磷檢測器，流動相：氮氣、氫氣和空氣。 程序升溫：60（保持0.5min），以10/min，至250（保持3min）。 進樣口溫度：250。 檢測器溫度：300。 不分流進樣：進樣量1uL。,7.1.5 擬除蟲菊酯的殘留分析,擬除蟲菊酯（pyrethroids)是一類重要的殺蟲劑，具有高效、廣譜、低毒和生物降解等特性。 擬除蟲菊酯在化學結構上具有共同的特點之一是分子結構中含有數(shù)個不對稱碳原子，因而包含多個光學和立體異構體。它們具有不同的生物活性，即殺蟲效果也不大相同。,擬除蟲菊酯的檢測 在植物樣品中擬除蟲菊酯的測定要點： 提取一般采用勻漿提取法，對于色素較深的樣品，可在勻漿時加入活性炭再進行。也有用索氏提取器用乙醚提取的報道。 提取溶劑多用丙酮。 凈化通常采取液液分配加柱層析法，層析柱填料多用氟羅里硅土和硅膠。 檢測儀器一般用氣相色譜帶電子捕獲檢測器，但也有用HPLC/UV的報道。 氣相色譜測定一般采用非極性至弱極性柱。,除蟲菊酯農(nóng)藥熱穩(wěn)定性較高，使用毛細管色譜柱在高溫區(qū)段（250-280）有利于分離，雜質干擾較少，用ECD檢測靈敏度較高，可以滿足食品中擬除蟲菊酯農(nóng)藥殘留量的測定。 將有機氯和擬除蟲菊酯農(nóng)藥同時測定，在一般情況下，有機氯如BHC、DDT出峰在前，而擬除蟲菊酯出峰在后。,水果、蔬菜中擬除蟲菊酯殘留量測定 1.前處理 稱取約20g試樣，至于錐形瓶中，加入適量丙酮，振蕩40min，過濾。用丙酮洗滌殘渣，將濾液收集在100ml容量瓶中，并用丙酮定容。 吸取5ml提取液于具塞離心管中，加入20ml2硫酸鈉溶液，用正己烷萃取兩次。合并萃取液，并通過無水硫酸鈉柱脫水并以少量正己烷洗滌柱。流出液合并后濃縮至1ml。在微型層析柱的下端填入少量脫脂棉，依次裝入0.5cm高的無水硫酸鈉、1g硅膠和1cm高的無水硫酸鈉。用5ml正己烷預淋洗層析柱，棄去流出液。將濃縮液倒入柱內(nèi)，以二氯甲烷淋洗層析柱，收集洗脫液，濃縮至干，再以正己烷定容，供氣相色譜測定。,2. 色譜條件 色譜柱：HP-5MS石英毛細管柱 氮氣：1ml/min 柱溫：60（保持0.5min），以10/min，至280（保持20min） 進樣口溫度：260 檢測器ECD溫度：280 進樣方式：不分流,7.1.6 多種類農(nóng)藥殘留量測定方法,目前國際上通常是使用一個前處理方法，用不同的儀器系列測定，同時測定多達上百種的農(nóng)藥，特別是GC/MS方法的使用使得在色譜上難以分離的化合物用選擇離子的方式進行分別測定，可在一次進樣中測定200多種農(nóng)藥。 例：茶葉中多雜環(huán)類農(nóng)藥殘留測定 用GC/ECD檢測懷疑含有的有機氯農(nóng)藥殘留，再以GC/MS-MS進行確認及定量分析。,水果、蔬菜和牛奶中農(nóng)藥殘留的氣質聯(lián)機分析 1.提取 取50g切碎的樣品（或牛奶）于搗碎器中，加入100ml乙腈乙醇（95：5）混合液，搗碎5min。加入15g氯化鈉，繼續(xù)搗碎5min。轉移40ml上層有機相于200ml離心瓶中，加入15g無水硫酸鈉充分振蕩，高速離心5min。定量移取30m至濃縮管中，通N2在35下濃縮至5ml。在固相萃取柱中加2cm無水硫酸鈉，用5ml甲苯淋洗。將75ml淋洗液儲備管、Envi-Carb固相萃取柱、SAX固相萃取柱和PSA固相萃取柱從上至下，按順序相連，用乙腈-甲苯（3：1）預淋。將濃縮液轉到儲備管中，通氮氣將樣品推入Envi-Carb柱中。每次用10ml乙腈-甲苯（3：1）淋洗，共淋洗4次，收集淋洗液于濃縮瓶中，并濃縮至1ml。加入約10ml丙酮再濃縮至2ml。,2. 儀器條件 GC/MS-MS條件 離子阱溫度200 進樣口溫度：升溫程序為初始溫度53，初始時間0.3min，升溫速率300/min，最終溫度250。 柱壓：10psi（1psi6894.76Pa） 分流閥：初始條件，打開；0.45min，關閉；2min，打開；流比：100 進樣量：5ul GC條件 初始溫度55，保持2min，以10/min升至230，保持10min，以20/min升至275，保持19min。,7.2 獸藥,在食用動物飼養(yǎng)過程中廣泛使用藥物，會造成藥物殘留在可食用產(chǎn)品中。動物性食品的藥物殘留會對人類健康產(chǎn)生影響。 獸藥的檢測方法包括：篩查，檢測和確認。 篩查方法是就某種基質中一定濃度的某種藥物做出陽性或陰性反應的試驗方法：微生物抑制試驗（用于對大批量樣品進行抗生素篩查）、放射和酶免疫快速測試盒（對指定藥物的篩查）。只能分類，不能確認是某種具體的化合物。 如果樣品中確實存在違規(guī)的藥物殘留，就需要使用其它的分析方法來確認：薄層色譜法、GC、HPLC、GC/MS和HPLC/MS。,7.2.1 -興奮劑的殘留分析,-激動劑，在化學上屬苯乙醇胺，為兒茶酚胺、腎上腺素和去甲腎上腺素的化學類似物。一般可分為含取代基的苯胺型（如克倫特羅）和苯酚型（如沙丁胺醇）兩大類。 它能與肌體絕大多數(shù)組織細胞膜上-受體發(fā)生作用。 某些合成的-激動劑，當以高劑量飼養(yǎng)動物時，會導致營養(yǎng)物質從脂肪組織向肌肉組織的轉移，使畜禽瘦肉增加。由于這種用法造成的可是用組織中的藥物殘留在毒理學等方面的種種問題，致使許多國家禁止在使用動物中使用該類藥物。,測定方法,檢測-興奮劑的樣品種類很多，有飼料、尿、血漿、內(nèi)臟（肝、腎）、肌肉、毛發(fā)、視網(wǎng)膜等。其中最能積累-興奮劑的是內(nèi)臟、視網(wǎng)膜。所以，在上述樣品中，檢測是否違法使用-興奮劑作為生長促進劑的合適樣品是肝臟。另外，尿樣本前處理較簡單，可實現(xiàn)快速檢測。,樣品的前處理 樣品的前處理包括樣品提取、酶解（酸解）、凈化，如果采用GC檢測，還增加衍生化步驟。 -興奮劑檢測進行酸解、酶解的必要性：因為-興奮劑在樣品中往往會與其它成分形成結合物，如在葡糖苷酸酶、硫酸酯蛋白相結合，所以樣品在提取氏要用酸或酶水解。 酶解、酸解的條件選擇：酶的品種、酶解的酶用量、酶解時間,提取 提取的方法有液液萃取法、固相萃取法、超臨界提取法。 凈化 最常用的凈化手段是固相萃取法（SPE），也有人采用免疫親和色譜法、液液凈化法。 免疫親和色譜法：用實驗動物生產(chǎn)出特異性抗體，抗體純化后被結合到瓊脂糖膠上制成柱，樣品上柱后， -興奮劑就與這些柱上的抗體結合在一起而保留下來，然后再用溶劑洗脫?，F(xiàn)在已有商品化的可重復使用的IAC柱。,衍生化 GC/MS、GC/FTIR確證前，采用衍生化技術以提高檢測靈敏度。最常用的衍生化試劑有：三甲基硅烷（TMS）、環(huán)狀二甲基硅烷嗎啉（DMS）。另外還有碳酰氯（COCl2）、甲基硼酸（MBA）、五氟一丙酐。,2. 檢測,GC/MS 這是-興奮劑檢測非常有效、靈敏、準確的手段，電離方式有電子轟擊EI、化學離子化CI兩種方式。 采用TMS作衍生化試劑、EI電離方式電離某些-興奮劑的碎片如下： 克倫特羅：86，262，243，333，277，187 沙丁胺醇：86，369，350，440，384，294 特布他林：86，356，336，426，370，280,HPLC 常用的檢測器有紫外（UV）、熒光、電化學等。 免疫分析法 放射免疫分析法、酶免疫分析法 優(yōu)點：一次可處理多個樣品、有商品化試劑盒供應，檢測靈敏度高 薄層色譜法 HPLC/MS GC/FTIR,合成的-激動劑,瘦肉精克倫特羅；鹽酸克倫特羅；鹽酸雙氯醇胺；克喘素；氨哮素；氨必妥；氨雙氯喘通；氨雙氯醇胺。,化學名為“2-（叔丁氨基）甲基4-氨基-3，5-二氯苯甲醇鹽酸鹽”，是一種從天然兒茶酚胺衍生合成的化合物；也稱羥甲叔丁腎上腺素, 是一種強效興奮劑。,上世紀80年代初，美國脂胺公司研究人員意外地發(fā)現(xiàn)，將一定量的鹽酸克倫特羅加入飼料中，能夠改變營養(yǎng)物質的代謝途徑，促進動物肌肉特別是骨胳肌蛋白質的合成，同時抑制脂肪合成，從而促進動物生長，增加瘦肉率。根據(jù)試驗得出，在飼料中添加適量的鹽酸克倫特羅，可以提高飼料轉化率、生長速率、瘦肉相對增加10以上，于是這項技術開始在養(yǎng)殖業(yè)中大行其道。,瘦肉精用于養(yǎng)殖的發(fā)現(xiàn),作用機理,它的主要作用機理是作為一種強效激動劑，選擇性的作用于腎上腺素2受體上，激活腺苷酸環(huán)化酶(cAMP)，使環(huán)磷腺苷增加，加強脂肪分解，促進蛋白質合成，實現(xiàn)動物營養(yǎng)再分配，故又將瘦肉精稱作“生長促進劑(growth promoter)”和營養(yǎng)“重分配劑(repartitioning agent)”。,為提高豬肉的瘦肉率，瘦肉精作為飼料添加劑，使用劑量是人用藥劑量的10倍以上。它用量大、使用的時間長、代謝慢，所以屠宰后上市的豬肉中瘦肉精殘留量很大。同時該藥化學性質穩(wěn)定，一般加熱方法不能將其破壞。殘留藥物通過食物進入人體，大量積蓄使人中毒。如果一次攝入量過大，會導致嚴重中毒。,瘦肉精的危害,對人的危害的主要表現(xiàn),反復使用會產(chǎn)生耐受性，對支氣管擴張作用減弱及持續(xù)時間縮短。,克倫特羅還可通過胎盤屏障進入胎兒體內(nèi)產(chǎn)生蓄積，從而影響子代。,易引起急性中毒：表現(xiàn)為心悸，面頸、四肢肌肉顫抖，頭暈、乏力。心動過速，室性早博，心電圖示S-T段壓低與T波倒置。,與糖皮質激素合用可引起低血鉀，從而導致心律失常。,1998年5月，香港因內(nèi)地供港豬肉內(nèi)臟含-興奮劑而發(fā)生中毒事件，事后在寧波供港豬場和基地牧場查出-興奮劑等違禁藥品4000多公斤。,動物性食品中毒案例一,2001年8月22日，廣東信宜市510人因食用殘留鹽酸克倫特羅的豬肉而中毒，其中51人出現(xiàn)嚴重的中毒現(xiàn)象。 11月7日廣東省河源市484人，也都因食用含有鹽酸克倫特羅的豬肉或豬肝而中毒。,動物性食品中毒案例二,無公害豬肉理化指標,克倫特羅藥物的允許量,但當前瘦肉精卻屢禁不止，原因之一就是國內(nèi)外檢測CLB的方法手段還不夠完善，還沒有建立宰前監(jiān)測體系和準確迅速方便精確的檢測方法，從而使不法分子有機可乘。,當前現(xiàn)狀,感官識別,色譜檢測技術,免疫分析技術(IA),綜合化學法,電化學檢測,瘦肉精的檢測方法,一般含鹽酸克倫特羅的豬肉色特別鮮紅，脂肪非常薄，肉皮緊貼著瘦肉，瘦肉纖維比較疏松，肉皮與瘦肉之間幾乎無肥肉( 肥膘厚度不到1.5cm) 一般健康肉淡紅色肉質彈性好 通過這種感官識別方法就可以快速簡單定性對動物性食品中有無CLB作出初步判定。 缺點：只是一種經(jīng)驗的判斷，不夠準確,感官識別,無公害豬肉感官指標,色譜檢測技術,毛細管區(qū)帶電泳法(CE),高效液相色譜質-譜聯(lián)用法(HPLC-MS),氣相色譜-傅立葉紅外聯(lián)用法(GC- FTIR),薄層色譜法(TLC),色譜檢測技術,克倫特羅在碳糊電極和鉑碳電極表面有不可逆氧化波產(chǎn)生，可直接采用電化學方法進行測定。 但是，電化學系統(tǒng)儀器和毛細管電泳儀均不是一般實驗室常備檢測儀器，不利于大量樣品中克倫特羅殘留測定。,電化學檢測技術,綜合化學法,根據(jù)CLB的化學結構，CLB可顯芳香第一胺類的鑒別反應，也可以顯氯化物的鑒別反應。 該法儀器與試劑廉價，無復雜的樣品前處理，操作簡單，適合基層防疫工作者初選CLB殘留的方法。 但最低檢測限較高，靈敏度低。,免疫分析技術(IA),免疫分析是以抗原與抗體的特異性、可逆性結合反應為基礎的新型分析技術。 免疫反應具有很高的選擇性和靈敏性，因此，免疫分析技術無論作為獸藥殘留分析的檢測手段還是樣本凈化方法都能使分析過程特別是前處理步驟大大簡化。,免疫分析技術(IA),酶免疫分析技術(EIA),放射免疫分析技術(RIA),熒光免疫分析法(簡稱熒免法，F(xiàn)IA),膠體金免疫技術(DIGFA),根據(jù)檢測CLB標記物的不同主要有：,放射免疫分析法具有特異性強，靈敏度高，準確、快速，操作簡便，易于標準化等優(yōu)點；目前國外已有很多RIA試劑盒投放市場，這些試劑盒可檢測一種或多種-興奮劑。 但是由于放射免疫分析法需要較昂貴的液體閃爍儀或放射儀，且放射性同位素對工作人員有一定的傷害，廢棄物又不易處理，這些不利因素限制了該法的廣泛應用。,放射免疫,熒光免疫分析法(FIA) 克服了放射免疫法中的核輻射缺點。其檢測限10ng/ml。 熒免法檢測藥物殘留具有特異性高，穩(wěn)定性好，對樣品處理要求簡單，一次可檢測多個樣品等優(yōu)點。 缺點是對溫度的強烈依賴性和熒光強度取決于激發(fā)波長，因此在藥物分析方面應用較少。,熒光免疫,金標免疫分析技術采用膠體金標記，實質上是蛋白質等高分子被吸附到膠體金顆粒表面的包被過程。最大特點是單份測定、簡單快速、特異敏感，10min左右就可以看到顏色鮮明的測試結果。其檢測靈敏度為510 ng/ml。 但其大批量測定時費用高于現(xiàn)有的酶標記法。,膠體金免疫分析技術(GICA),酶免疫分析,7.2.2 抗生素,廣義抗生素包括微生物的抗生素（抗細菌、抗真菌、抗立克次體、抗衣原體和抗病毒等）和抗腫瘤抗生素。 常用的抗生素（或臨床抗生素）主要是指抗微生物感染的抗生素。,抗生素的分類,7.2.2.1 -內(nèi)酰胺類抗生素,-內(nèi)酰胺類抗生素包括了種類繁多的天然和半合成化合物，所有這些化合物都具有-內(nèi)酰胺環(huán)的共同結構。 第一個被發(fā)現(xiàn)的是青霉素G。 -內(nèi)酰胺類是破壞細菌細胞壁的繁殖期殺菌性抗生素。由于它們對細菌的選擇性作用強，而對人幾乎沒有毒性，所以是一類高效低毒的抗生素。但是青霉素類會使一些敏感個體產(chǎn)生十分劇烈的過敏反應。,青霉素,青霉素G penicillin G,又名芐青霉素 benzyl penicillin 具有青霉素的基本結構,其側鏈為芐基，故稱芐青霉素。 藥動學：青霉素G在室溫下粉劑穩(wěn)定，水溶液不穩(wěn)定?？诜妆晃杆崞茐?，吸收極少；肌肉注射吸收快而全，分布于細胞外液，腦膜炎時可透入腦脊液；由腎小管主動分泌而排泄，此過程受丙磺舒影響。,作用機制：青霉素類的-內(nèi)酰胺環(huán)與抗菌活性有關，而噻唑環(huán)與過敏反應有關。青霉素與青霉素結合蛋白（PBPs）結合后，青霉素的-內(nèi)酰胺環(huán)抑制PBPs中轉肽酶的交叉聯(lián)結反應，阻礙細胞壁粘肽生成，使細胞壁缺損；另外青霉素還可激活細菌的自溶酶，從而使細菌體破裂死亡。 抗菌作用：青霉素G主要對G+細菌和G-球菌有效，特別是繁殖旺盛的細菌；此外，對螺旋體、防線菌也有很強的作用。,臨床應用：主治G+菌感染，對G-球菌感染如淋病、流腦也有良效；對梅毒、回歸熱、鉤端螺旋體感染也有特效。 不良反應： 1.局部刺激癥狀如注射部位疼痛、硬結較常發(fā)生； 2.過敏反應，特別是過敏性休克。過敏反應重在預防，過敏性休克一旦發(fā)生要積極搶救；肌肉或靜脈注射腎上腺素，同時采取其他措施，如吸氧、輸液、人工呼吸、氣管切開等。,各國對食品中，特別是在牛奶中，對-內(nèi)酰胺類抗生素都制定了比較嚴格的最大殘留量。 中國: 牛奶中氨芐青霉素的MRL為 4ng/g。 目前對于一些常見的青霉素類抗生素殘留最常用、最便捷的檢測方法是ELISA，但化學檢測方法作為最終評判越來越受到重視，如采用大氣壓電離源(APCI、ESI等）HPLC-MS具有測定小于10-9級-內(nèi)酰胺類殘留的能力。,HPLC/MS法測定牛奶中青霉素類方法： 牛奶在3-4，13800r/min高速離心30min，去除蛋白。取上清液與等體積的0.1M磷酸緩沖溶液（pH9.2）混勻。加入正己烷混勻后離心，將水相轉移至Bakerbond C18 SPE柱，分別用2氯化鈉、水吝惜，50mM磷酸緩沖液與乙腈（1：1）混合液洗脫。洗脫液經(jīng)氮氣濃縮，用甲酸調節(jié)pH值至6-7，用水定容至1ml。 色譜條件：YMC ODS-AQ色譜柱，流動相為水和乙腈，以不同的配比進行梯度洗脫。 質譜：錐體電壓為18-20V，碰撞能量10-24ev。,7.2.2.2 四環(huán)族抗生素,四環(huán)族抗生素屬快效抑菌劑。其作用機制主要是抑制細菌肽鏈的增長和蛋白質的合成，并可引起細菌細胞膜通透性改變，從而抑制DNA的復制。 四環(huán)素類有天然品四環(huán)素、土霉素及半合成品多西環(huán)素、米諾環(huán)素。其中米諾環(huán)素的抗菌作用最強，多西環(huán)素其次，四環(huán)素和土霉素最差。,對于四環(huán)素類化合物的檢測，主要采用液相色譜法，如EEC方法中采用金屬螯合物形式純化樣品，經(jīng)液相色譜分析的技術路線，即用0.5g/L CuSO4溶液對瓊脂糖樹脂進行螯合反應后，用pH4.0琥珀酸溶液沖洗制得。同時用相同琥珀酸提取組織樣品中四環(huán)素殘留物，經(jīng)螯合柱富集濃縮后，用EDTA/琥珀酸溶液洗脫，洗脫液再經(jīng)XAD-2柱進行離子交換型吸附，用甲醇洗脫，經(jīng)蒸除溶劑，溶解殘渣等步驟制得分析樣品，用HPLC/UV檢測。,在前處理過程中，也可采用氨基鍵合的固相萃取柱方式提取、凈化樣品，用HPLC后接AlCl3溶液進行柱后衍生化，經(jīng)熒光檢測。 值得注意的是，四環(huán)素類在高pH值條件下，極易與金屬離子結合，給色譜分析造成負面影響，因此在HPLC分析中，經(jīng)常用磷酸鹽等緩沖溶液控制酸度，但由于這類緩沖溶液具有較強的離子抑制作用，不適合HPLC-MS法。 在HPLC-MS分析時，常用于控制酸度的是甲酸、乙酸、草酸等具有一定揮發(fā)性的酸性物質。,氯霉素是一種廣譜抗生素藥。它的抗菌作用是通過在生物體內(nèi)將硝基還原成亞硝基，而后亞硝基不可逆地同線粒體細胞結合，抑制了細菌細胞形成所必需的蛋白質的合成。 由于氯霉素對造血系統(tǒng)的不良反應，臨床上僅限用于其它抗生素無效或不適用的病例。 接觸CAP可導致一些個體產(chǎn)生變態(tài)過敏性反應，產(chǎn)生皮疹、發(fā)燒，并有可能腸出血。 當使用CAP時，易感人群可患再生障礙性貧血，這是一種潛在的致死的血液失調，并可能發(fā)展成為白血病。,7.2.2.3 氯霉素（CAP),FAO/WHO在1994年的第四十二屆食品添加劑聯(lián)合專家委員會會議上作出：“由氯霉素引起的再生障礙性貧血與劑量無關，因此不能通過制定最高殘留量來加以限制”的結論，因此建議是“不設定”。 美國和加拿大不允許氯霉素用于最終為人類食用的動物身上，僅批準用于寵養(yǎng)動物疾病的治療。 歐盟的96/23指令中把氯霉素列入禁用藥。 日本規(guī)定所有最終為人類所使用的動物源性食品中氯霉素殘留量必須為零。,提取：樣品中氯霉素的提取，通常采用加入溶劑后均質的方法。所用溶劑有乙酸乙酯、乙腈、10三氯乙酸溶液。也有其它方法，如加水均質后，經(jīng)Extralut柱，用二氯甲烷洗脫提??；或在樣品中先加入葡糖苷酸酶，于37下酶解90min再用乙酸乙酯提取。 凈化：提取液經(jīng)濃縮后加入水后，用己烷洗滌除去脂肪等脂溶性雜質。經(jīng)液液分配初步凈化的提取液往往達不到測定要求的純度，需經(jīng)柱層析凈化。較多用的是硅膠柱和C18小柱，也有用離子交換樹脂XAD-2和活性炭；硅膠柱和凝膠柱（Sephadex G-25)。洗脫液有乙腈水（80：20）、乙醚甲醇（70：30）、丙酮己烷（2：1）等。,測定：目前國內(nèi)外主要使用的方法有：HPLC-UV, HPLC/MS, GC-ECD, GC/MS, HPTLC, ELISA和放射免疫法等。 HPLC法：色譜柱常用C18和C8柱，流動相通常用甲醇水、0.01M乙酸鈉緩沖液（pH4.3）乙腈，UV檢測器。 HPLC/MS法：HPLC條件同上 GC法：包括GC-ECD法和GC/MS法。測定之前需衍生化。用非極性或弱極性色譜柱，ECD、MS-EI、陰離子化學電離（NCI）檢測器。,HPTLC法：薄層板：Si60；流動相：乙酸乙酯己烷（2：1），熒光衍生化；測定波長366nm。 ELISA法：國外已有商品試劑盒供應，檢測限低，特異性高。 放射免疫法：靈敏度高 蛋、奶、肉：GC-ECD 牛奶、牛組織：LC/MS 蛋：HPLC 肉：ELISA篩選，LC定量，GC/MS確認,7.3 毒素,生物毒素（Biotoxin)是一大類生物活性物質的總稱，包括動物毒素、植物毒素和微生物毒素。 生物毒素已經(jīng)對食品安全和人類健康構成了威脅，因此，食品/飼料中生物毒素的研究也日益顯現(xiàn)出其必要性和迫切性。,7.3.1 真菌毒素,真菌毒素（Mycotoxins）是某些絲狀真菌產(chǎn)生的具有生物毒性的次級代謝產(chǎn)物，這些毒性真菌包括曲霉、青霉、鐮刀霉、鏈格孢酶、棒孢酶和毛殼酶等。 最先被分離純化的真菌毒素是麥角生物堿（Ergot Alkaloid, 1875)和青霉酸（Penicillic Acid, 1913)。然而，對真菌毒素的真正研究卻是從1962年黃曲霉毒素的發(fā)現(xiàn)開始的。,黃曲霉毒素（Aflatoxin) 黃曲霉和寄生曲酶是產(chǎn)生黃曲霉毒素的主要菌種，其他曲霉、毛霉、青霉、根霉等也可以產(chǎn)生黃曲霉毒素。 黃曲霉毒素最常見于花生及花生制品，玉米、棉子和一些堅果類食品中，主要有黃曲霉毒素B1，B2，G1及G2等10多種。其中以黃曲霉毒素B1存在量最大且毒性最大。,黃曲霉毒素是已被證實的致癌物，其中黃曲霉毒素B1、M1是強致癌物。 黃曲霉毒素作用機理是影響細胞膜，抑制RNA合成并干擾某些酶的感應方式。 中毒癥狀無特異表現(xiàn)，臨床可表現(xiàn)為發(fā)育遲緩、腹瀉、肝腫大、肝出血、肝硬化、肝壞死、脂肪滲透和膽道增生等。 1993年WHO的癌癥研究機構將其劃定為1類致癌物。它是致癌力最強的生物毒素，人類原發(fā)性肝癌的主要致病因素之一。,黃曲霉毒素分析,食品中黃曲霉毒素的測定，主要有TLC, ELISA, HPLC等方法。 TLC法靈敏度和重現(xiàn)性較差；ELISA重現(xiàn)性差，易受樣品基質干擾；HPLC法靈敏度和準確度高，重現(xiàn)性好，因此已成為黃曲霉毒素分析的主要手段。,HPLC法測定黃曲霉毒素，一般使用靈敏度和選擇性較好的熒光檢測器。在反相色譜中，B1和G1兩種異構體熒光強度很弱，需進行衍生化，提高其熒光強度，靈敏度才能滿足一般食品法規(guī)的限量。 衍生化的方法一般有柱前和柱后兩類，柱前衍生一般使用三氟乙酸，柱后衍生有碘液、過溴化吡啶溴以及電化學等方法。,樣品提取與凈化 樣品加入氯化鈉和甲醇水（7：3），均質2min，過濾。取濾液加適量水，再次過濾后，上免疫親和柱，用水洗柱，最后用甲醇洗脫黃曲霉毒素，用水定容，供HPLC測定。 HPLC條件 色譜柱C18； 流動相：甲醇乙腈水（1：1：3） 柱后衍生試劑：碘液 衍生化溫度和時間：70，55s 激發(fā)波長：360nm 發(fā)射波長：大于520nm,7.3.2 海洋藻類毒素,海洋藻類毒素是由海洋中的微藻或海洋細菌產(chǎn)生的一類生物活性物質的總稱。由于這些毒素通常是通過海洋貝類或魚類等生物媒介造成人類中毒的，因此這些毒素常被稱作貝毒或魚毒。 常見的貝毒有麻痹性貝毒， 腹瀉性貝毒，記憶缺失性貝毒，神經(jīng)性貝毒等。 我國浙江、福建、廣東等地曾多次發(fā)生貝類中毒，導致中毒的貝類有蚶子、花蛤、香螺、織紋螺等常食用