實(shí)驗(yàn)三酵母核糖核酸(RNA)的提取.ppt

實(shí)驗(yàn)三 酵母菌RNA的提取、鑒定及定量測(cè)定,一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握稀堿（NaOH）法分離酵母RNA的原理與方法 了解RNA的組分并掌握定性鑒定的具體方法。,二、實(shí)驗(yàn)原理,（一）目前常用的RNA的制備方法 濃鹽法：是用高濃度鹽溶液處理，同時(shí)加熱，以改變細(xì)胞壁的通透性，使核酸從細(xì)胞內(nèi)釋放出來。成本低、適于大規(guī)模操作。 稀堿法: 是用氫氧化鈉使酵母細(xì)胞壁變性、裂解，然后用酸中和，除去蛋白質(zhì)和菌體后的上清液用乙醇沉淀RNA。提取的RNA有不同程度的降解。稀堿法的提取時(shí)間短，提取率高于濃鹽法，更利于工業(yè)化生產(chǎn)。,（二）實(shí)驗(yàn)材料的選擇,酵母細(xì)胞富含核酸，且核酸主要是RNA，含量為干菌體的2.67%-10.0%，而DNA含量較少，僅為0.03%-0.516%。為此提取RNA多以酵母為原料。,（三）RNA的化學(xué)組成的鑒定,（1）嘌呤堿鑒定：與硝酸銀作用產(chǎn)生白色的嘌呤銀化合物沉淀。 （2）核糖的鑒定：地衣酚（3,5二羥甲苯試劑）顯色法 （3）磷酸的鑒定：與鉬酸銨試劑作用產(chǎn)生黃色的磷鉬酸銨沉淀(NH4)3PO412MoO3。 （4）脫氧核糖的鑒定：與二苯胺試劑反應(yīng)生成藍(lán)灰色沉淀，如沒有沉淀產(chǎn)生，說明沒有DNA.,三、試劑,1. 干酵母粉。 20.04mol氫氧化鈉溶液。 3乙酸。 495乙醇。 55硫酸。 6. 濃氨水。 7. 50g/L硝酸銀溶液。,8地衣酚（3,5二羥甲苯試劑）：取比重1.19HCl 100ml，加入FeCl36H20 100mg及二羥甲苯100mg，混勻溶解后，置于棕色瓶中，此試劑必須在臨用前新鮮配制。市售的3,5二羥甲苯不能使用，必須用苯純化結(jié)晶l2次，并用活性炭脫色方可使用。 9定磷試劑：2.5鉬酸銨溶液：20ml水溶解2.5克鉬酸銨，加5molL H2S0430ml，用水稀釋至l00ml，此試劑可在冷處保存一月不變質(zhì)。,10. 10抗壞血酸(Vc)溶液： 10g抗壞血酸溶于100ml水。貯棕色瓶中。溶液呈淡黃色尚可用，如呈深黃色即失效。 11二苯胺試劑： 稱取1.5g二苯胺（如不純，須在70乙醇中重結(jié)晶2次），溶于100ml冰醋酸（AR）中，再加入濃H2SO41.5ml， 搖勻，貯在棕色瓶中放冰箱內(nèi)保存?zhèn)溆谩?12沉淀劑(鉬酸銨過氯酸試劑)：0.25鉬酸銨溶于2.5過氯酸中。如配200ml，即在 193ml水中加入7m170過氯酸和0.5g鉬酸銨。,四、操作步驟,1.核酸的提?。好慷擞么笤嚬苋?g干酵母,加入0.05mol NaOH溶液5ml提取，放入試管沸水浴加熱30分鐘，并經(jīng)常攪拌。 待冷卻后加入乙酸58滴，使提取液呈酸性(石蕊試紙)，移在離心管里，離心10分鐘(3500轉(zhuǎn)分)。 將上清液倒入另一離心管中，加入95乙醇2ml，邊加邊攪。加畢，離心10分鐘，即可得到核酸鈉的白色沉淀。,2.核酸的水解：在含有核酸鈉的離心管中加入5硫酸2ml，用玻棒攪勻，沸水浴煮10分鐘。 其中1ml水解液放進(jìn)EP管里，貼好標(biāo)簽冷凍保存（下次試驗(yàn)用）,3.核酸的鑒定 取水解液，按下表所列程序分別鑒定核酸的嘌呤堿、磷酸及核糖和脫氧核糖。,1.嘌呤堿的鑒定：取試管兩只，分別標(biāo)明測(cè)定管與對(duì)照管，依次加入下列各試劑。,注：加濃氨水使呈堿性可用pH 試紙檢定。 加入AgNO3后，觀察有何變化。靜置15分鐘后，再比較兩管中之沉淀。,2.磷酸的鑒定：取試管兩只，分別標(biāo)明測(cè)定管與對(duì)照管，然后依次加入下列各試劑：,放置數(shù)分鐘，觀察兩管顏色有何不同。 磷酸+鉬酸銨磷鉬酸+Vc鉬藍(lán),3.核糖的鑒定：取試管兩只，分別標(biāo)明測(cè)定管與對(duì)照管，然后依次加入下列各試劑。,將兩試管放入沸水浴內(nèi)加熱10分鐘，比較兩管之顏色。,4.脫氧核糖的鑒定：取兩試管分別標(biāo)明測(cè)定管與對(duì)照管，然后依次加入下列各試劑。,將兩試管同時(shí)放入沸水浴內(nèi)，加熱10分鐘后，比較兩管之顏色。,思考題,1.核酸的溶解性質(zhì)是什么?常用什么試劑分離沉淀核酸? 2.為什么用酵母作為實(shí)驗(yàn)原料？如何使RNA從酵母中釋放出來？ 3.破酵母細(xì)胞時(shí)為什么要在沸水浴中進(jìn)行?,實(shí)驗(yàn)五 RNA的定量測(cè)定紫外(UV)吸收法,一、目的要求,1. 掌握紫外線（UV）吸收法測(cè)定核酸濃度的原理。 2. 熟悉紫外分光光度計(jì)的使用方法。,二、實(shí)驗(yàn)原理,核酸及其衍生物，核苷酸、核苷、嘌呤和嘧啶有吸收UV的性質(zhì)，其吸收高峰在260nm波長(zhǎng)處。測(cè)得未知濃度核酸溶液的A260nm值，即可以計(jì)算出其中RNA或DNA的含量。該法操作簡(jiǎn)便，迅速，并對(duì)被測(cè)樣品無損，用量也少。,三、試劑,鉬酸銨過氯酸沉淀劑：取3.6ml 70%過氯酸和0.25g鉬酸銨溶于96.4ml蒸餾水中，即成0.25%鉬酸銨2.5%過氯酸溶液。,四、操作步驟,（1）取0.5ml未知濃度的RNA溶液（上次實(shí)驗(yàn)提?。?，用蒸餾水稀釋至50ml，此為A液。 （2）取A液2ml，再稀釋至50ml，為B液。 （3）另取4ml A液，加1ml沉淀劑，搖勻后置冰水中20分鐘，離心（3500rpm/min，10分鐘），取上清液2.5ml，稀釋至50ml，此為C液。 沉淀劑的作用是，使RNA沉淀析出，得到不含RNA的對(duì)照液。 （4）分別取B，C液于厚度為1cm的石英比色杯，在260nm波長(zhǎng)處測(cè)定A值。,式中A260為B管稀釋液在260nm波長(zhǎng)處A值減去C管稀釋液在260nm波長(zhǎng)處A值。N為稀釋倍數(shù). 0.024（或0.020）表示1mg/ml RNA（或DNA）溶液測(cè)定的A260值相當(dāng)于0.024。此為多次試驗(yàn)驗(yàn)證的數(shù)值。,計(jì)算,1000,思考題,1.核酸的溶解性質(zhì)是什么?常用什么試劑分離沉淀核酸? 2.為什么用酵母作為實(shí)驗(yàn)原料？如何使RNA從酵母中釋放出來？ 3.破酵母細(xì)胞時(shí)為什么要在沸水浴中進(jìn)行?,實(shí)驗(yàn)六 過氧化氫酶米氏常數(shù)（Km）的測(cè)定,一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)習(xí)米氏常數(shù)的測(cè)定方法。,二、實(shí)驗(yàn)原理 米氏常數(shù)的測(cè)定,米氏常數(shù)的測(cè)定：雙倒數(shù)作圖法（Lineweaver-Burk法）,1 Km 1 1 = . + v Vmax S Vmax,二、實(shí)驗(yàn)原理,本實(shí)驗(yàn)測(cè)定紅細(xì)胞中過氧化氫酶的米氏常數(shù)。過氧化氫酶(CAT)催化下列反應(yīng)： 2H2O2 CAT 2H2O+O2 H2O2濃度可用KMnO4在硫酸存在下滴定測(cè)知。 2KMnO45H2O23H2SO4 - 2MnSO4K2SO45O28H2O 求出反應(yīng)前后H2O2的濃度差即為反應(yīng)速度。作圖求出過氧化氫酶的米氏常數(shù)。,三、試劑,10.05mol/L草酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液 將草酸鈉（AR）于100105烘12h。冷卻后，準(zhǔn)確稱取0.67g，用水溶解倒入100ml量瓶中，加入濃H2SO4 5ml，加蒸餾水至刻度，充分混勻，此液可貯存數(shù)周。 2約0.02ml KMnO4儲(chǔ)存液 稱取KMnO4 3.5g，溶于1000ml蒸餾水中，加熱攪拌，待全部溶解后，用表面皿蓋住，在低于沸點(diǎn)溫度上加熱數(shù)小時(shí)，冷后放置過夜，玻璃絲過濾，棕色瓶?jī)?nèi)保存。 30.004mol/L KMnO4應(yīng)用液 取0.05mol/L草酸鈉標(biāo)準(zhǔn)液20ml，于錐形瓶中，加濃H2SO4 4ml，于70水浴中用KMnO4貯存液滴定至微紅色，根據(jù)滴定結(jié)果算出KMnO4貯存液的標(biāo)準(zhǔn)濃度，稀釋成0.004mol/L，每次稀釋都必須重新標(biāo)定儲(chǔ)存液。 4約0.08mol/L H2O2液 取20%H2O2（AR）40ml于1000.0ml量瓶中，加蒸餾水至刻度，臨用時(shí)用0.004mol/L KMnO4標(biāo)定之，稀釋至所需濃度。 50.2mol/L磷酸鹽緩沖液（pH7.0）。,四、操作步驟,l血液稀釋： 吸取新鮮（或肝素抗凝）血液0.1ml，用蒸餾水稀釋至10ml，混勻。取此稀釋血液1.0ml，用磷酸鹽緩沖液(pH7.0，0.2mol/L)稀釋至10ml，得1：1000稀釋血液。 2H2O2濃度的標(biāo)定：取潔凈錐形瓶?jī)芍?，加濃度約為0.08mol/L的H2O2 2.0ml和25%H2SO4 2.0ml，分別用0.004mol/L KMnO4滴定至微紅色。從滴定用去KMnO4 ml數(shù)，求出H2O2的 mol濃度。,3反應(yīng)速度的測(cè)定：取干燥潔凈50ml錐形瓶5只，編號(hào)，按下表操作。 將各瓶置37水浴預(yù)熱5min，依次加入1：1000稀釋血液每瓶0.5ml，邊加邊搖，繼續(xù)保溫準(zhǔn)5min，按順序向各瓶加25%H2SO4 2.0ml，邊加邊搖，使酶促反應(yīng)立即終止。 最后用0.004mol/L KMnO4滴定各瓶至微紅色,記錄KMnO4消耗量(ml)。,五、計(jì)算,1 （式中：4為反應(yīng)液量4ml） 2反應(yīng)速度的計(jì)算：以反應(yīng)消耗的H2O2 mmol數(shù)表示。 反應(yīng)速度=加入的H2O2 mmol數(shù)剩余的H2O2 mmol數(shù) 剩余的H2O2 mmol數(shù)：KMnO4 0.005 mol/L消耗的KMnO4毫升數(shù) 5/2 （式中：5/2為KMnO4與H2O2反應(yīng)中mol換算系數(shù)） 3求Km值：實(shí)驗(yàn)測(cè)得的結(jié)果，以1/v對(duì)1/S作圖，求出V和Km的數(shù)值。,0.004,實(shí)驗(yàn)七 維生素C的定量測(cè)定 2.6- DCPIP（2.6-二氯酚靛酚）滴定法,一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1. 學(xué)習(xí)并掌握定量測(cè)量維生素C的原理和方法。 2. 熟練微量滴定法的基本操作。,二、實(shí)驗(yàn)原理,維生素C是人類營養(yǎng)中最重要的維生素之一，根據(jù)它具有的還原性質(zhì)可以測(cè)定維生素C的含量。常用的測(cè)定方法有 （1）2，6-DCPIP (Dichlorophenolindo phenol ) （還原型VC） （2）2，4-二硝基苯肼法 （總VC） （3）碘酸法 （4）碘量法 （5）熒光分光光度法,三、試劑及儀器,（一）試劑及材料 （1）松針 （2）酸化蒸餾水 （3）2，6DCPIP；將50mg 2，6DCPIP溶解于約200ml含有52mg碳酸氫鈉的熱水中。冷后稀釋至250ml。裝入棕色瓶?jī)?nèi)。放在 冰箱里保存。2，6DCPIP不穩(wěn)定, 每周必須重新配制，使用前需按照下法標(biāo)定： 取5ml標(biāo)準(zhǔn)抗壞血酸溶液加5ml 1草酸，以2，6DCPIP滴定呈粉紅色，并在15秒鐘內(nèi)不退色為終點(diǎn)。計(jì)算2，6DCPIP溶液的濃度。 （4）標(biāo)準(zhǔn)抗壞血酸溶液：溶解100mg純抗壞血酸粉狀結(jié)晶于1草酸中，然后稀釋到500ml。 使用前臨時(shí)配制。 （二）器材 （1）錐形瓶（50ml）（2）小研缽（3）吸量管（10ml）（4）漏斗（5）濾紙（6）容量瓶（50ml）（7）微量滴定管（5ml）,四、操作步驟,1.準(zhǔn)確稱取松針約1g。樣品必須用溫水洗去泥土，并在空氣中風(fēng)干。放入研缽中，加1g石英砂，再加酸化蒸餾水510ml一起研磨。 2. 離心（3500轉(zhuǎn)/分）10分鐘，將上清液移入容量瓶，用酸化蒸餾水定容至50ml。 3.取10ml上述溶液放入小錐形瓶?jī)?nèi)，用微量滴定管，以2，6DCPIP（藍(lán)色）滴定至提取液呈現(xiàn)淡粉紅色，并保持1530秒不褪。(滴定過程必須迅速，不要超過2min。因?yàn)樵诒镜味l件下，一些非維生素C還原物質(zhì)的還原作用較遲緩，快速滴定右以避免或減少它們的影響) 4.另取10ml酸化蒸餾水作空白對(duì)照滴定。 提取液和空白對(duì)照各做三份，對(duì)結(jié)果取平均值進(jìn)行計(jì)算,五、計(jì)算,式中：VA為滴定樣品提取液所耗用的2，6DCPIP的平均毫升數(shù)；VB為滴定空白對(duì)照所耗用的2，6DCPIP的平均毫升數(shù)；C為樣品提取液的總毫升數(shù)；D為滴定時(shí)所取的樣品提取液毫升數(shù)；W為被檢樣品的質(zhì)量。T為1ml標(biāo)準(zhǔn)0.001N 2，6DCPIP溶液相當(dāng)維生素C的毫克數(shù)，T的具體數(shù)目為0.088mg/ml。,思考題 為了準(zhǔn)確測(cè)得維生素C含量，實(shí)驗(yàn)過程中都應(yīng)注意哪些操作步驟？為什么？,實(shí)驗(yàn)八 血糖的定量測(cè)定 （GOD-PAP法）,一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?學(xué)習(xí)GOD-PAP法測(cè)定血糖含量的原理和方法。,二、實(shí)驗(yàn)原理,動(dòng)物血液中的糖主要是葡萄糖，正常情況下，其含量較恒定。健康動(dòng)物血糖水平為80-120mg/100ml。GOD-PAP法，即過氧化物酶-抗過氧化物酶法是近幾年臨床血糖定量測(cè)定的普遍方法。該法測(cè)定血糖依據(jù)的酶反應(yīng)為： 葡萄糖+O2+H2O = 葡萄糖酸+H2O2 2H2O2+4-氨基安替比林+酚 = 醌亞胺+4H2O 醌亞胺在A480nm-A550nm波長(zhǎng)有最大吸收，所產(chǎn)生顏色的深淺與血清中葡萄糖的量成正比。在同樣條件下，測(cè)定葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液和樣品的吸收值，代入后面所給公式即可求出樣品中葡萄糖的含量。,三、試劑及儀器,1.血糖試劑盒 酶試劑（GOD，PAP，磷酸鹽，酚，4-氨基安替比林） 100mg/dL血糖標(biāo)準(zhǔn)溶液 2.兔血清,四、操作步驟,取3只試管，按下列加入試劑 空白 標(biāo)準(zhǔn) 樣品 酶制劑 3.00ml 3.00ml 3.00ml 蒸餾水 0.02ml - - 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液 - 0.02ml - 樣品 - - 0.02ml 分別將各管溶液搖勻，37度保溫15分鐘，505nm波長(zhǎng)比色。,五、計(jì)算,C樣品= (A樣品/A標(biāo)準(zhǔn)) x C標(biāo)準(zhǔn),實(shí)驗(yàn)九 小麥萌發(fā)前后淀粉酶活力的比較,一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1學(xué)習(xí)分光光度計(jì)的原理和使用方法。 2學(xué)習(xí)測(cè)定淀粉酶活力的方法。 3了解小麥萌發(fā)前后淀粉酶活力的變化。,二、實(shí)驗(yàn)原理,種子中貯藏的碳水化合物主要以淀粉的形式存在。種子萌發(fā)時(shí)，淀粉酶活性隨萌發(fā)時(shí)間迅速增加，將淀粉分解成小分子糖類，供幼苗生長(zhǎng)。 淀粉的水解產(chǎn)物麥芽糖有還原性,能與3,5-二硝基水楊酸試劑反應(yīng)，使其還原生成紅色3-氨基-5-硝基水楊酸。在一定范圍內(nèi)，其顏色深淺與淀粉酶水解產(chǎn)物的濃度成正比，可用麥芽糖（或葡萄糖）濃度表示，用比色法測(cè)定淀粉生成的還原糖的量，以單位重量樣品在一定時(shí)間內(nèi)生成的麥芽糖的量表示酶活力。,三、試劑及儀器,（一）器材 125毫升刻度試管。2吸管。3乳體。4離心管。 5分光光度計(jì)。6離心機(jī)。7恒溫水浴。 （二）試劑 1. 0.1標(biāo)準(zhǔn)麥芽糖溶液 20毫升：精確稱量100毫克麥芽糖，用少量水溶解后，移入100ml容量瓶中，加蒸餾水至刻度。 2pH 6.9，0.02摩爾L磷酸緩沖液