食品安全現(xiàn)代生物檢測技術.ppt

第六章 食品安全現(xiàn)代生物檢測技術 第一節(jié) 免疫學檢測技術 第二節(jié) PCR檢測技術 第三節(jié) 轉基因食品的檢測技術,第一節(jié) 免疫學檢測技術 一、概述 抗原與抗體的結合反應是一切免疫測定技術的最基本原理。在此基礎上結合一些生化或理化方法作為信號顯示或放大系統(tǒng)即可建立免疫測定法，如放射免疫測定法、酶免疫測定法、熒光免疫測定法等。一個成功的免疫測定法必須具備3個要素：性能優(yōu)良的抗體、靈敏和專一性的標記物和高效的分離手段。按照是否使用標記物分為標記免疫測定法和非標記免疫測定法，后者又稱為經(jīng)典免疫測定法；按反應介質分為均相或非均相(免疫復合物需分離后檢測)免疫測定法；按反應狀態(tài)分為平衡態(tài)或非平衡態(tài)免疫測定法。按照標記物種類，標記免疫測定法又分為放射性標記測定法和非放射性標記測定法。,目前最常用的免疫學檢測技術如下： （1）放射免疫測定技術 （2）酶免疫測定技術 （3）熒光免疫測定技術 （4）發(fā)光免疫測定技術 （5）膠體金免疫測定技術,二、酶聯(lián)免疫吸附試驗(ELISA) （一）ELISA的基本原理 ELISA(Enzyme-Linked immunosorbent assay)的基礎是抗原或抗體的固相化及抗原或抗體的酶標記。這一方法的基本原理如下。 （1）使抗原或抗體結合到某種固相載體表面，井保持其免疫活性； （2）使抗原或抗體與某種酶連接成酶標抗原或抗體，這種酶標抗原或抗體既保留其免疫活性又保留酶的活性。 （二）ELISA的類型 ELISA可用于測定抗原，也可用于測定抗體。用于臨床檢驗的ELISA主要有以下幾種類型。 1 雙抗體夾心法測抗原 2 雙抗原夾心法測抗體 3 間接法測抗體 4 競爭法測抗體 5 競爭法測抗原,（三）ELISA的材料與試劑 完整的ELISA試劑盒包含以下各組分：已包被抗原或抗體的固相載體（免疫吸附劑）；酶標記的抗原或抗體（結合物）；酶的底物；陰性對照品和陽性對照品（定性測定中），參考標準品和控制血清（定量測定中）；結合物及標本的稀釋液；洗滌液；酶反應終止液。 1 免疫吸附劑 2 結合物 3 酶的底物 4 洗滌液 5 酶反應終止液 6 陽性對照品和陰性對照品 7 參考標準品,三、磺胺二甲嘧啶的間接競爭ELISA檢測 （一）人工完全抗原的合成 （二）合成抗原的鑒定 （三）抗體的制備與純化 （四）標準競爭抑制曲線的制作 （五）畜產(chǎn)品中SM2殘留的ELISA檢測 （六）方法評價 1 特異性 2 靈敏度 3 準確度 4 精確度,第二節(jié)PCR檢測技術 一、概述 PCR又稱聚合酶鏈式反應(Polymerase chain reaction)，是1985年由美國的Kary Mullis首創(chuàng)并由美國Cetus公司開發(fā)的一項體外擴增DNA的方法。應用該方法可使極微量的特定DNA片段在幾小時內迅速擴增至百萬倍，因而一經(jīng)問世便在短短的數(shù)年內就得到了迅速發(fā)晨和實際應用，并在原有基礎上結合各種生化分子生物學技術衍生出了許多改良技術。這些技術顯示出了巨大的潛力，發(fā)揮著越來越大的作用，也正因為如此它們被譽為20世紀80年代分子生物學革命和生物技術的飛躍。 （一）PCR原理 PCR是依據(jù)DNA模板的特性，模仿體內的復制過程，在體外合適的條件下以單鏈DNA為模板，以人工設計和合成的寡核苷酸為引物，利用熱穩(wěn)定的DNA聚合酶延5-3方向摻人單核苷酸來特異性的擴增DNA片段的技術。 （二）PCR反應體系 PCR反應體系主要由引物、dNTP、DNA聚合酶(TaqDNA聚合酶)、緩沖液、Mg2+和核酸模板組成。,（三）PCR反應參數(shù) 在PCR反應中每輪循環(huán)的各步反應時間不應過長，以免降低TaqDNA聚合酶的活性。下面介紹PCR反應中的一些具體參數(shù)。 1.變性 2.退火 3.延伸 4.循環(huán)次數(shù) （四）常見的PCR種類 1.熱啟動PCR 2.一步單管PCR 3.多重PCR 4.依賴PCR的DNA指紋圖譜技術 5.PCR-單鏈構想多態(tài)性分析 6.mRNA差異顯示技術 7.隨機引物擴增DNA多態(tài)性（RAPD） 8.以微衛(wèi)星DNA介導的PCR技術 9.基因間重復性回文片段（REP）和基因內重復性一致序列（ERIC）的擴增 10.擴增片段長度多態(tài)性分析（AFLP） 11.限制性長度多態(tài)性分析（RFLP） 12.用于RNA病毒檢測的核酸擴增技術,（五）PCR技術用于檢測的主要步驟 （1）運用化學手段對目標DNA進行提取。 （2）設計并合成引物，引物設計或合成的好壞直接決定PCR擴增的成效。 （3）進行PCR擴增。 （4）克隆并篩選鑒定PCR產(chǎn)物，將擴增產(chǎn)物進行電泳、染色，在紫外光照射下可見擴增特異區(qū)段的DNA帶根據(jù)該帶的不同即可鑒定不同的DNA。 （5）DNA序列分析,第三節(jié) 轉基因食品的檢測技術 一、概述 轉基因食品又稱遺傳修飾食品（genetically modified food），簡稱GMF或GM食品。轉基因食品大體上分為如下三類。 （1）轉基因植物食品 由轉基因植物如轉基因的玉米、大豆、水稻、馬鈴薯、番茄、香蕉、蘋果、菠菜等生產(chǎn)加工而成。 （2）轉基因動物食品 如轉基因的魚、雞、牛、羊等。目的主要通過導入外源基因或對自身基因加以修飾來使受體動物降低結締組織交聯(lián)度、改善肉質或使受體生物個體肥大，或生產(chǎn)營養(yǎng)價值高的蛋、肉、乳等。 （3）轉基因微生物食品 如轉基因微生物發(fā)酵而制得的葡萄酒、啤酒、醬油等，此類食品是利用轉基因微生物（如轉基因酵母和酶）的作用而生產(chǎn)出來的食品。后兩類轉基因食品目前在市場上還很少。,（一）ELISA技術與轉基因食品檢測 l.ELISA基本原理 建立在抗體抗原免疫學反應的基礎上。 ELISA分析法必須具備待檢測的固定相抗原或抗體、酶標記的抗原或抗體、酶作用的底物三種試劑，且滿足兩個前提條件： 待檢測的抗原或抗體能夠結合到不溶性載體表面并保持活性； 標記酶能與抗原或抗體結合并同樣 保持各自生物活性。,ELISA分析基本步驟如下：將抗原（Ag）或抗體Ab結合到固相載體平板的孔里；待測溶液的特殊抗原或抗體結合到敏化載體表面；加入酶標抗體使之與抗原或抗體化合物相結合；結合物通過標記酶催化底物的顏色改變而被檢測；通過最后溶液的顏色深淺對待側抗原或抗體進行定量分析。 2.ELISA分析法的靈敏度 3.ELISA分析法的要點 特異性高，獲得結果快，儀器簡單，易于操作，對人員要求不高。免卻了對樣品進行核酸提取的麻煩，同時可降低檢測的成本，由于酶既有很高的催化效率，可極大的放大反應效果，從而使測定達到很高的靈敏度和穩(wěn)定性。,(二）PCR技術與轉基因食品的檢測 1.PCR技術對轉基因食品的定性檢測 （1）PCR基本原理 PCR技術由美國Centus公司Kary Mullis發(fā)明，20世紀90年代逐漸成熟應用。簡單地說PcR就是利用核酸DNA聚合酶、引物和4種脫氧單核苷酸在試管內完成模板DNA的快速復制 （2）PCR技術檢測轉基因食品的技術關鍵和理論依據(jù),（3）PCR檢測轉基因食品的基本步驟 待檢材料DNA提?。和ǔ＠肅TAB法從食品材料中提取核酸； PCR反應：設計合適引物。PCR擴增待檢樣品中的靶標DNA； 觀測PCR產(chǎn)物：通過凝膠電泳分析將PCR產(chǎn)物展現(xiàn)； 確定結果：有時為了避免假阻性，還需要對PCR產(chǎn)物進行限制性酶切分析進行質量控制。,2.PCR技術對轉基因食品的定量檢測 目前基于GMO特異DNA片段的定性PCR篩選方法已廣泛應用于GMO食品檢測但是隨著各國有關GMO標簽法的建立和不斷完善，對食品中的GMO含量的下限已有所規(guī)定。為此，研究者在定性篩選PCR方法的基礎上發(fā)展了不同的定量GMO的PCR檢測方法。目前，國外較為成熟的方法主要有半定量PCR法、定量競爭PCR(Quantitative competitive PCR)和Realtime PCR(實時定量PCR)法等三種。,（1）半定量PCR法 樣品DNA的提取和定量。 按常規(guī)方法提取DNA后，取部分樣品DNA在0.8瓊脂糖凝膠中電泳，與已知古量的Marker比較，用計算機凝腔成像分析系統(tǒng)處理結果，以確定所提取的DNA量。例如，一般700mg的玉米粉可提取lg DNA。 PCR反應。 a.樣品DNA的質量分析 b.建立內部參照反應體系 c.測定CaMV35S啟動子的定量PCR反應,（2）定量競爭PCR法 PCR反應實質是對特定模板DNA的指數(shù)擴增放大，而在相同的條件下，獲得DNA的量與最初模板DNA的濃度成正相關，競爭定量PCR就是依據(jù)這種擴增DNA與模板DNA之間的濃度相關性設計的?；驹硎窍葮嫿ê行揎椷^的內部標準DNA片段(競爭DNA)，競爭DNA由質粒組成，帶有一個改造PCR擴增子，改造部分可以是DNA插人序列、缺失序列或者點突變，競爭DNA與待測目標DNA在同一反應管中進行PCR共擴增，因競爭DNA片段和待測DNA的大小不同，經(jīng)瓊脂糖凝膠可將兩者分開，通過比較兩種條帶的量可進行定量分析。,（三）生物芯片與轉基因產(chǎn)品檢測 就目前轉基因食品檢測中常用的ELISA和PCR技術而言，最大的缺點是檢測范圍窄，效率低，無法高通量大規(guī)模地同時檢測多種樣品，尤其是對轉基因背景一無所知的情況下。對各種候選待檢基因序列或蛋白的逐一篩查幾乎是不可能的。而目前