蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能CY.ppt

蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)與功能,第一章,Structure and Function of Protein,什么是蛋白質(zhì)?,蛋白質(zhì)(protein)是由許多氨基酸(amino acids)通過(guò)肽鍵(peptide bond)相連形成的高分子含氮化合物。,蛋白質(zhì)研究的歷史,1833年，Payen和Persoz分離出淀粉酶。 1838年，荷蘭科學(xué)家 G. J. Mulder引入“protein”（源自希臘字proteios，意為primary）一詞 1864年，Hoppe-Seyler從血液分離出血紅蛋白，并將其制成結(jié)晶。 19世紀(jì)末，F(xiàn)ischer證明蛋白質(zhì)是由氨基酸組成的，并將氨基酸合成了多種短肽 。,1951年, Pauling采用X（射）線晶體衍射發(fā)現(xiàn)了蛋白質(zhì)的二級(jí)結(jié)構(gòu)-螺旋(-helix)。 1953年，F(xiàn)rederick Sanger完成胰島素一級(jí)序列測(cè)定。 1962年，John Kendrew和Max Perutz確定了血紅蛋白的四級(jí)結(jié)構(gòu)。 20世紀(jì)90年代以后，隨著人類基因組計(jì)劃實(shí)施，功能基因組與蛋白質(zhì)組計(jì)劃的展開(kāi) ，使蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的研究達(dá)到新的高峰 。,蛋白質(zhì)的分子組成 蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu) 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì) 蛋白質(zhì)的分離純化與結(jié)構(gòu)分析,主要內(nèi)容：,蛋白質(zhì)的生物學(xué)重要性,分布廣：所有器官、組織都含有蛋白質(zhì)；細(xì)胞的各個(gè)部分都含有蛋白質(zhì)。 含量高：蛋白質(zhì)是生物體中含量最豐富的生物大分子，約占人體固體成分的45%，而在細(xì)胞中可達(dá)細(xì)胞干重的70%以上。,1. 蛋白質(zhì)是生物體重要組成成分,作為生物催化劑（酶） 代謝調(diào)節(jié)作用 免疫保護(hù)作用 物質(zhì)的轉(zhuǎn)運(yùn)和存儲(chǔ) 運(yùn)動(dòng)與支持作用 參與細(xì)胞間信息傳遞,2. 蛋白質(zhì)具有重要的生物學(xué)功能,3. 氧化供能,組成蛋白質(zhì)的元素,主要有C、H、O、N和 S。 有些蛋白質(zhì)含有少量磷或金屬元素鐵、銅、鋅、錳、鈷、鉬，個(gè)別蛋白質(zhì)還含有碘 。,各種蛋白質(zhì)的含氮量很接近，平均為16。,由于體內(nèi)的含氮物質(zhì)以蛋白質(zhì)為主，因此，只要測(cè)定生物樣品中的含氮量，就可以根據(jù)以下公式推算出蛋白質(zhì)的大致含量：,100克樣品中蛋白質(zhì)的含量 (g %) = 每克樣品含氮克數(shù) 6.25100,蛋白質(zhì)元素組成的特點(diǎn),一、組成人體蛋白質(zhì)的20種L-氨基酸,存在自然界中的氨基酸有300余種，但組成人體蛋白質(zhì)的氨基酸僅有20種，且均屬 L-氨基酸（甘氨酸除外）。,C,+,N,H,3,C,O,O,-,H,除了20種基本的氨基酸外，近年發(fā)現(xiàn)硒代半胱氨酸在某些情況下也可用于合成蛋白質(zhì)。硒代半胱氨酸從結(jié)構(gòu)上來(lái)看，硒原子替代了半胱氨酸分子中的硫原子。硒代半胱氨酸存在于少數(shù)天然蛋白質(zhì)中，包括過(guò)氧化物酶和電子傳遞鏈中的還原酶等。硒代半胱氨酸參與蛋白質(zhì)合成時(shí)，并不是由目前已知的密碼子編碼，具體機(jī)制尚不完全清楚。,非極性脂肪族氨基酸 極性中性氨基酸 芳香族氨基酸 酸性氨基酸 堿性氨基酸,二、氨基酸可根據(jù)側(cè)鏈結(jié)構(gòu)和理化性質(zhì)進(jìn)行分類,(一)側(cè)鏈含烴鏈的氨基酸屬于非極性脂肪族氨基酸,(二)側(cè)鏈有極性但不帶電荷的氨基酸是極性中性氨基酸,甲硫氨酸,(三)側(cè)鏈含芳香基團(tuán)的氨基酸是芳香族氨基酸,(四)側(cè)鏈含負(fù)性解離基團(tuán)的氨基酸是酸性氨基酸,(五)側(cè)鏈含正性解離基團(tuán)的氨基酸屬于堿性氨基酸,幾種特殊氨基酸,脯氨酸 （亞氨基酸）, 半胱氨酸,胱氨酸,三、20種氨基酸具有共同或特異的理化性質(zhì),兩性解離及等電點(diǎn),氨基酸是兩性電解質(zhì)，其解離程度取決于所處溶液的酸堿度。,等電點(diǎn)(isoelectric point, pI) 在某一pH的溶液中，氨基酸解離成陽(yáng)離子和陰離子的趨勢(shì)及程度相等，成為兼性離子，呈電中性。此時(shí)溶液的pH值稱為該氨基酸的等電點(diǎn)。,（一）氨基酸具有兩性解離的性質(zhì),pH=pI,pHpI,pHpI,氨基酸的兼性離子,陽(yáng)離子,陰離子,（二）含共軛雙鍵的氨基酸具有紫外吸收性質(zhì),色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在 280 nm 附近。,大多數(shù)蛋白質(zhì)含有這兩種氨基酸殘基，所以測(cè)定蛋白質(zhì)溶液280nm的光吸收值是分析溶液中蛋白質(zhì)含量的快速簡(jiǎn)便的方法。,芳香族氨基酸的紫外吸收,（三）氨基酸與茚三酮反應(yīng)生成藍(lán)紫色化合物,氨基酸與茚三酮水合物共熱，可生成藍(lán)紫色化合物，其最大吸收峰在570nm處。 由于此吸收峰值與氨基酸的含量存在正比關(guān)系，因此可作為氨基酸定量分析方法。,四、氨基酸通過(guò)肽鍵連接而形成蛋白質(zhì)或活性肽,肽鍵(peptide bond)是由一個(gè)氨基酸的-羧基與另一個(gè)氨基酸的-氨基脫水縮合而形成的化學(xué)鍵。,（一）氨基酸通過(guò)肽鍵連接而形成肽,+,甘氨酰甘氨酸,肽鍵,肽(peptide)是由氨基酸通過(guò)肽鍵縮合而形成的化合物。,兩分子氨基酸縮合形成二肽，三分子氨基酸縮合則形成三肽,肽鏈中的氨基酸分子因?yàn)槊撍s合而基團(tuán)不全，被稱為氨基酸殘基(residue)。,由十個(gè)以內(nèi)氨基酸相連而成的肽稱為寡肽(oligopeptide)，由更多的氨基酸相連形成的肽稱多肽(polypeptide)。,+,甘氨酰甘氨酸,肽鍵,N 末端：多肽鏈中有游離-氨基的一端 C 末端：多肽鏈中有游離-羧基的一端,多肽鏈有兩端：,多肽鏈(polypeptide chain)是指許多氨基酸之間以肽鍵連接而成的一種結(jié)構(gòu)。,+,甘氨酰甘氨酸,肽鍵,N末端,C末端,牛核糖核酸酶,蛋白質(zhì)是由許多氨基酸殘基組成、折疊成特定的空間結(jié)構(gòu)、并具有特定生物學(xué)功能的多肽。一般而論，蛋白質(zhì)的氨基酸殘基數(shù)通常在50個(gè)以上，50個(gè)氨基酸殘基以下則仍稱為多肽。,（二）體內(nèi)存在多種重要的生物活性肽,1. 谷胱甘肽(glutathione, GSH),GSH過(guò)氧化物酶,GSH還原酶,NADPH+H+,NADP+,GSH與GSSG間的轉(zhuǎn)換,體內(nèi)許多激素屬寡肽或多肽,神經(jīng)肽(neuropeptide),2.多肽類激素及神經(jīng)肽,蛋白質(zhì)的分子組成 蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu) 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì) 蛋白質(zhì)的分離純化與結(jié)構(gòu)分析,主要內(nèi)容：,蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu)包括:,一級(jí)結(jié)構(gòu)(primary structure) 二級(jí)結(jié)構(gòu)(secondary structure) 三級(jí)結(jié)構(gòu)(tertiary structure) 四級(jí)結(jié)構(gòu)(quaternary structure),定義: 蛋白質(zhì)的一級(jí)結(jié)構(gòu)指在蛋白質(zhì)分子從N-端至C-端的氨基酸排列順序。,一、氨基酸的排列順序決定蛋白質(zhì) 的一級(jí)結(jié)構(gòu),主要的化學(xué)鍵: 肽鍵，有些蛋白質(zhì)還包括二硫鍵。,一級(jí)結(jié)構(gòu)是蛋白質(zhì)空間構(gòu)象和特異生物學(xué)功能的基礎(chǔ)，但不是決定蛋白質(zhì)空間構(gòu)象的唯一因素。,二、多肽鏈的局部主鏈構(gòu)象為蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu),主要的化學(xué)鍵：氫鍵,-螺旋 ( -helix) -折疊 (-pleated sheet) -轉(zhuǎn)角 (-turn) 無(wú)規(guī)卷曲 (random coil),-螺旋結(jié)構(gòu)是常見(jiàn)的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu),蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu),-螺旋結(jié)構(gòu)是常見(jiàn)的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu),-折疊使多肽鏈形成片層結(jié)構(gòu),-轉(zhuǎn)角和無(wú)規(guī)卷曲在蛋白質(zhì)分子中普遍存在,-轉(zhuǎn)角,無(wú)規(guī)卷曲是用來(lái)闡述沒(méi)有確定規(guī)律性的那部分肽鏈結(jié)構(gòu)。,三、多肽鏈在二級(jí)結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上進(jìn)一步折疊形成三級(jí)結(jié)構(gòu),整條肽鏈中全部氨基酸殘基的相對(duì)空間位置。即肽鏈中所有原子在三維空間的排布位置。,定義:,亞基之間的結(jié)合主要是氫鍵和離子鍵。,四、含有二條以上多肽鏈的蛋白質(zhì)具有四級(jí)結(jié)構(gòu),蛋白質(zhì)分子中各亞基的空間排布及亞基接觸部位的布局和相互作用，稱為蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)。,許多功能性蛋白質(zhì)分子含有2條或2條以上多肽鏈。每一條多肽鏈都有完整的三級(jí)結(jié)構(gòu)，稱為蛋白質(zhì)的亞基 (subunit)。,由2個(gè)亞基組成的蛋白質(zhì)四級(jí)結(jié)構(gòu)中，若亞基分子結(jié)構(gòu)相同，稱之為同二聚體(homodimer)，若亞基分子結(jié)構(gòu)不同，則稱之為異二聚體(heterodimer)。,血紅蛋白的四級(jí)結(jié)構(gòu),五、蛋白質(zhì)的分類,根據(jù)蛋白質(zhì)組成成分:,根據(jù)蛋白質(zhì)形狀:,蛋白質(zhì)的分子組成 蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu) 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì) 蛋白質(zhì)的分離純化與結(jié)構(gòu)分析,主要內(nèi)容：,天然狀態(tài)，有催化活性,尿素、 -巰基乙醇,去除尿素、 -巰基乙醇,非折疊狀態(tài)，無(wú)活性,（一）一級(jí)結(jié)構(gòu)是空間構(gòu)象的基礎(chǔ),核糖核酸酶,一級(jí)結(jié)構(gòu)相似的蛋白質(zhì)具有相似的結(jié)構(gòu)及功能, 氨基酸殘基序號(hào) 胰島素 A5 A6 A10 A30 人 Thr Ser Ile Thr 豬 Thr Ser Ile Ala 狗 Thr Ser Ile Ala 兔 Thr Gly Ile Ser 牛 Ala Gly Val Ala 羊 Ala Ser Val Ala 馬 Thr Ser Ile Ala ,一些廣泛存在于生物界的蛋白質(zhì)如細(xì)胞色素(cytochrome C)，比較它們的一級(jí)結(jié)構(gòu)，可以幫助了解物種進(jìn)化間的關(guān)系。,氨基酸序列提供重要的生物進(jìn)化信息,重要蛋白質(zhì)的氨基酸序列改變可引起疾病,例：鐮刀形紅細(xì)胞貧血,這種由蛋白質(zhì)分子發(fā)生變異所導(dǎo)致的疾病，稱為“分子病”。,血紅素與氧結(jié)合后，鐵原子半徑變小，就能進(jìn)入卟啉環(huán)的小孔中，繼而引起肽鏈位置的變動(dòng)。,二、蛋白質(zhì)的功能依賴特定空間結(jié)構(gòu),別構(gòu)效應(yīng)(allosteric effect),蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)的改變伴隨其功能的變化，稱為別構(gòu)效應(yīng)。,二、蛋白質(zhì)的功能依賴特定空間結(jié)構(gòu),協(xié)同效應(yīng)(cooperativity),一個(gè)寡聚體蛋白質(zhì)的一個(gè)亞基與其配體結(jié)合后，能影響此寡聚體中另一個(gè)亞基與配體結(jié)合能力的現(xiàn)象，稱為協(xié)同效應(yīng)。 如果是促進(jìn)作用則稱為正協(xié)同效應(yīng) (positive cooperativity) 如果是抑制作用則稱為負(fù)協(xié)同效應(yīng) (negative cooperativity),二、蛋白質(zhì)的功能依賴特定空間結(jié)構(gòu),血紅素與氧結(jié)合后，鐵原子半徑變小，就能進(jìn)入卟啉環(huán)的小孔中，繼而引起肽鏈位置的變動(dòng)。,二、蛋白質(zhì)的功能依賴特定空間結(jié)構(gòu),亞基,配體,（三）蛋白質(zhì)構(gòu)象改變可引起疾病,蛋白質(zhì)構(gòu)象疾病：若蛋白質(zhì)的折疊發(fā)生錯(cuò)誤，盡管其一級(jí)結(jié)構(gòu)不變，但蛋白質(zhì)的構(gòu)象發(fā)生改變，仍可影響其功能，嚴(yán)重時(shí)可導(dǎo)致疾病發(fā)生。,這類疾病包括：人紋狀體脊髓變性病、老年癡呆癥、亨停頓舞蹈病、瘋牛病等。,蛋白質(zhì)的分子組成 蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu) 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì) 蛋白質(zhì)的分離純化與結(jié)構(gòu)分析,主要內(nèi)容：,一、蛋白質(zhì)具有兩性電離的性質(zhì),蛋白質(zhì)分子除兩端的氨基和羧基可解離外，氨基酸殘基側(cè)鏈中某些基團(tuán)，在一定的溶液pH條件下都可解離成帶負(fù)電荷或正電荷的基團(tuán)。,當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)溶液處于某一pH時(shí)，蛋白質(zhì)解離成正、負(fù)離子的趨勢(shì)相等，即成為兼性離子，凈電荷為零，此時(shí)溶液的pH稱為蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。,蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)( isoelectric point, pI),二、蛋白質(zhì)具有膠體性質(zhì),蛋白質(zhì)屬于生物大分子之一，分子量可自1萬(wàn)至100萬(wàn)之巨，其分子的直徑可達(dá)1100nm，為膠粒范圍之內(nèi)。,顆粒表面電荷 水化膜,蛋白質(zhì)膠體穩(wěn)定的因素:,水化膜,帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì),溶液中蛋白質(zhì)的聚沉,三、蛋白質(zhì)空間結(jié)構(gòu)破壞而引起變性,在某些物理和化學(xué)因素作用下，其特定的空間構(gòu)象被破壞，也即有序的空間結(jié)構(gòu)變成無(wú)序的空間結(jié)構(gòu)，從而導(dǎo)致其理化性質(zhì)改變和生物活性的喪失。,蛋白質(zhì)的變性(denaturation),造成變性的因素: 如加熱、乙醇等有機(jī)溶劑、強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、重金屬離子及生物堿試劑等 。,應(yīng)用舉例: 臨床醫(yī)學(xué)上，變性因素常被應(yīng)用來(lái)消毒及滅菌。 此外, 防止蛋白質(zhì)變性也是有效保存蛋白質(zhì)制劑（如疫苗等）的必要條件。,若蛋白質(zhì)變性程度較輕，去除變性因素后，蛋白質(zhì)仍可恢復(fù)或部分恢復(fù)其原有的構(gòu)象和功能，稱為復(fù)性(renaturation) 。,天然狀態(tài)，有催化活性,尿素、 -巰基乙醇,去除尿素、 -巰基乙醇,非折疊狀態(tài)，無(wú)活性,核糖核酸酶,在一定條件下，蛋白疏水側(cè)鏈暴露在外，肽鏈融會(huì)相互纏繞繼而聚集，因而從溶液中析出。 變性的蛋白質(zhì)易于沉淀，有時(shí)蛋白質(zhì)發(fā)生沉淀，但并不變性。,蛋白質(zhì)變性后的絮狀物加熱可變成比較堅(jiān)固的凝塊，此凝塊不易再溶于強(qiáng)酸和強(qiáng)堿中。,蛋白質(zhì)沉淀,蛋白質(zhì)的凝固作用(protein coagulation),四、蛋白質(zhì)在紫外光譜區(qū)有特征性吸收峰,由于蛋白質(zhì)分子中含有共軛雙鍵的酪氨酸和色氨酸，因此在280nm波長(zhǎng)處有特征性吸收峰。蛋白質(zhì)的A280與其濃度呈正比關(guān)系，因此可作蛋白質(zhì)定量測(cè)定。,蛋白質(zhì)經(jīng)水解后產(chǎn)生的氨基酸也可發(fā)生茚三酮反應(yīng)。,蛋白質(zhì)和多肽分子中肽鍵在稀堿溶液中與硫酸銅共熱，呈現(xiàn)紫色或紅色，此反應(yīng)稱為雙縮脲反應(yīng)，雙縮脲反應(yīng)可用來(lái)檢測(cè)蛋白質(zhì)水解程度。,五、應(yīng)用蛋白質(zhì)呈色反應(yīng)可測(cè)定蛋白質(zhì)溶液含量,茚三酮反應(yīng)(ninhydrin reaction),雙縮脲反應(yīng)(biuret reaction),蛋白質(zhì)的分子組成 蛋白質(zhì)的分子結(jié)構(gòu) 蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系 蛋白質(zhì)的理化性質(zhì) 蛋白質(zhì)的分離純化與結(jié)構(gòu)分析,主要內(nèi)容：,一、透析及超濾法可去除蛋白質(zhì)溶液中的小分子化合物,應(yīng)用正壓或離心力使蛋白質(zhì)溶液透過(guò)有一定截留分子量的超濾膜，達(dá)到濃縮蛋白質(zhì)溶液的目的。,透析(dialysis),超濾法,利用透析袋把大分子蛋白質(zhì)與小分子化合物分開(kāi)的方法。,二、丙酮沉淀、鹽析及免疫沉淀是常用的蛋白質(zhì)濃縮方法,使用丙酮沉淀時(shí)，必須在04低溫下進(jìn)行，丙酮用量一般10倍于蛋白質(zhì)溶液體積。蛋白質(zhì)被丙酮沉淀后，應(yīng)立即分離。除了丙酮以外，也可用乙醇