DB33T624-2006動物組織中特布他林、克倫特羅、沙丁胺醇和萊克多巴胺殘留量的測定氣相色譜-質譜法.doc

GB/T DB33浙江省質量技術監(jiān)督局 發(fā)布2007-01-14實施2006-12-14發(fā)布動物組織中特布他林、克倫特羅、沙丁胺醇和萊克多巴胺殘留量的測定氣相色譜-質譜法Determination of the residues of terbutaline, clenbuterol, salbutamoland ractopamine in animal tissuesGas chromatography-mass spectrometry methodDB33/T 6242006浙江省地方標準ICS 67.120C 536DB33/T 6242006前 言本標準是在參閱了國內外文獻的基礎上，根據(jù)我國技術發(fā)展水平研究制定的，建立了氣相色譜-質譜法測定動物組織中特布他林、克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺等4種2-興奮劑殘留的方法。本標準附錄A、附錄B為資料性附錄。本標準由浙江省農(nóng)業(yè)廳提出并歸口。本標準起草單位：浙江省畜產(chǎn)品質量安全檢測中心、浙江省疾病預防控制中心。本標準主要起草人：陳慧華、應永飛、吳平谷、任玉琴、陸春波、陳勇、周文海、林仙軍、趙永信。I動物組織中特布他林、克倫特羅、沙丁胺醇和萊克多巴胺殘留量的測定 氣相色譜-質譜法1 范圍本標準規(guī)定了氣相色譜質譜（GCMS）法測定動物組織中特布他林、克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺等4種2-興奮劑殘留量的方法。本標準適用于畜禽肌肉、肝臟、肺、腎等組織中特布他林、克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺等4種2-興奮劑殘留量的測定。本方法檢測限為：特布他林1.0g/kg、克倫特羅2.0g/kg、沙丁胺醇1.0g/kg、萊克多巴胺2.0g/kg。2 規(guī)范性引用文件下列文件中的條款通過本標準的引用而成為本標準的條款。凡是注日期的引用文件，其隨后所有的修改單（不包括勘誤的內容）或修訂版均不適用于本標準，然而，鼓勵根據(jù)本標準達成協(xié)議的各方研究是否可使用這些文件的最新版本。凡是不注日期的引用文件，其最新版本適用于本標準。GB/T 6682 分析實驗室用水規(guī)格和試驗方法3 方法原理試樣加入內標物后，用甲醇提取和離子交換固相萃取柱凈化，氮氣吹干，與N，O-雙三甲基硅烷三氟乙酰胺（BSTFA）進行衍生化反應，于氣相色譜質譜儀上進行測定。內標法定量。 4 試劑和溶液所有試劑，如未注明規(guī)格，均指分析純；所有實驗室用水為去離子水，應符合GB/T 6682二級水的規(guī)定。4.1 甲醇4.2 乙酸乙酯：色譜純4.3 氨水4.4 鹽酸4.5 0.2mol/L鹽酸溶液：取鹽酸（4.4）9mL，加水至500mL，搖勻，即得。4.6 30mmol/L鹽酸溶液：取0.2mol/L鹽酸溶液（4.5）15mL，加水至100mL，搖勻，即得。4.7 無水硫酸鈉：450干燥12h，備用。4.8 正己烷4.9 甲苯：色譜純4.10 衍生劑：N，O-雙三甲基硅烷三氟乙酰胺（BSTFA）4.11 4氨水/乙酸乙酯溶液：取氨水（4.3）4mL加乙酸乙酯（4.2）至100mL，超聲15min，充分混勻，即配即用。4.12 SLS陽離子交換固相萃取柱1)：每根柱填料量為400mg，柱體積5mL。4.13 標準品：特布他林、克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺，純度98%。4.14 同位素內標物：D9-克倫特羅100g/mL，D3-沙丁胺醇100g/mL。4.15 2-興奮劑標準儲備液：取特布他林、克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺標準品（4.13）10mg，1)SLS陽離子交換固相萃取柱是由杭州富?？萍挤沼邢薰咎峁┑漠a(chǎn)品的商品名稱，給出這一信息是為了給本標準的使用者提供方便，而不是主管部門對這一產(chǎn)品的認可。精密稱定，分別置100mL容量瓶中，用甲醇溶解并定容至刻度，其濃度均為0.1mg/mL，置-20以下冰箱中保存，有效期為6個月。4.16 2-興奮劑混合標準工作液：分別準確吸取適量的2-興奮劑標準儲備液（4.15）于同一容量瓶中，用甲醇稀釋成含特布他林、克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺均為1.0g/mL的混合標準工作液，置48冰箱中保存，有效期為1個月。4.17 2-興奮劑內標工作液：分別準確吸取適量的2-興奮劑同位素內標物（4.14）于同一容量瓶中，用甲醇稀釋成含D9-克倫特羅、D3-沙丁胺醇均為1.0g/mL混合內標工作液，置48冰箱中保存，有效期為1個月。5 儀器設備5.1 氣相色譜-質譜儀：配有電子轟擊（EI）源。5.2 離心機：最大轉速9000r/min或以上。5.3 組織絞碎機。5.4 組織勻漿機：最大轉速10000r/min或以上。5.5 分液漏斗：125 mL。5.6 具塞玻璃試管：5mL，10mL。5.7 渦旋混合器。5.8 分析天平：感量0.00001g，0.01g。5.9 超聲波清洗器。5.10 離心管：50mL，10mL。5.11 氮吹儀。5.12 移液器：量程20L200L，100L1000L。6 分析步驟6.1 試樣制備取有代表性的樣品，經(jīng)絞碎后，保存于-20冰箱中，備用。6.2 試樣提取稱取試樣5g（精確到0.01g），置于50mL離心管中，加2-興奮劑內標工作液（4.17）50L；加甲醇20mL，10000r/min以上均質60s，加蓋，于60超聲波清洗器中超聲20min；取出離心管，冷卻后8000r/min離心10min，傾出上清液至分液漏斗中，另取甲醇10mL重復提取一次，合并上清液；加正己烷20mL脫脂一次，分離甲醇相，在60下氮氣吹至2mL以下；加0.2mol/L鹽酸（4.5）3mL，充分混勻后，在9000r/min離心10min，分出上清液，備用。6.3 試樣凈化依次用甲醇5mL、水5mL、30mmoL/L鹽酸溶液（4.6）5mL潤洗陽離子交換固相萃取柱（4.12），取6.2上清液過柱，棄去流出液，并依次用水5mL和甲醇5mL淋洗柱子，抽干；用4氨水/乙酸乙酯溶液（4.11）10mL洗脫，收集洗脫液，經(jīng)無水硫酸鈉（4.7）脫水，50氮氣吹干；殘余物中加乙酸乙酯5mL，置于超聲波清洗器中超聲5min，5000r/min離心5min，分出上清液至5mL具塞玻璃試管中，50氮吹至干，吹干物備用。6.4 衍生化 吹干物加入甲苯（4.9）100L和衍生劑（4.10）100L，加塞后于渦旋混合器充分混勻，在805的烘箱中恒溫衍生60min，氮氣吹干，加甲苯0.5mL溶解供GC-MS分析。另取2-興奮劑混合標準工作液（4.16）適量，加2-興奮劑內標工作液（4.17）50L，加乙酸乙酯5mL后，氮氣吹干，與樣品同步進行衍生化。6.5 儀器測定6.5.1色譜條件 色譜柱：5%苯基甲基聚硅氧烷彈性石英毛細管柱(30 m0.25 mm0.25m)，或具同等性能的色譜柱；進樣口溫度：280；柱溫程序：初溫120，保持3 min，然后以10min升至230，保持5min，再以10min升至280保持3min； 載氣：高純氦氣（99.999%）；流速：1.0mL/min，不分流進樣；進樣量：2.0L。6.5.2質譜條件 EI源：源溫230； 電子能量：70eV； 接口溫度：280； 電子倍增器電壓：高于調諧電壓200V； 質量掃描范圍：30550U；溶劑延遲：10min ；選擇離子監(jiān)測方式（SIM）。監(jiān)測離子（m/z）：特布他林86、356*、426；克倫特羅86*、262、243；沙丁胺醇369*、440、207；萊克多巴胺179、250*、502；D9-克倫特羅95*、262；D3-沙丁胺醇372*、443；其中帶*離子為定量離子，分三段進行采集，特布他林、克倫特羅、D9-克倫特羅為第階段，沙丁胺醇、D3-沙丁胺醇為第階段萊克多巴胺第階段，詳見表1。在上述色譜條件下，標準物質總離子流圖參見附錄A；標準物質質譜圖參見附錄B。表1 4種2-興奮劑和2種內標物的保留時間和質譜條件藥物名稱采集階段選擇離子（m/z）定量離子（m/z）特布他林356，86，426356克倫特羅86, 243, 26286D9-克倫特羅95，26295沙丁胺醇369，207，440369D3-沙丁胺醇372，443372萊克多巴胺250, 179, 5022506.5.3 氣相色譜-質譜測定6.5.3.1 定性方法在相同試驗條件下，樣品中待測物與同時檢測的標準物質的保留時間之差在2s之內，并且所選擇的離子相對豐度比符合表2要求，可判定為樣品中存在該藥物殘留。表2 試樣離子豐度比與標準物質離子豐度比的允許偏差范圍占基峰相對豐度（）最大允許偏差（）501020501510202010506.5.3.2 定量方法以峰面積按內標法進行單點或多點校準定量，標準工作液和樣品液中藥物響應值均應在儀器檢測線性范圍內。以D9-克倫特羅（m/z 95）作為計算克倫特羅（m/z 86）和萊克多巴胺（m/z 250）濃度的內標物，以D3-沙丁胺醇（m/z 372）作為計算特布他林（m/z 356）和沙丁胺醇（m/z 369）濃度的內標物。7 結果計算按內標法單點或多點校準計算試樣中4種2-興奮劑的含量。試樣中4種2-興奮劑的含量按下式計算： AX D M式中：X試樣中2-興奮劑各組分的含量，g/kg；A試樣色譜峰對應的2-興奮劑各組分的質量，ng； M試樣質量，g；D稀釋倍數(shù)；計算結果保留3位有效數(shù)字。8 精密度在重復性條件下獲得的兩次獨立測定結果的絕對差值與算術平均值之比應不大于20。9 回收率本方法回收率在60130之間。124,563附錄A(資料性附錄) 標準物質總離子流圖圖A.1 2-興奮劑和內標物衍生物的總離子流（TIC）圖1. 特布他林（