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第五章 維生素類藥物的分析 The Analysis of Vitamines,維生素是維持人體正常生理機(jī)能所必需的生物活性物質(zhì)。 如果人體缺少某種維生素,就會引起維生素缺乏癥,而影響人體的正常生理機(jī)能。 例如: VA 缺乏夜盲癥 VB1缺乏腳氣病,概 述,脂溶性: 水溶性:,按溶解性分類,VA、VD、VE、VK等,B族(VB1、VB2等)、 VC 、煙酸、葉酸、泛酸等,第一節(jié) 維生素A的分析,一結(jié)構(gòu)與性質(zhì) 1 化學(xué)結(jié)構(gòu),R=H VA醇 VA1 R= COCH3 VA醋酸酯 R= COC15H31 VA棕櫚酸酯,(1)環(huán)己烯+共軛多烯側(cè)鏈; (2)天然VA側(cè)鏈為全反式; (3)天然來源主要是魚肝油,為醋 酸酯,棕櫚酸酯等,目前多由人 工合成。,結(jié)構(gòu)特點(diǎn):,a. 紫外吸收 具有共軛多烯側(cè)鏈紫外吸收。 最大吸收波長在325328nm,隨VA存在狀態(tài)以及所用的溶劑,最大吸收波長的位置有所不同,2 .性質(zhì), 不溶于水 溶于乙醚,氯仿,異丙醇,環(huán)己烷,脂肪和油。,b.溶解性:,共軛多烯側(cè)鏈性質(zhì)非?;顫?,c. 不穩(wěn)定性,維生素A的氧化產(chǎn)物:,環(huán)氧化物, 維生素A醛, 維生素A酸,or, 鑒別 含量測定,d.與SbCl3作用 Carr-Price反應(yīng),無水,二. 鑒別試驗 1. 三氯化銻反應(yīng),無水,2. 紫外吸收光譜 VA的無水乙醇溶液在326nm有最 大吸收。,確認(rèn)醇或酯,是醋酸酯或其他酸酯, 例:VA和其標(biāo)準(zhǔn)品用環(huán)己烷溶解 展開劑:環(huán)己烷乙醚(80:20) 板:硅膠G 顯色:SbCl3T.S. Rf: VA 醇 0.08 VA 醋酸酯 0.41 VA棕櫚酸酯 0.75,3、TLC:,三含量測定,1.概述 共軛多烯的結(jié)構(gòu)具有特征的紫外吸收。 相關(guān)物質(zhì)結(jié)構(gòu)相似,維生素A最大吸收 波長附近也有吸收,對測定有影響。 Morton和Stubbs等人提出了三點(diǎn)校正法。,紫外分光光度法三點(diǎn)校正法,2. 原理(根據(jù)、假定),物質(zhì)對光的吸收具有加和性,即,維生素A中的不相關(guān)吸收在 310340nm范圍內(nèi)近似一條直線。,效價為維生素A1的40%,max345350nm,3. 相關(guān)物質(zhì)的吸收,a. 維生素A的衍生物,維生素A2 去氫維生素A,效價低于維生素A1,max385390nm, b. 維生素A的氧化產(chǎn)物 已介紹。,維生素A3 去水維生素A, c. 合成時的中間體,側(cè)連有4個雙鍵應(yīng)有 種異構(gòu)體。 目前,包括維生素A在內(nèi),共發(fā)現(xiàn)有 6種異 構(gòu)體。它們是:, e. 維生素A異構(gòu)體, d. 鯨醇 維生素A醇的二聚體,沒有生物活性,新維生素Aa,新維生素Ab,新維生素Ac,異維生素Aa,異維生素Ab,維生素A,1:維生素A的max 2、3:分別在1兩側(cè),4. 三個波長的選擇方法,等波長差法:,1=328nm; 2 =316nm; 3=340nm,這兩個波長分別在1兩側(cè)12nm處,即,等吸光度法:,1=325nm; 2 =310nm; 3=334nm,VA在這兩個波長下的吸光度應(yīng)該等于1下 的吸光度的 ,即,5. 方法,Chp收載有2種方法。,第一法(適用于酯式維生素A的測定),a. 操作方法,最大吸收波長確認(rèn) max 在326329nm,第一法測定。 max不在326329nm,第二法測定。,b. 計算方法,計算吸收度比及比值差,首先要計算吸收度比值 。,然后計算吸收度的比值差。,計算校正吸收度,吸收度校正公式:,換算因數(shù),定義:每一個 數(shù)值所相當(dāng)?shù)男r。,1IU=0.344g全反式維生素A醋酸酯, 1g的維生素A醋酸酯就相當(dāng)于,維生素A醋酸酯,練習(xí)題:維生素AD膠丸中維生素A的含量測定 已知:平均膠丸重為0.0815g 維生素A的標(biāo)示量為10000IU/丸 取樣:,求:維生素A的標(biāo)示百分含量。,測定數(shù)據(jù)如下表,首先要求樣品的 。,根據(jù)比爾定律,A為測得吸收度or校正吸收度,首先計算吸收度比值和吸收度比值差。(填于上表),由此可知,應(yīng)該用測得的328nm處的吸收度計算。,然后計算校正吸收度與未校正吸收度相差的百分?jǐn)?shù),由結(jié)果知,需計算校正吸收度。,所以,維生素A的標(biāo)示含量,這樣,第二法(皂化法): 消除植物油干擾:適合VA醇,b.在300,310,325和334nm處測定吸收度,找出max c.計算 d.校正公式 A325(校)=6.815A325-2.555A310- 4.260A334 e. 判斷,5、注意事項 (1)VA遇光易氧化變質(zhì),操作應(yīng)半暗室 中快速進(jìn)行,所用試劑不得含氧化性物 質(zhì),以防VA紫外線或氧化性物質(zhì)破壞。,(2)用三校正法測定時,一點(diǎn)在max處,其余兩點(diǎn)均為吸收曲線的上升和下降陡坡處。對波長的正確性要求嚴(yán)格。340nm處,若波長誤差0.5nm,可影響結(jié)果-3.12.07%。所以測定時所用儀器的波長讀數(shù)應(yīng)注意,必要時應(yīng)作標(biāo)準(zhǔn)。,維生素A醋酸酯膠丸含量測定:取內(nèi)容物39.1 mg,加環(huán) 己烷溶解并稀釋成100ml,在下列五個波長處測得吸 收度A值如下:,已知:平均膠丸內(nèi)容物重為0.08736g;維生素A的標(biāo)示量為3000 IU/丸 試求:維生素A的標(biāo)示百分含量?,維生素A醋酸酯膠丸的含量測定,取內(nèi)容物W,加環(huán)己烷溶解并稀釋至10ml,搖勻,精密量取0.1ml,再加環(huán)己烷稀釋至10ml ,使其濃度為915IU/ml。已知內(nèi)容物平均重量為80.0mg,每丸標(biāo)示量為10000IU。試計算取樣量( W )的范圍是多少?,第二節(jié) 維生素E的分析,名稱:消旋生育酚醋酸酯 母核:苯駢二氫吡喃衍生物 苯環(huán)上有一乙?;姆恿u基 側(cè)鏈:脂肪烷烴,一化學(xué)結(jié)構(gòu)與性質(zhì),二、鑒別試驗 1、硝酸反應(yīng): 本品,無水乙醇溶解,加硝酸,75加熱約15分鐘,顯橙紅色。 2、水解后氧化反應(yīng): 本品,在堿性條件下水解,得生育酚,在聯(lián)吡啶和三氯化鐵試液的作用下,反應(yīng)產(chǎn)生血紅色配離子。,3、UV吸收: VE的0.01%無水乙醇液: max=284nm min=254nm,三、雜質(zhì)檢查 檢查游離生育酚: ChP2000 P798 取0.1g樣品,按鈰量法用Ce(SO4)2(0.01mol/L)滴定,以二苯胺為 指示劑,消耗Ce(SO4)2液不得超過1.0ml。,(一)鈰量法 1、原理: VE用硫酸加熱回流,水解成生育酚,用硫酸鈰定量地氧化為對一生育醌,過量的硫酸鈰氧化二苯胺指示劑而指示滴定終點(diǎn)。 終點(diǎn):亮黃灰紫 空白試驗,四、含量測定,2、反應(yīng)條件 (1)VE在H2SO4酸性條件下水解為宜。 堿性溶液中游離生育酚易被氧化。Ce(SO4)2液滴定在酸性溶液中進(jìn)行,如在堿性中會生成堿式鹽而影響測定。,(2)Ce(SO4)2溶于酸水溶液,不溶于醇,生育酚溶于酸而不溶于水, 滴定過程中應(yīng)有一定濃度的乙醇。 (3)本法適用于純度高的VE供試品。,(二)氣相色譜法:Chp2000 1、色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗 色譜柱:2m4mmI.D.硼硅玻璃柱, 內(nèi)裝硅藻土(80100目) 固定相:硅酮(OV-17) 涂布濃度 2% 載氣:N2, 流速:含2%固定相:以1820分鐘為宜; 含5%固定相:以3032分鐘為宜,柱溫:265 內(nèi)標(biāo):正三十二烷 檢測器:FID(氫火焰離子化檢測器) 性能要求: 理論塔板數(shù)按VE峰計算應(yīng)不低于500, VE峰與內(nèi)標(biāo)物質(zhì)峰的分離度應(yīng)大于2。,2、溶液配制: 內(nèi)標(biāo)溶液:正三十二烷的環(huán)己烷溶液 (1.0mg/ml) 對照溶液:對照品溶解于內(nèi)標(biāo)溶液中 (1mg/ml) 供試品溶液:供試品約50mg,用內(nèi)標(biāo)溶液,溶解并稀釋至50ml,4、供試品測定 mg=FAxMs/As Ax :供試品峰面積 F:校正因子 As : 內(nèi)標(biāo)物的峰面積 5、特點(diǎn): (1)簡便快速、專屬性強(qiáng),適用于VE、VE制劑及多種維生素制劑中VE的測定。 (2)需要特殊儀器,(三)高效液相色譜法 日本藥局方(JP13) 色譜條件: 柱:ODS 流動相:甲醇水(49:1) 檢測波長:292nm 對照品法定量,第三節(jié) 維生素B1的分析,一、化學(xué)結(jié)構(gòu)與性質(zhì) 1.結(jié)構(gòu):,氯化3-(4-氨基-2-甲基嘧啶-5-)甲基-5-(2-羥乙基)-4-甲基噻唑的鹽酸鹽,2. 結(jié)構(gòu)特點(diǎn): a.氨基嘧啶次甲基噻唑環(huán)季銨化合物 b.堿性基團(tuán): 嘧啶環(huán)上的氨基 可與酸成鹽 噻唑環(huán)上的季銨,3. 性質(zhì): 硫色素反應(yīng) VB1噻唑環(huán)在堿性條件下可被鐵氰化鉀K3Fe(CN)6等一些氧化劑氧化后,與嘧啶環(huán)上的氨基縮合成具有熒光的硫色素。, 沉淀反應(yīng) VB1的含氮雜環(huán),能和生物堿沉淀試劑反應(yīng)產(chǎn)生沉淀。 如:VB1與硅鎢酸反應(yīng)可生成組成一定的沉淀。 重量法測定VB1含量。, 硫胺顯堿性 具有兩個堿性基團(tuán): 噻唑環(huán)上的季銨 嘧啶環(huán)上的氨基 可以和酸成鹽。 如:鹽酸硫胺、硝酸硫胺。, 加堿分解后與醋酸鉛反應(yīng) VB1與NaOH試液一起加熱,分解產(chǎn)生NaS,可與PbAc2反應(yīng)生成PbS的黑色沉淀。 維生素B1的水溶液顯氯化物的特征反應(yīng)。,二. 鑒別試驗,1. 硫色素?zé)晒夥磻?yīng),VB1專屬反應(yīng),用于鑒別和含量測定。,2、沉淀反應(yīng): 可與某些生物堿沉淀試劑生成組成恒定的 沉淀 如:與碘化汞鉀產(chǎn)生淡黃色沉淀 與碘生成紅色沉淀 與硅鎢酸生成白色沉淀 與苦味酸生成扇形白色結(jié)晶,三. 含量測定 非水滴定法(ChP所用方法) 硅鎢酸重量法 銀量法 硫色素?zé)晒夥?紫外分光光度法 比色法 絡(luò)合滴定法,(一)非水溶液滴定法: 1、原理: VB1分子中含有已成鹽的伯胺和季銨基團(tuán),在非水溶液中,在醋酸汞存在下,均可被高氯酸滴定。,2、方法: 溶劑:冰醋酸 指示劑:喹哪定紅- 亞甲藍(lán)混合指示液 滴定劑:高氯酸 醋酸汞: 終點(diǎn):天藍(lán)色 空白校正: T=16.86mg/ml,(二)硅鎢酸重量法,2VB1硅鎢酸,白色沉淀4HCl,1、原理: VB1在酸性溶液中與硅鎢酸作用 產(chǎn)生沉淀,根據(jù)沉淀的重量和供試品 的重量即可計算其含量。,2、計算: 2VB1的分子量為2337.27 沉淀的分子量為3479.22 換算因數(shù)=0.1939 (含義:1g沉淀相當(dāng)于0.1939gVB1),3、測定方法:,4、實驗條件 (1)取樣量: 應(yīng)在50mg左右,不得少于25mg。 (2)加入鹽酸的目的:易于過濾。 酸量不足:沉淀的顆粒過細(xì)。 酸量過多:無太大影響。,(3)硅鎢酸的用量: 硅鎢酸:VB1= 8:1 用量不足,導(dǎo)致結(jié)果偏低 (4)干燥溫度: 80,干燥3hr,至恒重,沉淀含4分子結(jié)晶水,換算因數(shù)為0.1939,(5)硅鎢酸的加入速度 用滴管一滴一滴加入,純度高快加,純度低慢加。 防止沉淀表面吸附的雜質(zhì)來不及離開而被沉淀包圍。 (6)煮沸時間 25min為宜 使沉淀顆粒大,利于過濾洗滌。,(7)沉淀的洗滌 用熱稀鹽酸洗滌,洗滌液用量不得多于50ml,否則,沉淀會部分溶解 (8)洗器 用4號垂熔玻璃漏斗為宜。,4、重量法特點(diǎn) (1)比較準(zhǔn)確、靈敏; (2)方法簡便,不需要特殊儀器; (3)恒重比較費(fèi)時間。,第四章 維生素C的分析 一. 化學(xué)結(jié)構(gòu),結(jié)構(gòu)特點(diǎn): 維生素C分子中具有2個手性C原子,具有4種光學(xué)異構(gòu)體。其中生理活性最強(qiáng)的是L(+)-抗壞血酸,D(-)-異抗壞血酸,L(+)-異抗壞血酸,L(+)-抗壞血酸,D(-)-抗壞血酸, 具有內(nèi)酯結(jié)構(gòu)。 堿性下可水解。 具有烯二醇基。 還原性,能夠被氧化成去氫抗 壞血酸。 酸性,能與堿成鹽。,二性質(zhì)與鑒別試驗 1. 酸性 烯二醇結(jié)構(gòu)酸性。 C3-OH, pKa=4.17(共軛效應(yīng)) C2-OH,pKa=11.57(鄰位羰基) 一元酸. 能與NaHCO3作用生成鈉鹽。,2.還原性 烯二醇基還原性。 如:,3. 水解反應(yīng),L-二酮古羅糖酸 (無生物活性),4. 熒光反應(yīng),5. 糖的性質(zhì) VC的結(jié)構(gòu)很象糖結(jié)構(gòu),具有糖的性質(zhì)。,這個反應(yīng)的摩爾比是12。,三含量測定,1. 碘量法,a. 原理,b. 操作,終點(diǎn)顏色:無色藍(lán)色 1ml 0.

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