熒光定量PCR和FISH技術(shù)診斷肺結(jié)核的價值比較.doc

熒光定量PCR和FISH技術(shù)診斷肺結(jié)核的價值比較 溫韻潔劉麗軍羅偉權(quán)林斌鄧永鍵 【摘要】目的比較熒光定量PCR和FISH技術(shù)對肺結(jié)核診斷的敏感性和特異性。方法共收集300例明確診斷為肺結(jié)核的患者作為陽性對照組，以及收集300例健康志愿者（明確排除肺結(jié)核患者）做為陰性對照組。收集800例新收臨床疑似肺結(jié)核患者做為研究組。收集該800例患者的肺活檢標本以及同期的痰液標本，其中痰液進行涂片、結(jié)核桿菌分離培養(yǎng)以及結(jié)核桿菌DNA熒光定量PCR檢測和FISH檢測。比較熒光定量PCR和FISH技術(shù)對肺結(jié)核診斷陽性符合率和陰性符合率。結(jié)果 FISH技術(shù)檢測結(jié)核桿菌陽性符合率為99.3%；熒光定量PCR檢測結(jié)核桿菌陽性符合率為97.3%。兩者陽性符合率存在統(tǒng)計學(xué)差別（p=0.015）。FISH技術(shù)檢測結(jié)核桿菌陰性符合率為98.2%，熒光定量PCR技術(shù)檢測結(jié)核桿菌陰性符合率為96.9%。兩者陰性符合率存在統(tǒng)計學(xué)差別（p=0.007）。結(jié)論與熒光定量PCR比較，F(xiàn)ISH對肺結(jié)核診斷具有較高的陽性符合率和陰性符合率。 【關(guān)鍵詞】肺結(jié)核熒光定量PCR熒光標記原位雜交技術(shù) doi:10.3969/j.issn.1671-332X.xx.11.031 結(jié)核病被列為我國重大傳染病之一，是嚴重危害人民群眾健康的呼吸道傳染病1-2。根據(jù)世界衛(wèi)生組織的統(tǒng)計，我國是全球22個結(jié)核病流行嚴重的國家之一，同時也是全球27個耐多藥結(jié)核病流行嚴重的國家之一3。近十余年來，隨著分子生物學(xué)的高速發(fā)展，以及檢測手段的提高、檢測軟件的不斷發(fā)展，基因診斷技術(shù)作為結(jié)核病非培養(yǎng)診斷技術(shù)是近年來結(jié)核病診斷的一項重大突破，具有特異、敏感、快速鑒定結(jié)核病的優(yōu)點。常規(guī)PCR技術(shù)、熒光定量PCR、巢式PCR等技術(shù)在結(jié)核病診斷中應(yīng)用的報道屢見不鮮。但PCR技術(shù)也存在不少的局限性，如由于該技術(shù)操作復(fù)雜，往往易造成細胞前處理受損，擴增過程的非特異性，使得檢測信號微弱，不易辨識，造成假陽性、假陰性結(jié)果等4-5。熒光標記原位雜交技術(shù)（FISH）是一種非放射性原位雜交技術(shù)，該技術(shù)的出現(xiàn)彌補了熒光定量PCR的不足之處，使之具有更深刻的應(yīng)用價值6-7。因此，本研究擬初步探討和比較熒光定量PCR技術(shù)和FISH技術(shù)對肺結(jié)核病診斷的敏感性和特異性，現(xiàn)報告如下。 1研究方法 1.1研究對象 患者收集時間為xx年1月xx年1月，共收集300例明確診斷為肺結(jié)核的患者做為陽性對照組，以及收集300例健康志愿者（明確排除肺結(jié)核患者）做為陰性對照組。收集800例新收臨床疑似肺結(jié)核患者做為研究組。收集該800例患者的肺活檢標本以及同期的痰液標本，其中痰液進行涂片、結(jié)核桿菌分離培養(yǎng)以及結(jié)核桿菌DNA熒光定量PCR檢測，肺活檢標本經(jīng)過固定、脫水、包埋制成蠟塊，進行切片抗酸染色及結(jié)核桿菌FISH檢測。 1.2研究方法 探針的制備優(yōu)化：根據(jù)NCBI報道的人源結(jié)核桿菌基因序列，選取結(jié)核桿菌Ag85A基因（GenBank編號：NC-000962）及IS6110基因（GenBank編號：NC-002944）作為靶序列，結(jié)合運用primer5.0、oligo6.0和Primerexpress2.0軟件，設(shè)計出兩組結(jié)核桿菌特異性探針引物（引物序列具體見表1），將兩組引物及其擴展產(chǎn)物放入NCBI作BLAST進行同源性分析，結(jié)果顯示與其它基因序列異源，從而避免了雜交時非特異性的存在。引物由生工生物工程（上海）有限公司合成。FISH檢測流程的優(yōu)化：操作方法參照FluorescenceinSituHybridizationTechnology(BarbaraBeatty等，美國)，針對FISH技術(shù)關(guān)鍵步驟進行反應(yīng)條件的摸索優(yōu)化。所有800例試驗組人群同時還進行痰液涂片檢查、痰液結(jié)核桿菌分離培養(yǎng)、痰液結(jié)核桿菌DNA熒光定量PCR檢測。 1.3熒光定量PCR檢測 使用達安基因股份有限公司的結(jié)核桿菌（TB）核酸擴增PCR熒光檢測試劑盒（Cat.#DA-052），對痰液標本進行結(jié)核桿菌核酸檢測，主要采用胰酶消化法對痰液標本進行消化處理，處理完成后提取結(jié)核桿菌基因組DNA，用熒光定量PCR進行結(jié)核桿菌DNA的擴增檢測，操作步驟按照試劑盒的說明進行。 1.4統(tǒng)計分析 將痰液涂片檢查、痰液結(jié)核桿菌分離培養(yǎng)、痰液結(jié)核桿菌DNA熒光定量PCR檢測、肺組織病理標本抗酸染色、結(jié)核桿菌FISH檢測結(jié)果均為陽性者定義為陽性，結(jié)果均為陰性者定義為陰性，其他情況均定義為可疑。陽性符合率：依據(jù)上述定義，結(jié)核桿菌FISH檢測的陽性符合率=結(jié)核桿菌FISH檢測陽性數(shù)/所有標本檢測陽性數(shù)。陰性符合率依據(jù)上述定義，結(jié)核桿菌FISH檢測的陰性符合率=結(jié)核桿菌FISH檢測陰性數(shù)/所有標本檢測陰性數(shù)。采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，定量資料采用均數(shù)標準差表示，定性資料采用百分率表示，組間比較采用t-檢驗或卡方檢驗，p0.05表示差別具有統(tǒng)計學(xué)意義。 2結(jié)果 2.1FISH技術(shù)和熒光定量PCR檢測結(jié)核桿菌陽性符合率 300例明確診斷為肺結(jié)核患者，298例患者FISH檢測為陽性。另外800例臨床可疑為肺結(jié)核患者中，依據(jù)痰液涂片檢查、痰液結(jié)核桿菌分離培養(yǎng)檢測診斷為肺結(jié)核患者共有378例，其中375例FISH結(jié)果為陽性，因此，F(xiàn)ISH技術(shù)檢測結(jié)核桿菌陽性符合率為99.3%（298+375）/（300+378）。300例明確診斷為肺結(jié)核患者，290例患者熒光定量PCR檢測為陽性。另外800例臨床可疑為肺結(jié)核患者中，依據(jù)痰液涂片檢查、痰液結(jié)核桿菌分離培養(yǎng)檢測診斷為肺結(jié)核患者共有378例，其中370例熒光定量PCR結(jié)果為陽性，因此，熒光定量PCR檢測結(jié)核桿菌陽性符合率為97.3%（290+370）/（300+378）。卡方檢驗比較FISH技術(shù)和熒光定量PCR檢測技術(shù)得陽性符合率存在統(tǒng)計學(xué)差別（X2=3.678，p=0.015）。 2.2FISH技術(shù)和熒光定量PCR檢測結(jié)核桿菌陰性符合率 300例明確排除肺結(jié)核患者中，有5例FISH檢測為陽性。另外800例臨床可疑為肺結(jié)核患者中，依據(jù)痰液涂片檢查、痰液結(jié)核桿菌分離培養(yǎng)、痰液結(jié)核桿菌DNA熒光定量PCR檢測排除為肺結(jié)核患者共有422例，其中8例FISH結(jié)果為陽性，因此，F(xiàn)ISH技術(shù)檢測結(jié)核桿菌陰性符合率為98.2%（295+414）/（300+422）。300例明確排除肺結(jié)核患者中，有9例熒光定量PCR檢測為陽性。另外800例臨床可疑為肺結(jié)核患者中，依據(jù)痰液涂片檢查、痰液結(jié)核桿菌分離培養(yǎng)檢測排除為肺結(jié)核患者共有422例，其中13例熒光定量PCR結(jié)果為陽性，因此，熒光定量PCR技術(shù)檢測結(jié)核桿菌陰性符合率為96.9%（291+409）/（300+422）?？ǚ綑z驗比較FISH技術(shù)和熒光定量PCR檢測技術(shù)得陰性符合率存在統(tǒng)計學(xué)差別（X2=5.065，p=0.007）。 3討論 衛(wèi)生部全國第五次結(jié)核病流行病學(xué)抽樣調(diào)查結(jié)果顯示，目前我國結(jié)核病年發(fā)病人數(shù)約為130萬，占全球發(fā)病的14.3%，位居全球第2位。xxxx年，全國共發(fā)現(xiàn)和治療肺結(jié)核患者828萬例，其中傳染性肺結(jié)核患者450萬例89。結(jié)核病是一種慢性傳染病，其發(fā)病規(guī)律和流行特點決定了在今后相當長的時期內(nèi)其危害將持續(xù)存在。傳統(tǒng)上診斷肺結(jié)核，有三種途徑：痰液及病變組織中查出結(jié)核桿菌；結(jié)核的病理組織常規(guī)檢查；胸部X線檢查，但該方法不能確診肺結(jié)核，因為肺部其他疾病，如肺炎、肺寄生蟲病、肺部腫瘤等病變也可出現(xiàn)類似肺結(jié)核病變的肺部X線影像學(xué)表現(xiàn)，單憑X線檢查，許多患者會誤診誤治，不但給患者造成經(jīng)濟上的損失，還會導(dǎo)致病情惡化。 熒光定量PCR技術(shù)和FISH技術(shù)是近年來新開展的用于檢測肺結(jié)核的新技術(shù)，但兩種技術(shù)對肺結(jié)核診斷的陽性符合率和陰性符合率是否存在差別目前未見文獻報道。本研究結(jié)果表明，與傳統(tǒng)檢測方法相比，熒光定量PCR技術(shù)和FISH技術(shù)均具有較高的陽性符合率和陰性符合率10-11。以此同時，與熒光定量PCR技術(shù)相比較，F(xiàn)ISH技術(shù)的陽性符合率和陰性符合率更高，差別具有統(tǒng)計學(xué)意義。我們認為這可能與如下因素有關(guān)12-15：（1）熒光定量PCR檢測結(jié)核桿菌作為快速診斷技術(shù)已普遍應(yīng)用于臨床，具有高特異性和敏感性，由于該技術(shù)操作復(fù)雜，往往易造成細胞前處理受損，擴增過程的非特異性，使得檢測信號微弱，不易辨識，造成假陽性、假陰性結(jié)果；（2）FISH技術(shù)是一種非放射性原位雜交技術(shù)，具有以下優(yōu)點：熒光試劑和探針經(jīng)濟、安全；探針穩(wěn)定，一次標記后可在兩年內(nèi)使用；實驗周期短，能迅速得到結(jié)果，特異性好，定位準確；FISH可定位長度在1kb的DNA序列，其靈敏度與放射性探針相當；多色FISH通過在同一個核中顯示不同的顏色可同時檢測多種序列；針對染色體的檢查既可以在玻片上顯示中期染色體數(shù)量或結(jié)構(gòu)的變化，也可以在懸液中顯示間期染色體DNA的結(jié)構(gòu)。 綜上所述，本研究結(jié)果表明，與傳統(tǒng)檢測方法以及熒光定量PCR比較，F(xiàn)ISH對肺結(jié)核診斷具有較高的陽性符合率和陰性符合率，值得臨床推廣。 參考文獻 1黃齊華.xx-xx年欽州市欽北區(qū)肺結(jié)核流行病學(xué)分析J.應(yīng)用預(yù)防醫(yī)學(xué),xx(1):32-34. 2桑春立,成洪旗,于秋燕,等.1997xx年濟南市肺結(jié)核疫情資料分析J.預(yù)防醫(yī)學(xué)論壇,xx(9):701-702. 3吳文娟,涂超,謝碧榮.肺結(jié)核并發(fā)急性呼吸窘迫綜合征的臨床分析J.臨床肺科雜志,xx(2):217-218. 4楊長紹,王麗,潘鑫艷,等.熒光定量PCR檢測石蠟組織中結(jié)核分枝桿菌J.臨床與實驗病理學(xué)雜志,xx(3):321-323. 5巢薇,盛慧琴,楊柳光.熒光定量PCR技術(shù)在結(jié)核桿菌檢測中的初步探討J.實用醫(yī)技雜志,xx(1):55. 6PODRIADCHIKOVAOL,PRISTIAZHNIUKIE,MATVEEVANM,etal.FISH-analysisofregionalreplicationinhomologouschromosomesinhybridcellsobtainedbyfusionofembryonicstemcellswithsomaticcellsJ.Tsitologiia,xx,51(6):500-505. 7QINYW,JIANGY,WANGXR,etal.ComparisonofSTR-PCRandFISHvalueformonitoringchimerismaftersex-mismatchedallogeneichematopoieticstemcelltransplantationJ.ZhongguoShiYanXueYeXueZaZhi,xx,17(4):1016-1020. 8朱倬敏.肺結(jié)核合并糖尿病60例臨床預(yù)后效果分析J.醫(yī)學(xué)理論與實踐,xx(3):332-333. 9唐軍.纖維支氣管鏡介入治療耐多藥肺結(jié)核60例臨床研究J.中國社區(qū)醫(yī)師:醫(yī)學(xué)專業(yè),xx(5):75-76. 10王旭洲,謝飛來,鄭智勇.熒光定量PCR檢測結(jié)核/非結(jié)核分枝桿菌在肉芽腫病理診斷中的應(yīng)用J.臨床與實驗病理學(xué)雜志,xx,29(8):884-887,891. 11朱明利,張永樂,張利誠,等.肺結(jié)核患者結(jié)核菌L型感染及其熒光定量PCR檢測的意義J.中國實驗診斷學(xué),xx,12(5):632-635. 12曹冉冉,劉邦英,周子人,等.分子信標熒光定量PCR在肺結(jié)核早期診斷及療效評價中的初步應(yīng)用J.中國防癆雜志,xx,34(2):103-106. 13馬連學(xué),席云,吳麗霞,等.熒光定量PCR診斷肺結(jié)核的臨床應(yīng)用研究附179例檢測分析J.新醫(yī)學(xué),xx,40(3):166-168. 14VOSSJS,KIPPBR,CAMPIONMB,etal.Assessmentoffluorescenceinsituhybridizationandhybridcapture2analysesofcervicalcytologyspecimensdiagnosedaslowgradesquamousintraepitheliallesionforthedetectionofhighgradecervicalintraepithelialneoplasiaJ.Anal