南方紅豆杉水提物對人肺癌A549 細胞增殖抑制作用的研究.doc

南方紅豆杉水提物對人肺癌A549細胞增殖/抑制作用的研究舒琦瑾1李萍2王彬彬1朱國猛1（1浙江中醫(yī)藥大學附屬第一臨床醫(yī)學院腫瘤科，杭州310006；2杭州師范大學附屬醫(yī)院腫瘤科，杭州310015）摘要：目的研究南方紅豆杉水提物對人肺癌A549細胞增殖的抑制作用和機制。方法采用MTT法檢測南方紅豆杉水提物對A549細胞增殖的抑制作用；生長曲線法觀察其抑制A549細胞的時間-效應曲線；流式細胞儀檢測其對A549細胞周期及凋亡的影響；倒置顯微鏡及電鏡觀察其對A549細胞形態(tài)的影響。結果南方紅豆杉水提物對A549細胞的增殖有抑制作用；其抑制作用機制為使A549細胞周期出現(xiàn)明顯的G0/G1期阻滯，誘導細胞凋亡。結論南方紅豆杉水提物對人肺癌A549細胞的增殖有抑制作用。主題詞：南方紅豆杉；抑制作用；人肺癌A549細胞；細胞增殖StudyonInhibitoryActionofProliferationofhumanlungcarcinomaA549CellwithaqueousextractofTaxuschinensisShuQi-jin1,LiPing2,WangBin-bin1,ZhuGuo-meng11.DepartmentofOncology,theFirstAffiliatedHospital,ZhejiangUniversityofTraditionalChineseMedicine,Hangzhou310006,China2.DepartmentofOncology,theAffiliatedHospitalofHangzhouNormolUniversityHangzhou310015,ChinaCorresondingauthor:ShuQi-jin,E-mail:.Abstract：ObjectiveTostudytheinhibitoryeffectofaqueousextractofT.chinensisvaronvitroculturedhumanlungcarcinomaA549cell,andtoexploreitsmechanism.MethodsTheinhibitoryeffectofT.chinensisvaronhumanlungcarcinomaA549cellwastestedbyMTTmethod；time-effectrelationshipwasobservedbygrowthcurve；effectsonblockageofcellcycleandapoptosiswasinspectedbyflowcytometry；morphologyoftheA549cellwasobservedbyinversionmicroscopeandelectronmicroscope.ResultsTheaqueousextractofT.chinensisvarhasinhibitoryeffectontheproliferationofcellA549,andthemechanismrelatedtoblockingthecycleofcellA549atG0/G1periodandinducingapoptosisoftumorcell.ConclusionsTheaqueousextractofT.chinensisvarhasinhibitoryeffectontheproliferationofcellA549.Subjectwords：T.chinensisvar；inhibitoryeffect；humanlungcarcinomaA549cell紅豆杉是紅豆杉科紅豆杉屬植物總稱，是世界上公認的瀕臨滅絕的天然珍稀抗癌植物。基金項目：浙江省自然基金項目（NO.Y2081051），浙江省中醫(yī)藥科技計劃重點項目（NO.2009ZA003）通訊作者：舒琦瑾，浙江省杭州市郵電路54號浙江中醫(yī)藥大學附屬第一臨床醫(yī)學院腫瘤科，郵編：310006，電話傳真E-mail:本草綱目就記有紅豆杉治療霍亂、傷寒、排毒等療效，現(xiàn)代中藥大辭典、本草推陳等醫(yī)藥書中則有進一步記載。其性味苦、平，有小毒，歸心經(jīng)，功效消腫散結，主治：腫瘤、腎病、風濕等。目前已經(jīng)從紅豆杉中分離出400多種化合物，包括紫杉烷類化合物和少量的非紫杉烷類化合物1-6。水煎劑是中藥應用的傳統(tǒng)方式及臨床應用的主要方式，紅豆杉水煎劑已在臨床廣泛應用,且安全有效。目前國內(nèi)外尚未見應用紅豆杉水提物抑制腫瘤的研究報道。本課題通過對南方紅豆杉水提物的研究，驗證其對人肺癌A549細胞的增殖抑制作用，進一步闡明南方紅豆杉水提物的抗腫瘤作用，為天然藥物南方紅豆杉的開發(fā)應用提供理論和實驗依據(jù)。儀器和材料Elx808型酶標儀（美國BioTek公司），F(xiàn)ACSCalibur流式細胞儀（美國BD公司），BX20型熒光顯微鏡攝像機（日本OLYMPUS公司），ULTRACUTE超薄切片機（奧地利Reichert-Jung公司），JEM-1230型透射電鏡（日本JEOL公司）。南方紅豆杉：購自浙江省中醫(yī)院中藥房，寧波泰康紅豆杉生物工程有限公司生產(chǎn),規(guī)格：8g/袋。人肺腺癌細胞株A549，購自中國科學院上海細胞生物學研究所。Hylcone胎牛血清（美國Thermo公司），F(xiàn)12-K培養(yǎng)液（美國GIBCO公司），MTT粉（美國Sigma公司），AnnexinV/PIapoptosiskit（美國Invitrogen公司），DNA染色劑（美國AMRESCO公司）。方法1.細胞培養(yǎng)用體積分數(shù)為10的胎牛血清F12-K培養(yǎng)液，在37、體積分數(shù)為5的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，細胞呈貼壁生長，實驗時均取對數(shù)生長期細胞。2.藥物制備考文獻方法7，80g南方紅豆杉3次煎煮藥液經(jīng)真空抽濾器過濾，電磁爐上濃縮至約100ml，于旋轉蒸發(fā)儀上濃縮成約40ml藥液，入真空干燥箱中干燥，按100%濃度計算得率。取1g水提物，加入10ml超純水，溶解、離心，取上清液，再經(jīng)0.22m微孔濾膜除菌，制成母液濃度100mg/ml，置-20冰箱備用。3.MTT法收集對數(shù)期細胞，調整細胞懸液濃度約5104/ml，接種于96孔板，每孔加入100L，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞單層鋪滿孔底，以F12-K培養(yǎng)液稀釋藥物至不同濃度，每孔加入100L，水提物濃度分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg/ml，并設空白組和陽性對照組，每濃度設3個復孔。培養(yǎng)24小時后，倒置顯微鏡下觀察。每孔加入20LMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），繼續(xù)培養(yǎng)4h，2000r/min離心96孔板，利用虹吸原理棄去培養(yǎng)液。每孔加入150L二甲基亞砜，置搖床上振蕩10min。在酶標儀490nm波長處測量各孔的吸光值（OD值）。按下列公式計算細胞生長抑制率：生長抑制率=（1-實驗組吸光度值/對照組吸光度值）100%。用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析處理，劑量和效應關系用藥物濃度抑制軟件（LOGIT法）版本1.0.0求半數(shù)抑制率（IC50）。4.生長曲線法收集對數(shù)期細胞，調整細胞懸液濃度約2104/ml，接種于96孔板，每孔加入100L，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細胞單層鋪滿孔底，以F12-K培養(yǎng)液稀釋藥物至0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0mg/mL,每孔加入100L,各取4個復孔。培養(yǎng)24h、48h、72h、96h、120h，倒置顯微鏡下觀察。每孔加入20LMTT溶液，繼續(xù)培養(yǎng)4h，2000r/min離心96孔板利用虹吸原理棄去培養(yǎng)液。每孔加入150L二甲基亞砜，置搖床上振蕩10min。在酶標儀490nm波長處測量各孔的吸光值（OD值）。根據(jù)藥物濃度及各孔吸光值，繪制細胞生長曲線。5.流式細胞儀檢測細胞周期及凋亡取對數(shù)生長期A549細胞用0.25%胰酶-EDTA消化，制成2105/ml細胞懸液接種于60mm無菌培養(yǎng)皿中，5105個/皿。培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24h貼壁后棄上清，加入無血清F12-K培養(yǎng)液，饑餓同步化18h后，使細胞停滯于G0期8?？瞻讓φ战M加入10%胎牛血清的F12-K培養(yǎng)液，藥物組設置三個濃度分別為：藥物A組：2mg/ml，藥物B組：2.5mg/ml，藥物C組：3mg/ml，另設陽性對照組（DDP組），給予DDP200g/ml.培養(yǎng)24h后，收集上清液細胞，0.25%胰酶-EDTA消化，1000r/m離心10min，收集貼壁細胞，1640培養(yǎng)液洗滌2次，1000r/m離心10min,加入70%冷乙醇在4固定12h,在檢測細胞凋亡的試管中先后加入1Buffer100ml，AV染液5L，PI染液1L，避光15min，再加入1Buffer400L，上機檢測；在檢測細胞周期的試管中加入1mL的DNA染色劑，避光30min，上機檢測.并用隨機軟件進行數(shù)據(jù)分析，用SPSS13.0統(tǒng)計軟件分析處理。6.細胞凋亡形態(tài)學觀察在Olympus倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)瓶中的活細胞,并于電鏡下行超微結構觀察。細胞經(jīng)2.5%戊二醛和1%鋨酸雙固定,梯度乙醇和丙酮脫水,Epon812樹脂包埋,超薄切片機(ULTRACUTE型)切片,行醋酸鈉和檸檬酸鉛雙重染色,在透射電鏡下觀察并拍照。結果1.MTT法藥物敏感實驗200g/ml濃度組DDP的抑制率為70.46%，南方紅豆杉水提物作用A549細胞24h后，對A549細胞有明顯的抑制作用，且隨著藥物濃度的增加，其抑制作用逐步增強，呈明顯的劑量效應關系。IC50為2.20mg/ml。2.南方紅豆杉水提物對A549細胞作用的生長曲線的影響根據(jù)5d的MTT結果來繪制生長曲線，結果示：低濃度的水提物對A549細胞的抑制呈時間、劑量依賴性。（圖1）3.南方紅豆杉水提物對人肺癌A549細胞周期及凋亡的影響3.1南方紅豆杉水提物對人肺癌A549細胞周期分布的影響實驗結果顯示：與對照組相比，經(jīng)藥物處理24h后的細胞呈現(xiàn)細胞周期阻滯，表現(xiàn)為G1期細胞增多，S期細胞相應減少，使其發(fā)生G1期阻滯，且隨著給藥濃度的增加，作用增強，呈現(xiàn)一定的劑量效應關系（表1，圖2）。3.2.南方紅豆杉水提物對人肺癌A549細胞凋亡的影響實驗結果顯示：與空白對照組相比，經(jīng)藥物處理24h后的細胞早期凋亡的比例均有明顯升高，且早期凋亡的比例呈現(xiàn)一定的劑量效應關系（表2，圖3）。4.南方紅豆杉水提物對人肺癌A549細胞形態(tài)的影響4.1倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)變化紅豆杉水提物2、2.5、3mg/ml處理A549細胞24h后，結果顯示：與正常細胞相比，隨著水提物劑量增加，A549細胞增殖受抑制，形態(tài)發(fā)生明顯變化，細胞出現(xiàn)皺縮、壞死，呈典型凋亡表現(xiàn)（圖4-圖7）4.2電鏡觀察細胞形態(tài)變化水提物2、2.5、3mg/ml處理A549細胞24h后，與正常細胞相比，隨著紅豆杉水提物劑量增加，A549細胞形態(tài)發(fā)生明顯變化，出現(xiàn)細胞核固縮，細胞核碎裂，凋亡小體形成等凋亡的典型形態(tài)學改變（圖8-圖11）。討論細胞周期分為：G1期（DNA合成前期）、S期（DNA合成期）、G2期（DNA合成后期）、M期（有絲分裂期）。S期進行染色體復制和M期將復制的染色體分配到兩個子細胞中是細胞周期的兩個基本條件。細胞分裂的精確性及定時性是正常細胞生長和分化所必須，腫瘤的發(fā)生和發(fā)展起源于細胞周期“start”位點的失控，使大量G0期細胞無限制地通過G1/S和G2/M轉換，從而導致細胞的異常增殖。腫瘤細胞的增殖動力學特點表現(xiàn)為細胞群體分布主要與DNA合成活躍的S期有關，細胞一旦進入此期，如無特殊干擾，便能按細胞周期的順序發(fā)展下去，直至重新回到G1期。因此若在G1/S和G2/M期予以阻斷，便能有效控制腫瘤細胞周期，從而控制腫瘤增殖。隨著腫瘤分子生物學研究的深入，人們認識到腫瘤的發(fā)生和發(fā)展不僅與腫瘤細胞的增殖、分化異常有關，而且同細胞凋亡的調控失常有關。因此，設法誘導腫瘤細胞的凋亡已成為一種新的治療方向9。本研究表明，南方紅豆杉水提物具有一定的抑制人肺癌A549細胞增殖的作用，并呈一定的劑量依賴性和時間依賴性。南方紅豆杉水提物能夠阻止人肺癌A549細胞周期于G0/G1期，誘導其凋亡，為該中藥抗腫瘤作用機制之一。鑒于幾乎所有的癌基因、抑癌基因的生物學效應最終都歸結到細胞周期的機制上10，因此如何調控細胞周期以及特異性地誘導腫瘤細胞凋亡已成為當前腫瘤研究的特點。至于南方紅豆杉水提物阻滯腫瘤細胞細胞周期，誘導腫瘤細胞凋亡的確切作用機制，尚需進一步研究證實。參考文獻1ShlQW,KiyotaK.NewnaturaltaxanedlterpenoidsfromTaxusspeciessince1999.ChemBiodiv,2005,2:15972PannerVS,JhaA,BishKS,etal.Constituentsofyewtrees,Phytochemitry,1999,50(8):12673FarinaV.Thechemistryandpharmacologyoftaxolanditsdefivatives.AmsterDam:Elsevier,1995,22:554AppendinoG.Thephytochemistryoftheyewtree.NatProdRep,1995,12:3495GeorgGI,ChenTT,OjimaI,etal.Taxaneanticanceragents,basicscienceandcurrentstatus.WashingtonDC:AmericanChemicalSociety,1995,583:16BalogluE,KingstonDGI.Thetaxanediterpenoids.JNatprod,1999,62(10):14487李秀云.中藥房中藥店工作手冊.廣州:廣東科技出版社,1991:103.8王曉華,馬萍,尹元琴,等.斑蝥素對A549細胞增殖抑制作用的研究沈陽藥科大學學報，2006，23（9）：5986009張衛(wèi)東，趙惠儒，閻影，等.斑蝥素誘導人肺癌A549細胞凋亡及其分子機制的研究中華腫瘤雜志，2005，27（6）：33033410BlagosklonnyMV，PardeeAB.Exploitingcancercellcyclingforselectiveprotectionofnormalcell.CancerRes，2001，61(11)：43014305附表1南方紅豆杉水提物對A549細胞周期的影響（s，n=3）組別G1(%)S(%)G2(%)空白對