DNA甲基化功能.doc

Functions of DNA methylation: islands, start sites, gene bodies and beyondDNA甲基化功能：島，起始位點(diǎn)，基因體和其他peter a. jones摘要 DNA甲基化通常被描述為一個(gè)“沉默”的表觀遺傳標(biāo)記，的確，5甲基胞嘧啶的功能最初是在20世紀(jì)70年代提出。現(xiàn)在，歸功于甲基化繪圖的基因組規(guī)模的改良，我們可以評(píng)估在不同的基因組背景下的DNA甲基化：在基因體上，在調(diào)控元件和重復(fù)序列上，轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)有或者沒(méi)有CpG島。新出現(xiàn)的圖片是DNA甲基化功能似乎隨背景而改變，DNA甲基化和轉(zhuǎn)錄的關(guān)系比我們最先認(rèn)識(shí)到的更為微妙。有必要提高我們對(duì)DNA甲基化的功能的理解，為了解釋這個(gè)疾病標(biāo)記中觀察到的變化，比如癌癥。兩篇重要的文章在1975年分別表示胞嘧啶殘基的甲基化在CpG二核苷酸背景中能作為表觀遺傳標(biāo)記。這些文章提出序列可以被重新甲基化，即甲基化通過(guò)一種機(jī)制的體細(xì)胞分裂能夠被遺傳，包括一種能識(shí)別半甲基化CpG回文的酶，甲基基團(tuán)的存在，可以由DNA結(jié)合蛋白和DNA甲基化直接沉默基因解釋。雖然這些關(guān)鍵原則中的幾個(gè)被證明是正確的，解開(kāi)DNA甲基化與基因沉默的關(guān)系已被證明是具有挑戰(zhàn)性的。在CpG序列背景下，在動(dòng)物身上的大部分工作都集中在5甲基胞嘧啶（5mC）。據(jù)報(bào)道，在哺乳動(dòng)物的其他序列的甲基化廣泛分布在植物和一些真菌中。在哺乳動(dòng)物中，非CpG甲基化的功能目前未知。在這里我主要集中在哺乳動(dòng)物基因組中的CpG甲基化，包括在其他動(dòng)物和植物中觀察到的差異的討論。理解DNA甲基化的功能需要通過(guò)基因組考慮甲基化的分布。超過(guò)一半的基因脊椎動(dòng)物的基因組包含短（約1 kb）CpG豐富的區(qū)域稱(chēng)為CpG島（CGIS），其余的基因組因?yàn)镃pGs而耗盡。當(dāng)5mC通過(guò)自發(fā)或酶胸腺嘧啶脫氨基作用被轉(zhuǎn)換成胸腺嘧啶，認(rèn)為基因組的損失是由于甲基化的序列在種族中的脫氨基；認(rèn)為CGI存在是因?yàn)樗麄兛赡苁菑膩?lái)沒(méi)有或只有瞬時(shí)甲基化。然而，有很多關(guān)于準(zhǔn)確定義CGI是什么的討論，雖然在哺乳動(dòng)物基因組中的啟動(dòng)子的CpG密度有雙峰分布，有中等CpG密度存在的區(qū)域。直到最近，很多對(duì)DNA甲基化的研究集中在CGIs轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)（TSSs），正是這種工作這往往塑造了對(duì)DNA甲基化功能的廣泛認(rèn)同。 基因組甲基化研究的最新方法（圖1）-例如，使用亞硫酸氫鹽處理DNA（它能檢測(cè)到5mC和羥甲基胞嘧啶；見(jiàn)圖1）-強(qiáng)調(diào)的是甲基化在轉(zhuǎn)錄單位中的位置，影響其與基因控制的關(guān)系。例如,在TSS區(qū)附近的甲基化開(kāi)始，但是在基因體中的甲基化不堵塞，甚至可能刺激轉(zhuǎn)錄延伸，和令人興奮的新的證據(jù)表明，基因體的甲基化可能對(duì)剪接有影響。如著絲粒重復(fù)區(qū)域的甲基化對(duì)染色體穩(wěn)定性很重要（例如，在有絲分裂中的染色體分離），也有可能抑制轉(zhuǎn)座因子的表達(dá)從而有一個(gè)基因組穩(wěn)定性的作用。在改變?cè)鰪?qiáng)子、絕緣子和其他調(diào)控原件的活性方面，甲基化的作用才開(kāi)始受到重視。然而雖然有很多在TSSs上的甲基化的CpGs 與一些沉默基因有聯(lián)系的證據(jù)，重新甲基化和基因沉默的時(shí)間現(xiàn)在開(kāi)始得到闡明。DNA甲基化的功能本質(zhì)上鏈接到建立、維護(hù)和移除甲基組的機(jī)制上，這些機(jī)制到處可見(jiàn)，但是一些關(guān)鍵點(diǎn)需要銘記在心。它已經(jīng)知道很多年，DNA甲基轉(zhuǎn)移酶，包括所謂的DNA重新甲基化轉(zhuǎn)移酶Dnmt3a和Dnmt3b，是早期發(fā)展建立的DNA甲基化模式的本質(zhì)。我們弄明白這是如何發(fā)生的有很大的幫助，在某些情況下，核小體DNA是重新甲基化酶的底物?；椎闹匦录谆诵◇w內(nèi)的組蛋白修飾深刻地影響這些酶誘導(dǎo)從頭甲基化能力。這是以前認(rèn)為的存在本身能維持建立DNA甲基化的模式，但現(xiàn)在我們知道這是不真實(shí)的， DNMT3A和DNMT3B持續(xù)的參與是對(duì)甲基化的維。三個(gè)DNMTs中的每一個(gè)都是胚胎或新生兒的成長(zhǎng)所必需的，完全缺乏的甲基化與體細(xì)胞或者癌細(xì)胞的發(fā)育能力是不相容的，但不是胚胎干細(xì)胞（ESCs）17。DNMT3A最近已被證明對(duì)造血干細(xì)胞的分化很重要，又指著5mC在脊椎動(dòng)物分化的基礎(chǔ)。關(guān)于基因沉默重新甲基化的時(shí)間，又進(jìn)入一個(gè)的范圍。提出直接作為riggs2和霍利迪和pugh1不可能是基因沉默的主要途徑。被動(dòng)或主動(dòng)刪除5mC意味著建立后續(xù)基因表達(dá)能接受的狀態(tài)。DNA去甲基化酶的研究已經(jīng)很長(zhǎng)時(shí)間了，已經(jīng)充滿了許多失敗的開(kāi)始，但現(xiàn)在更廣泛接受的是去甲基化酶的存在。最近，大量的文獻(xiàn)表明，主動(dòng)去甲基化是可以實(shí)現(xiàn)的，雖然這需要一種機(jī)制，最終涉及細(xì)胞分化或者DNA修復(fù)和堿基的切除而不是甲基群直接從5mc 組成成分中移除。比如（TET）甲基胞嘧啶雙加氧酶參與，活化誘導(dǎo)胞嘧啶核苷脫氨酶（AID）和胸腺嘧啶DNA糖基化酶（TDG）活性和被甲基化和在基因中的激活現(xiàn)在已經(jīng)闡明。事實(shí)上， TET3的缺乏導(dǎo)致脫甲基CpG位點(diǎn)在關(guān)鍵基因的失敗比如Oct4（也稱(chēng)為Pou5f1）或在父親基因組上的Nanog和延誤胚胎發(fā)育。DNA甲基化的改變是現(xiàn)在已知的遺傳事件和包括在人類(lèi)致癌中。因此，了解DNA甲基化的作用對(duì)于理解生病過(guò)程是必不可少的。在本文中，我對(duì)背景中無(wú)關(guān)緊要的基因組中的DNA甲基化的功能進(jìn)行了評(píng)估，與特定的重點(diǎn)與轉(zhuǎn)錄的關(guān)系（已知和未知的重點(diǎn)總結(jié)在表2）。然后我介紹了可能的機(jī)制，DNA甲基化可能用到，例如，通過(guò)改變蛋白結(jié)合，我思考了剩下的問(wèn)題。在轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)模式在 CpG島的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。大多數(shù)的CGIs維持了體細(xì)胞中的非甲基化。當(dāng)有CGIs的基因在TSS是活躍的，它們的啟動(dòng)子通常有在TSS上的NDRs表示的特征，而這些NDRs通常是兩側(cè)的含有組蛋白變體H2A. Z的核小體。是用在賴(lài)氨酸 4（H3K4me3）上的組蛋白H3標(biāo)記的?；虮磉_(dá)的水平被轉(zhuǎn)錄因子控制。CGI的啟動(dòng)子被抑制有不同的機(jī)理，比如由多梳蛋白調(diào)節(jié)的啟動(dòng)子。例如，胚胎發(fā)育的主要調(diào)節(jié)基因編碼被在ESCs和分化的細(xì)胞里的不能表達(dá)這些基因的多梳蛋白抑制，如肌源性的分化1（MyoD1）或者修補(bǔ)盒6（Pax6），他們有在TSS上的核小體和被H3K27me3標(biāo)記，和失活的基因有關(guān)系。然而，一些被抑制的基因使啟動(dòng)子CGIS甲基化。啟動(dòng)子CGISs的甲基化通常限制抑制狀態(tài)的長(zhǎng)期穩(wěn)定的基因。 例子包括印記基因，位于失活的X染色體基因與專(zhuān)門(mén)表達(dá)生殖細(xì)胞的基因和假設(shè)在體細(xì)胞中表達(dá)不合適的基因。能持續(xù)100多年壽命CGIs的DNA甲基化抑制的穩(wěn)定性對(duì)CGIs的生存無(wú)影響。因?yàn)樵隗w細(xì)胞中的這些區(qū)域中任何脫氨基事件不會(huì)傳遞種系給后代。我們?nèi)匀粵](méi)有完全弄明白為什么少數(shù)CpG島甲基化，而不是大多數(shù)。在非CpG島的TSS的模式。和他們的TSSs上的有CGIs基因相比，在TSS上CpG很弱的基因是大幅波動(dòng)發(fā)生在啟動(dòng)子甲基化水平的基因。非CGI TSS的基因在原始生殖細(xì)胞基因中表達(dá)的是在TSS上的非甲基化，因此在ESCs上專(zhuān)門(mén)表達(dá)的基因或者在精子細(xì)胞的組織特異性基因經(jīng)常顯示甲基化而不是在卵母細(xì)胞或者體細(xì)胞中表達(dá)。眾所周知的例子是Oct4和Nanog基因編碼的轉(zhuǎn)錄因子，維持干細(xì)胞狀態(tài)是必不可少的。最近的研究表明，Oct4 和NANOG啟動(dòng)子可能被AID和/或者TET3活化甲基化。然而，一些組織特異性的基因在精子和ESCs中顯示甲基化，僅僅顯示在被表達(dá)的基因中特異性組織的脫甲基化。一個(gè)全基因組研究假定在非CGIs和表達(dá)之間的甲基化沒(méi)有相反的關(guān)系存在，但是數(shù)據(jù)的再分析表明表達(dá)和甲基化之間的這種關(guān)系事實(shí)上顯然是全基因組。由于長(zhǎng)期關(guān)注CGIs，我們?nèi)匀徊恢涝诳刂品荂GI TSS甲基化作用的細(xì)節(jié)。甲基化轉(zhuǎn)錄起始沉默嗎？在上面描述的一些抑制的TSS甲基化觀察， DNA甲基化和轉(zhuǎn)錄起始之間的功能關(guān)系是什么？有確鑿的證據(jù)，在TSSs的CGIs甲基化在DNA裝配進(jìn)核小體后不能啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。然而，是沉默還是甲基化的問(wèn)題在這個(gè)領(lǐng)域首先就進(jìn)行了長(zhǎng)時(shí)間的討論。洛克等人的早期實(shí)驗(yàn)。清楚地表明， 失活的X染色體上的Hprt基因的甲基化發(fā)生在染色體滅活之后。換句話說(shuō)，甲基化似乎是“鎖定”加強(qiáng)先前沉默狀態(tài)的X連鎖基因。雖然在常染色體基因上的大多數(shù)的 CGIs在體細(xì)胞上保持非甲基化，少數(shù)（10%）在正常組織和細(xì)胞中甲基化，但關(guān)于沉默的重新甲基化方面的期限沒(méi)有深入的研究。如上所述，最近發(fā)現(xiàn)DNMT3的作用對(duì)造血干細(xì)胞分化的提高懷疑長(zhǎng)期“鎖定”模型普遍性。由于作者的研究結(jié)果表明，甲基化酶對(duì)相當(dāng)短命的細(xì)胞類(lèi)型分化非常重要，看來(lái)可能是DNA甲基化在啟動(dòng)時(shí)有一個(gè)更有指導(dǎo)意義而不是加強(qiáng)沉默。然而，在癌細(xì)胞的基因組范圍研究，表明被多梳蛋白復(fù)合物沉默的CGI的啟動(dòng)子基因比在癌癥中的其他基因更可能甲基化：即甲基化之前的沉默狀態(tài)。因此，似乎沉默之前的甲基化是一般機(jī)制，但數(shù)據(jù)尚未成熟到肯定的程度。除了改變自己在CpG島，組織特異性的改變發(fā)生在它們周?chē)倪吷?。然而，?duì)這些變化還不了解。關(guān)于DNA甲基化的期限的證據(jù)有一致的想法，甲基化增加了一個(gè)表觀遺傳狀態(tài)的穩(wěn)定性水平。有趣的是，它不是要求在一些物種中為達(dá)到這個(gè)目的， 包括黑腹果蠅和酵母。轉(zhuǎn)錄和重新甲基化之間的關(guān)系。DNA甲基化可能不作為一個(gè)初始的沉默機(jī)制的原因正開(kāi)始被理解。歐意等人的開(kāi)創(chuàng)性工作表明，細(xì)胞表達(dá)DNMT3L中的重新甲基化過(guò)程（這是一個(gè)有活性的同源DNMT3A和DNMT3B的催化劑）是通過(guò)DNMT3A2和DNMT3L的每一個(gè)兩個(gè)分子的四聚體復(fù)合物完成的，還需要一個(gè)核小體?；钴S的TSS是廢棄的核小體和因此缺乏重新甲基化的底物。 最近，我們通過(guò)測(cè)試在胚胎中用維甲酸誘導(dǎo)癌細(xì)胞分化OCT4沉默的動(dòng)力學(xué)來(lái)直接測(cè)試了啟動(dòng)重新甲基化的核小體的作用 。這些實(shí)驗(yàn)表明，在Oct4的遠(yuǎn)端增強(qiáng)子和Nanog啟動(dòng)子上，分化后，第一個(gè)核小體出現(xiàn)了，然后核小體被新生成的DNMT3A跟隨，隨后，重新甲基化發(fā)生了。在不表達(dá)DNMT3L的細(xì)胞中是否有一個(gè)事件的相似序列發(fā)生尚未知曉。此外，Ooi等人研究表明重新甲基化不能發(fā)生在一個(gè)與活性基因相關(guān)聯(lián)的接受H3K4me2或者H3K4me2標(biāo)記的核小體上。核小體側(cè)翼廢棄核小體啟動(dòng)子通常包含的標(biāo)記H3K4m組蛋白和變體H2A組蛋白。兩者都與DNA甲基化強(qiáng)烈的反相關(guān)。在小鼠的h3k4me3mark的發(fā)生可能通過(guò)CXXC（cxxc1；也被稱(chēng)為cfp1）手指蛋白1保持，重新生成的H3K4甲基轉(zhuǎn)移酶的標(biāo)記和重新甲基化不相容。CpG島的未甲基化的狀態(tài)也可能來(lái)保證TET1蛋白的存在，這個(gè)是在一個(gè)TSS的高比例的CpG含量高的啟動(dòng)子中發(fā)現(xiàn)的。據(jù)推測(cè)，Tet1使任何在這個(gè)區(qū)域可能變成5羥甲基胞嘧啶的5mC轉(zhuǎn)變。有活性的CGIs分子結(jié)構(gòu)因此可以解釋為什么他們可以抵抗甲基化。當(dāng)然，并不是所有的CGI的啟動(dòng)子基因在胚胎干細(xì)胞中表達(dá)，和許多被多梳復(fù)合物抑制，因此為什么這些不重新甲基化？答案可能就在于他們包含對(duì)抗性的H3K4me3的事實(shí)（參考文獻(xiàn) 和H2A），也勢(shì)必受到Tet1束縛，這將確保他們保持5mC自由。有趣的是，這種保護(hù)似乎在永生化期間被打破，這些CGIs變成非常容易受到重新甲基化影響，致癌基因轉(zhuǎn)化后甲基化增高。該模型預(yù)測(cè)，較高水平的表達(dá)，一個(gè)CGI變成重新甲基化不太可能。支持這個(gè)預(yù)測(cè)的直接證據(jù)最近來(lái)自幾個(gè)激動(dòng)人心的論文表明，CGIS的單等位基因甲基化優(yōu)先發(fā)生在少于高表達(dá)的等位基因上。例如，Hitchins等人。研究表明MLH1基因的一個(gè)等位基因包含一個(gè)啟動(dòng)子的單核苷酸變異等位基因，轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中的這個(gè)啟動(dòng)子比普通等位基因活性更低，更可能使癌癥影響得家族體細(xì)胞甲基化。換句話說(shuō)，不活躍的等位基因也更容易獲得重新甲基化。另一種情況下，是由boumber等人研究的。他們發(fā)現(xiàn)沒(méi)有多態(tài)性的等位基因比創(chuàng)造了另外的轉(zhuǎn)錄因子Sp1結(jié)合位點(diǎn)或者sp3的啟動(dòng)子多態(tài)性的RIL的等位基因（也稱(chēng)為Pdlim4）更容易甲基化。因此，額外的sp1位點(diǎn)賦予了該等位基因重新甲基化的阻力，雖然作者不能顯示額外的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)增強(qiáng)的基因表達(dá)?；蝮w甲基化大多數(shù)的基因體是弱CpG ，基因體甲基化是廣泛的甲基化，包含多個(gè)重復(fù)和可換位的成分。在基因外顯子上的CpG位點(diǎn)甲基化是 CT轉(zhuǎn)換突變的主要原因，在生殖細(xì)胞腫瘤引起疾病突變和在體細(xì)胞中導(dǎo)致致癌突變。重要的是認(rèn)識(shí)到，雖然許多CGI是位于基因的啟動(dòng)子上，CGIs也在基因體細(xì)胞和基因沙漠上存在。雖然他們的功能在這里仍然不明，Adrian Bird認(rèn)為這些地區(qū)代表“孤兒?jiǎn)?dòng)子”。可以用在發(fā)展的早期階段和甲基化在生殖細(xì)胞逃脫以便他們保持 CpG的高密度?；蝮w甲基化與抑制不相關(guān)。從早期的DNA甲基化研究中知道基因體的甲基化是基因轉(zhuǎn)錄的一個(gè)特點(diǎn)。有活性的轉(zhuǎn)錄和基因體甲基化之間的廣泛的正相關(guān)的關(guān)系，最近被證實(shí)在有活性的X染色體上和通過(guò)鳥(niǎo)槍法用亞硫酸鹽對(duì)植物和動(dòng)物基因組測(cè)序。大多數(shù)基因體不是CGIs，當(dāng)沒(méi)有雜質(zhì)的CGIs位于基因內(nèi)的區(qū)域，認(rèn)為他們保持非甲基化。然而，最近的實(shí)驗(yàn)改變這種看法：例如，在人腦中，有34%的CGI片段是甲基化的。這種甲基化的作用是否是組織特異性，目前還不清楚。這是耐人尋味的，特別是因?yàn)門(mén)SSs在很大程度上仍然沒(méi)有甲基化。癌癥的甲基化，基因內(nèi)的 CGIs也可以是優(yōu)先的位點(diǎn)。即使基因本體CGIS可以廣泛的甲基化，這不會(huì)阻止轉(zhuǎn)錄的延伸。盡管這是事實(shí)，甲基化的SGIs被H3K9me3標(biāo)記和被甲基-CpG-結(jié)合蛋白束縛，當(dāng)他們?cè)赥SS上的時(shí)候，甲基-CpG-結(jié)合蛋白是和抑制轉(zhuǎn)錄相關(guān)的染色質(zhì)的特征。這導(dǎo)致一個(gè)明顯的悖論，在啟動(dòng)子的甲基化與表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，而在基因體甲基化表達(dá)呈正相關(guān)。因此，在哺乳動(dòng)物中，它是轉(zhuǎn)錄的起始，而不是對(duì)DNA甲基化沉默敏感的轉(zhuǎn)錄的延伸。相比之下，CpG上胞嘧啶甲基化和其他序列的背景下霉菌的延伸而不是開(kāi)始。因此，它不僅是一個(gè)存在5mC標(biāo)志本身存在，而是管理它的轉(zhuǎn)錄關(guān)系而不是解釋特定基因組和細(xì)胞背景的標(biāo)志。基因體甲基化的可能功能。在CGIs外的基因體甲基化功能是什么？最初，人們認(rèn)為這是沉默的重復(fù)的DNA成分甲基化的主要機(jī)制，如逆轉(zhuǎn)錄病毒、線元素，Alu元素等，已得到證據(jù)來(lái)證實(shí)這種觀點(diǎn)。這些元素甲基化塊開(kāi)始轉(zhuǎn)錄的同時(shí)允許宿主基因的轉(zhuǎn)錄貫穿他們 。它也被提出，轉(zhuǎn)錄衍射的過(guò)程本身可能自身刺激了DNA甲基化和，和延伸相關(guān)而不是開(kāi)始的H3K36me3可能包括在DNMTs的生成中。然而，全基因組研究表明，在基因體中對(duì)DNA甲基化的還有其他的功能。這項(xiàng)研究表明，外顯子比內(nèi)含子更高度甲基化，發(fā)生在外顯子內(nèi)含子邊界的甲基化程度的轉(zhuǎn)錄可能表明了在調(diào)節(jié)剪切中甲基化的一個(gè)功能。事實(shí)上，全基因組核小體定位數(shù)據(jù)也表明，與內(nèi)含子相比核小體的占有水平提高了，核小體是DNA甲基化的優(yōu)先位點(diǎn)。最近的一項(xiàng)研究表明，CTCF結(jié)合（可通過(guò)DNA甲基化調(diào)節(jié)，見(jiàn)下面）在RNA聚合酶2(RNAP2)暫停時(shí)發(fā)生。當(dāng)RNAP2的運(yùn)動(dòng)動(dòng)力學(xué)影響剪接時(shí)，這可能使DNA甲基化與剪切相連 。這些研究表明之前沒(méi)有認(rèn)識(shí)到DNA甲基化在轉(zhuǎn)錄中的作用，可能導(dǎo)致替代剪接。因此，看起來(lái)最可能是在基因體的DNA甲基化使結(jié)果超出在基因內(nèi)的重復(fù)DNA序列的沉默中已經(jīng)認(rèn)識(shí)到的功能。什么時(shí)候是一個(gè)基因體的起始位點(diǎn)？人們常常假設(shè)TSSs和基因體是兩個(gè)獨(dú)立的基因組特征。然而，大多數(shù)基因至少有兩個(gè)TSSs，所以下游的起始位點(diǎn)在上游啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄單位內(nèi)。這些可供選擇的啟動(dòng)子可能是CGIs或非CGI，或者可能是上游非CGI和下游的CGI的聯(lián)合體，反之亦然。這些可選擇的起始位點(diǎn)使表達(dá)和甲基化相聯(lián)系的實(shí)驗(yàn)的解釋更復(fù)雜，因?yàn)闇y(cè)量表達(dá)的探針經(jīng)常檢測(cè)到外放的啟動(dòng)子，但在給定的細(xì)胞類(lèi)型中可能只有一個(gè)有活性。下游啟動(dòng)子的甲基化阻止轉(zhuǎn)錄，它將從上游啟動(dòng)子體現(xiàn)出來(lái)，允許轉(zhuǎn)錄的延伸。事實(shí)上，DNA甲基化可能對(duì)控制可選擇的啟動(dòng)子的用途是一個(gè)有益的機(jī)理。其他調(diào)控位點(diǎn)在增強(qiáng)子中的甲基化。增強(qiáng)子和啟動(dòng)子之間的距離是可變的，是發(fā)展和功能中控制基因表達(dá)的關(guān)鍵。他們大多是弱CpG，他們的甲基化狀態(tài)被全甲基化譜分析（在植物和哺乳動(dòng)物中）在一般情況下，這些區(qū)域往往有相當(dāng)變量的甲基化。事實(shí)上，在此基礎(chǔ)上斯塔德勒等人鑒定了在小鼠基因組的增強(qiáng)子，它們不是100%的甲基化或未甲基化區(qū)域，而是稱(chēng)為低甲基化區(qū)域（LMRS）。因?yàn)橐粋€(gè)被給定的胞嘧啶要么是完全甲基化，要么是未甲基化，可變甲基化是這些二進(jìn)制狀態(tài)的平均結(jié)果。這可能表明，CpG位點(diǎn)是在一個(gè)動(dòng)態(tài)的狀態(tài)，在給定的時(shí)間有的甲基化和其他沒(méi)有甲基化，歸因于競(jìng)爭(zhēng)的甲基化和反甲基化事件。另外，每一個(gè)CpG的DNA甲基化狀態(tài)在細(xì)胞分化期間可能不會(huì)精確地保持，所以LMR狀態(tài)可能是由于低效的繼承。在不同的T細(xì)胞亞群、Schmidl等子集中。在不同的特定基因的增強(qiáng)子內(nèi)，也發(fā)現(xiàn)了大量的有差別的甲基化區(qū)域（DMRS）。在功能方面，這項(xiàng)研究表明，這些CpG 位點(diǎn)甲基化可能導(dǎo)致降低增強(qiáng)子在報(bào)告者實(shí)驗(yàn)中的活性。一個(gè)增強(qiáng)子甲基化狀態(tài)和功能是密切相關(guān)的觀點(diǎn)得到了在這些區(qū)域中調(diào)整甲基化的幾個(gè)觀察蛋白的支持。例如，對(duì)糖皮質(zhì)激素受體連接遠(yuǎn)端調(diào)控元件的結(jié)合分析表明，CpG能去甲基化，增強(qiáng)子可能因?yàn)檫@個(gè)受體的存在而有活性。 25年前saluz等人最先報(bào)道了相似的發(fā)現(xiàn)。他們證明了重疊的雌二醇的反甲基化和用雌二醇處理的公雞的糖皮質(zhì)激素受體結(jié)合位點(diǎn)。此外，5羥甲基胞嘧啶和 TET蛋白在這些成分中可以檢測(cè)到。然而，CpG甲基化和轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合關(guān)系是復(fù)雜的（見(jiàn)下文），所以我們理解包含在這些調(diào)控區(qū)域中的弱CpG增強(qiáng)子甲基化的機(jī)理之前，我們還有很長(zhǎng)的路要走。 絕緣子的甲基化。絕緣子可以定義為阻止增強(qiáng)子和啟動(dòng)子之間相互活動(dòng)的元素。大多數(shù)研究的例子是被CTCF蛋白束縛的DNA序列，CTCF蛋白結(jié)合到某一個(gè)異構(gòu)的基序。一個(gè)案例是 CFCF結(jié)合到IGF2-H19核心的印記，其中， CTCF結(jié)合控制增強(qiáng)子和啟動(dòng)子相互影響的存在與否。它已經(jīng)表明，一個(gè) CTCF結(jié)合位點(diǎn)的甲基化在這個(gè)CTCF的結(jié)合的快軌跡中，所以DNA甲基化具有控制核心的重要作用。最近的研究同樣表明 ，CTCF結(jié)合到基因編碼CD45的外顯子上是被DNA甲基化遺傳的，從而影響剪切。然而，全球研究小鼠胚胎干細(xì)胞和分化細(xì)胞表明CTCF結(jié)合在弱CpG區(qū)域內(nèi)基本不被甲基化結(jié)合位點(diǎn)的影響。但是結(jié)合了自身開(kāi)始的本地去甲基化。因此，可能沒(méi)有對(duì)CTCF位點(diǎn)甲基化影響的普遍規(guī)律（這傾向于退化）和結(jié)合？在這方面，需要注意的是，有七個(gè)潛在的CTCF結(jié)合位點(diǎn)在人類(lèi)的H19啟動(dòng)子，其中只有一個(gè)顯示了不同的父母起源甲基化。可能的機(jī)理被DNA甲基化保持在一個(gè)穩(wěn)定的抑制狀態(tài)的有活性的CGI啟動(dòng)子的這個(gè)機(jī)理很好理解，也得到了廣泛的認(rèn)可。甲基化的啟動(dòng)子使核小體在TSS上，甲基化的DNA粘合蛋白加固了TSS,TSS產(chǎn)生了抑制H3K9me3標(biāo)記和甲基化的DNA粘合蛋白依次生成了組蛋白去乙?；傅竭@個(gè)區(qū)域。穩(wěn)定無(wú)活性非CGI啟動(dòng)子基因表達(dá)狀態(tài)的甲基化變化的因果關(guān)系問(wèn)題一直備受爭(zhēng)議，這個(gè)問(wèn)題尚未得到妥善解決。因?yàn)檗D(zhuǎn)錄因子能很強(qiáng)的結(jié)合到DNA甲基化序列上，隨后導(dǎo)致這些區(qū)域被甲基化。它并不總是清楚甲基化的改變是不是轉(zhuǎn)錄的結(jié)果，是否他們穩(wěn)定轉(zhuǎn)錄無(wú)能狀態(tài)。非CGI區(qū)域甲基化對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合靶點(diǎn)的直接影響。事實(shí)上，這個(gè)事情已經(jīng)知道一段時(shí)間了，MYC結(jié)合到它的同源序列直接因?yàn)?Mc84的存在受到抑制。然而SP1