（水生生物學(xué)專業(yè)論文）酶?jìng)鞲衅魃A(chǔ)與免疫力指標(biāo)量化研究.pdf

摘要摘要酶?jìng)鞲衅鲗⒚缸鳛槊舾性?，把酶催化反?yīng)過程中的物理或化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)化為電信號(hào)以檢測(cè)被測(cè)物。由于反應(yīng)的高效性與專一性，酶在生物傳感器的研究中被應(yīng)用廣泛。本文通過對(duì)辣根過氧化物酶( h o r s e r a d i s hp e r o x i d a s e ，簡(jiǎn)稱h r p ，e c1 1 1 1 7 ) 催化過氧化氫氧化苯酚的反應(yīng)體系進(jìn)行數(shù)值模擬，研究了酶?jìng)鞲衅鳈z測(cè)的生化基礎(chǔ)。模擬得到：1 ) 反應(yīng)方程的求解必須考慮其剛性問題，對(duì)于剛性方程，應(yīng)該使用o d e l 5 s 。2 ) 催化反應(yīng)中間復(fù)合物h r p i 與h r p i i 隨時(shí)間變化的動(dòng)力學(xué)曲線，并能確定其存在的時(shí)間。3 ) 多組不同濃度下的反應(yīng)過程曲線，對(duì)比了不同濃度下的反應(yīng)速率，結(jié)果表明數(shù)值模擬能有效的減少實(shí)驗(yàn)次數(shù)與縮短實(shí)驗(yàn)周期。溫度和p h 對(duì)酶?jìng)鞲衅鳒y(cè)量精度影響較大，為了減少酶?jìng)鞲衅髟趯?shí)際測(cè)量中的誤差，指明了當(dāng)前研究中將溫度和p h 值兩個(gè)相關(guān)因素單獨(dú)考慮的局限性。準(zhǔn)確得到綜合考慮了不同溫度、p h 值條件下，聚硫堇和納米金固定辣根過氧化物酶?jìng)鞲衅黜憫?yīng)電流的特征，結(jié)果表明：1 ) 單因素離散試驗(yàn)點(diǎn)分析，不能準(zhǔn)確得到酶?jìng)鞲衅鞯淖钸m工作條件。綜合考慮溫度和p h 值，該酶?jìng)鞲衅髯钸m工作條件在4 0 - - 4 5 。c 之間，最佳p h 值在5 3 5 7之間；2 ) 以溫度、p h 值與響應(yīng)電流之間的函數(shù)關(guān)系作為傳感器校正，以及實(shí)現(xiàn)線性化處理和非線性補(bǔ)償電路的基礎(chǔ)，能夠提高酶?jìng)鞲衅鞯臏y(cè)量精度，擴(kuò)大使用范圍。復(fù)合酶?jìng)鞲衅骺梢詫?duì)同一樣品多個(gè)指標(biāo)同時(shí)進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)各單一指標(biāo)進(jìn)行處理以獲得綜合性指標(biāo)。免疫力是由多指標(biāo)共同表達(dá)的一個(gè)綜合性指標(biāo)，通過對(duì)中華米蝦( c a r i d i n ad e n t i c u l a t as i n e n s i s ) 投喂硒含量分別為0 、0 15 、0 3 0 、0 4 5 、0 6 0 、0 7 5 ( t g g )的飼料，研究了硒對(duì)中華米蝦體內(nèi)超氧化物歧化酶( s u p e r o x i d ed i s m u t a s e ，s o d ) 、過氧化氫酶( c a t a l a s e , c a t ) 、谷胱甘肽過氧化物酶( g l u t a t h i o n ep e r o x i d a s e ，g p x ) 等抗氧化酶活性的影響，并探討了其可能的作用機(jī)制。結(jié)果表明：1 ) 中華米蝦體內(nèi)抗氧化酶具有協(xié)同效應(yīng)，并且對(duì)硒表現(xiàn)出明顯的劑量效應(yīng)；t 摘要2 ) 當(dāng)飼料中添加硒濃度為0 4 4 1 a g g 時(shí)，蝦體內(nèi)s o d 、c a t 的活性均為最高；當(dāng)硒濃度為0 4 8 1 a g g 時(shí)，g p x 活性最高。分析了當(dāng)前甲殼動(dòng)物免疫力研究指標(biāo)，指出目前對(duì)免疫力進(jìn)行評(píng)判存在的兩個(gè)缺陷：1 ) 不能綜合反映免疫力水平變化。2 ) 采用不同評(píng)判指標(biāo)得到的結(jié)論無法進(jìn)行科學(xué)客觀比較。在此基礎(chǔ)上，定義了免疫力綜合指數(shù)，規(guī)定了計(jì)算方法，明確了兩種計(jì)算權(quán)重的步驟方法，即層次分析法和主成分分析法。通過對(duì)文獻(xiàn)數(shù)據(jù)的實(shí)際計(jì)算，闡明了計(jì)算方法的具體步驟，得到了免疫力綜合指數(shù)，以定量數(shù)據(jù)表明試驗(yàn)結(jié)果對(duì)免疫力的影響，為客觀評(píng)價(jià)所采取的試驗(yàn)措施提供量化結(jié)果。關(guān)鍵詞酶?jìng)鞲衅骼备^氧化物酶免疫力綜合指數(shù)層次分析主成分分析a b s t r a c ta b s t r a c te n z y m es e n s o rc o n v e r t sp h y s i c a la n dc h e m i c a ls i g n a l s ，w h i c hf o r m e di nc a t a l y t i c a lr e a c t i o n ，i n t oe l e c t r i c a ls i g n a l s ，t od e t e c to b j e c t su n d e rt e s t a ss e n s i t i v ec o m p o n e n t s ，e n z y m eh a sb e e nw i d e l ys t u d i e db e c a u s eo ft h ee f f i c i e n c ya n ds p e c i f i c i t yi nr e a c t i o n b ys i m u l a t i n gh o r s e r a d i s hp e r o x i d a s ec a t a l y z i n gr e a c t i o no fh 2 0 2o x i d i z i n gp h e n o l ，t h eb i o c h e m i c a lf u n d a m e n t a lo fe n z y m es e n s o rw e r es t u d i e d t h er e s u l ti n d i c a t e dt h a t ：1 ) s t i f f n e s sc o u l dn o tb ei g n o r e d ，a n dw h e ns o l v i n gs t i f f n e s se q u a t i o n s ，o d e15 sw a sa d a p t e d 2 ) o b t a i n e dt h ed y n a m i cc u r v e so fh r pa n di t si n t e r m e d i a t ec o m p o u n d sh r p - ia n dh r p - i ic o n c e n t r a t i o n sv a r yo v e rt i m e ，a n da s s u r e dt h el i f e t i m eo fh r p ia n dh r p i i 3 ) t h ed y n a m i cc u r v e sa td i f f e r e n ts u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o n sw e r eo b t a i n e d a n dr e a c t i v ev e l o c i t i e sw e r ec o m p a r e d ，w h i c hs h o w e ds i mu l a t i o nc o u l dg r e a t l yr e d u c et h et i m e so fe x p e r i m e n ta n ds h o r t e nt h ee x p e r i m e n tc y c l e i no r d e rt or e d u c et h ee r r o rs i g n a l ，p o n i e do u ti s o l a t e dc o n s i d e r e dt e m p e r a t u r ea n dp hv a l u ew a si n c o n s e q u e n t l yi nt h ea c t u a lm e a s u r e m e n t u n d e rd i f f e r e n tt e m p e r a t u r ea n dp h ，s i m u l a t e da c c o r d i n g l yc u r r e n to ft h eb i o s e n s o r , w h i c hb a s e do na uc o l l o i d sa n dp o l y ( t h i o n i n e )a sm a t r i x e s ，t h ed e t e c t i n gs y s t e mo ft h eb i o s e n s o rw a ss t u d i e d t h er e s u l ti n d i c a t e dt h a t ：1 ) t h ef u n c t i o ne x p r e s s i o n so fa c c o r d i n g l yc u r r e n tc h a n g e dw i t ht e m p e r a t u r ea n dp hv a r i e dw e r eg a i n e d ，t h e4 0 4 5 。ca n dp hw a sb e t w e e n5 3 5 7w h i c hw a st h eb e s to p e r a t i n gc o n d i t i o n s a td i s c r e t et e s tp o i n t s ，o n l ya n a l y z e das i n g l ef a c t o rc o u l dn o tg e tt h eo p t i m u mw o r k i n gc o n d i t i o n s 2 ) t h ef u n c t i o n ，w h i c hc u r r e n tr e s p o n s et ot e m p e r a t u r ea n dp hv a l u e ，a st h ef o u n d a t i o nt oc a l i b r a t ee n z y m es e n s o r , i m p r o v et h em e a s u r e m e n ta c c u r a c ya n de x p a n dt h ed e t e c t i v es c o p eo fe n z y m es e n s o r c o m p l e xe n z y m es e n s o rc o u l dd e t e c tan u m b e ro fi n d i c a t o r sa tt h es a m et i m e ac o m p r e h e n s i v ei n d e xc o u l db eo b t a i n e da f t e rp r o c e s s e d i m m u n i t yw a sac o m p r e h e n s i v ei n d e xt h a te x p r e s s e db ym a n yi n d i c a t o r s t h ee f f e c t so fs e l e n i u ms u p p l e m e n t a t i o nd i e t a r yo nt h ea c t i v i t yo fe n z y m i ca n t i o x i d a n ti nc a r i d i n ad e n t i c u l a t as i n e n s i sw e r es t u d i e di nt h ee x p e r i m e n t ，a n db a s e do nt h ed y n a m i cp r o c e s s ，t h em e c h a n i s mw a sa l s oi n v e s t i g a t e d t h es e l e n i u ms u p p l e m e n t a t i o nd i e t a r ya r e0 ，0 15 ，0 3 0 ，0 4 5 ，0 6 0a n d0 7 5 i _ t g g t h er e s u l t si a b s t r a c ts h o w e dt h a ts u i t a b l ec o n c e n t r a t i o no fs e l e n i u mi nt h ed i e tc a ne n h a n c et h ea c t i v i t yo fe n z y mi ca n t i o x i d a n ts y s t e ms i g n i f i c a n t l y , a n di tr e p r e s e n t e dt h ed o s ee f f e c to b v i o u s l y s o d ，c a t , a n dg p xs t r u c t u r e dac o o p e r a t i v es y s t e m t h ee x p e r i m e n td e m o n s t r a t e dt h a tt h ea c t i v i t yo fs o d ，c a t a n dg p xi ncds i n e n s i sc a nr e a c ht h em a x i m u mw h e nt h ec o n c e n t r a t i o no fs e l e n i u mi nt h ed i e ti s0 4 4 i t g g ，0 4 4 i _ t g g ，0 4 8 i t g g t h r o u g ht h ea n a l y s i so ft h ec u r r e n tr e s e a r c hi n d e x ，i nc o m p r e h e n s i v ei m m u n i t ye v a l u a t i o nt w od e f e c t sw e r ep o i n t e do u t , 1 ) t h es t a t eo fi m m u n i t yc h a n g ew a sn o tc o m p r e h e n s i v e l yr e f l e c t e d ；2 ) u s i n gd i f f e r e n te v a l u a t i o ni n d e x e sc o u l dn o tb ec o m p a r e d g i v e nt h i s ，t h ec o m p r e h e n s i v ei n d e xo fi m m u n i t yw a si n d i c a t e d ，a n dt h ec a l c u l a t i o nm a h o dw a sd e f i n e d ，a n a l y t i ch i e r a r c h yp r o c e s sa n dp r i n c i p a lc o m p o n e n ta n a l y s i sw e r eu s e dt oc a l c u l a t et h ew e i g h to fe a c hi n d e x b a s e do nt h el i t e r a t u r ed a t a ，e x p o u n d e dt h es t e p so ft h ec a l c u l a t i o nm e t h o d ，a n do b t a i n e dt h ei m m u n i t yc o m p r e h e n s i v ei n d e x t h ee f f e c to fe x p e r i m e n tr e s u l t so ni m m u n i t ys h o w e db ya m o u n t ，t h eq u a n t i t a t i v ei n d e xt oe v a l u a t et h ei m m u n i t yw a so f f e r e d k e y w o r d se n z y m es e n s o rh o r s e r a d i s hp e r o x i d a s ei m m u n i t yc o m p r e h e n s i v ei n d e xa n a l y t i ch i e r a r c h yp r o c e s sp r i n c i p a lc o m p o n e n ta n a l y s i si v 河北大學(xué)學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所呈交的學(xué)位論文，是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫的研究成果，也不包含為獲得河北大學(xué)或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書所使用過的材料。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示了致謝。作者簽名：冬童中日期：絲! z 年l 月日學(xué)位論文使用授權(quán)聲明本人完全了解河北大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：學(xué)校有權(quán)保留并向國(guó)家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允許論文被查閱和借閱。學(xué)校可以公布論文的全部或部分內(nèi)容，可以采用影印、縮印或其他復(fù)制手段保存論文。本學(xué)位論文屬于1 、保密口，在年月日解密后適用本授權(quán)聲明。2 、不保密。( 請(qǐng)?jiān)谝陨舷鄳?yīng)方格內(nèi)打“4 ”)保護(hù)知識(shí)產(chǎn)權(quán)聲明釃使钷互鉑麴告本人為申請(qǐng)河北大學(xué)誓所提交的題目為鬼痂為拐椿墨如何蕪的學(xué)位論文，是我個(gè)人在導(dǎo)師西篆族指導(dǎo)并與導(dǎo)師合作下取得的研究成果，研究工作及取得的研究成果是在河北大學(xué)所提供的研究經(jīng)費(fèi)及導(dǎo)師的研究經(jīng)費(fèi)資助下完成的。本人完全了解并嚴(yán)格遵守中華人民共和國(guó)為保護(hù)知識(shí)產(chǎn)權(quán)所制定的各項(xiàng)法律、行政法規(guī)以及河北大學(xué)的相關(guān)規(guī)定。本人聲明如下：本論文的成果歸河北大學(xué)所有，未經(jīng)征得指導(dǎo)教師和河北大學(xué)的書面同意和授權(quán)，本人保證不以任何形式公開和傳播科研成果和科研工作內(nèi)容。如果違反本聲明，本人愿意承擔(dān)相應(yīng)法律責(zé)任。聲明人：趙始作者簽名：導(dǎo)師簽名：趙建學(xué)日期：放! 望年l 月目日期：型! i 年j 二月上日日期：哆年上月衛(wèi)日第l 章緒論第1 章緒論傳感器是能感受規(guī)定的被測(cè)量并按照一定規(guī)律轉(zhuǎn)換成可用輸出信號(hào)的器件或裝置。通常由敏感元件和轉(zhuǎn)換元件組成。其中，敏感元件是指?jìng)鞲衅髦心苤苯痈惺鼙粶y(cè)量的部分，轉(zhuǎn)換元件指?jìng)鞲衅髦心軐⒚舾性敵鲛D(zhuǎn)換為適于傳輸和測(cè)量的電信號(hào)部分【。生物傳感器是一種利用生物材料作為敏感元件的新型傳感器，集生物學(xué)、化學(xué)、物理學(xué)、信息科學(xué)于一體。其最大特點(diǎn)是能在分子水平識(shí)別待測(cè)物質(zhì)1 2 弓j 。由于生物傳感器具有檢測(cè)方便、快速、裝置簡(jiǎn)單、價(jià)格低廉、選擇性優(yōu)異、應(yīng)用面廣等眾多優(yōu)點(diǎn)，因而成為傳感器研究的重要分支。不僅在臨床診斷、藥物篩選、毒物監(jiān)測(cè)等方面有著極其廣泛的應(yīng)用前景，而且在醫(yī)學(xué)發(fā)展中也是有舉足輕重的作用1 4 - 5 】。根據(jù)生物傳感器敏感元件的不同，可以分為酶?jìng)鞲衅鳌⑽⑸飩鞲衅?、免疫傳感器、?xì)胞傳感器、組織傳感器以及類脂類和d n a 傳感器。酶?jìng)鞲衅魇菍⒚缸鳛槊舾性?，把酶反?yīng)過程中的物理或化學(xué)信號(hào)轉(zhuǎn)化為電信號(hào)以檢測(cè)被測(cè)物。由于酶反應(yīng)具有專一性，高效性，在生物傳感器的研究中被廣泛應(yīng)用。1 9 6 2 年，c l a r k 用透析膜將葡萄糖氧化酶包埋在氧電極表面，氧濃度下降與溶液中的葡萄糖濃度相關(guān)，輸出信號(hào)為電流，得到第一個(gè)酶?jìng)鞲衅?，并證實(shí)了生物化學(xué)物質(zhì)無試劑分析的可能性【6 j 。自此，吸引了眾多科學(xué)家對(duì)酶?jìng)鞲衅鞯难芯颗c應(yīng)用。然而，酶?jìng)鞲衅鳟a(chǎn)生的信號(hào)非常微弱，容易受到多方面因素的影響。傳感器的響應(yīng)電流容易受到環(huán)境條件如溫度、p h 值、固定化以及酶自身活性變化的影響。另外，測(cè)量電路和a d 轉(zhuǎn)化元件都使傳感器的輸出信號(hào)帶有一定的非線性。1 1 國(guó)內(nèi)外研究進(jìn)展酶?jìng)鞲衅鞯难芯看笾陆?jīng)歷了三個(gè)發(fā)展階段：第一階段主要是利用電化學(xué)電極與固定了酶的非活性基質(zhì)膜制成的簡(jiǎn)單的傳感器，這類傳感器容易受到氧的制約，且其靈敏度容易受到氧電極靈敏度的影響。以固定葡萄糖氧化酶的葡萄糖傳感器為例，其響應(yīng)機(jī)理是利用氧來作為酶的氧化還原活性中心的電子受體，氧在葡萄糖氧化酶作用下，催化氧化葡萄糖，生成h 2 0 2 。由于還原態(tài)葡萄糖氧化酶的氧化還原活性中心在酶分子內(nèi)部，得不到可測(cè)量的電信號(hào)?？梢酝ㄟ^測(cè)量反應(yīng)物中氧的減少量或生成物中h 2 0 2 的產(chǎn)生量河北大學(xué)理學(xué)碩士學(xué)位論文這_ 兩種方法獲得電信號(hào)l7 i 。第二階段研究者在固定生物材料的同時(shí)，加入媒介體來促進(jìn)電子傳遞的過程，提高測(cè)定的靈敏度。此階段的傳感器在電子傳遞過程中不涉及到氧的參與，因此避免了氧對(duì)傳感器測(cè)量靈敏度以及準(zhǔn)確度的影響。常用的媒介質(zhì)有有二茂鐵及其衍生物、鐵氰酸鹽、有機(jī)介體等1 8 】。第三階段的生物傳感器是把生物活性物質(zhì)直接固定在電子元件上，生物分子與電極間的電子交換不再經(jīng)過動(dòng)態(tài)媒介參與，而直接進(jìn)行電子傳遞、感知和放大界面物質(zhì)的變化，從而把生物識(shí)別和信號(hào)的轉(zhuǎn)換處理結(jié)合在一起用。與前兩個(gè)階段的酶?jìng)鞲衅飨啾?，此階段的酶?jìng)鞲衅骷炔恍枰醴肿樱膊恍枰浇轶w作為電子傳遞體，而是使酶的氧化還原中心直接與電極間進(jìn)行電子傳遞，從而提高反應(yīng)器的響應(yīng)速度和靈敏度。中國(guó)科學(xué)院長(zhǎng)春應(yīng)用化學(xué)研究所董邵俊研究組用直接電化學(xué)方法研究了辣根過氧化物酶的氧化還原性質(zhì)【6 1 ?？梢灾苯佑糜谶M(jìn)行電化學(xué)反應(yīng)的酶和蛋白質(zhì)類有氧化還原酶類，肌紅蛋白，血紅蛋白和細(xì)胞色素c 等。隨著生物傳感器研究的不斷深入，研究人員現(xiàn)致力于以下幾個(gè)方面的研究：( 1 ) 新材料的開發(fā)與利用，如納米材料的應(yīng)用使傳感器靈敏度更高，便攜性更好；( 2 ) 采用新的固定化技術(shù)一直是研究的熱點(diǎn)；( 3 ) 可以協(xié)同分析多種物質(zhì)的復(fù)合酶?jìng)鞲衅饕约皞鞲衅鞯募苫乾F(xiàn)代傳感器要達(dá)到的目標(biāo)；( 4 ) 生物傳感器的活體實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)在突發(fā)性、重癥疾病的監(jiān)護(hù)中的應(yīng)用，可以避免破壞性取樣和測(cè)定時(shí)間的遲滯；( 5 ) 雖然酶電極生化分析儀，b o d 測(cè)定儀，手持式血糖測(cè)定儀，s p r 分析儀和各類生物芯片已經(jīng)得到應(yīng)用，但生物傳感器所占的市場(chǎng)份額還不大，生物傳感器的市場(chǎng)化是當(dāng)前研究的另一個(gè)熱點(diǎn)。1 2 生物傳感器的一般特性生物傳感器的輸入一輸出關(guān)系是傳感器的基本特性。生物傳感器的不同內(nèi)部結(jié)構(gòu)參數(shù)決定它具有的不同外部特性，因此測(cè)量誤差也與內(nèi)部結(jié)構(gòu)參數(shù)密切聯(lián)系。生物傳感器所測(cè)量的物理量根據(jù)其是否隨時(shí)間變化，可以分為穩(wěn)態(tài)信號(hào)和動(dòng)態(tài)信號(hào)，所以生物傳感器的輸出特性分為靜態(tài)特性和動(dòng)態(tài)特性。由于不同生物傳感器所固定的生物材料，以及選取的固定方法不同，靜態(tài)特性和動(dòng)態(tài)特性也表現(xiàn)出不同的特點(diǎn)，對(duì)測(cè)量結(jié)果的影響也不相同。第l 章緒論1 2 1 生物傳感器的靜態(tài)特性生物傳感器在穩(wěn)態(tài)信號(hào)作用下，其輸入一輸出關(guān)系稱為靜態(tài)特性。衡量靜態(tài)特性的指標(biāo)有線性度、靈敏度、遲滯和重復(fù)性。線性度是指生物傳感器輸入與輸出之間的線性程度。如果生物傳感器的輸入一輸出特性是線性的，則可以簡(jiǎn)化傳感器的理論分析和設(shè)計(jì)計(jì)算，為標(biāo)定和數(shù)據(jù)處理帶來方便，避免了非線性補(bǔ)償環(huán)節(jié)。由于生物材料不穩(wěn)定以及在電子傳遞過程中容易受到環(huán)境條件的影響，實(shí)際的輸出信號(hào)常帶有一定的非線性。在應(yīng)用中，通過擬合方法得到輸入輸出量的擬合曲線，從而使生物傳感器的測(cè)量帶來一定的非線性誤差。靈敏度是指生物傳感器在穩(wěn)態(tài)情況下，輸出變化與輸入變化的比值。在線性傳感器中，靈敏度就是它靜態(tài)特性的斜率，而非線性傳感器的靈敏度隨時(shí)間發(fā)生變化。酶催化的反應(yīng)具有高度靈敏性，因此是作為傳感器的良好材料。遲滯在酶?jìng)鞲衅髦械漠a(chǎn)生，是由于電子在傳遞過程中，電子受到固定化或者溶液介質(zhì)的阻礙作用，而使對(duì)應(yīng)于同一大小的輸入信號(hào)，正反行程的輸出信號(hào)大小不相等。重復(fù)性是指在對(duì)同一信號(hào)進(jìn)行多次測(cè)量時(shí)，生物傳感器的輸出信號(hào)的特征曲線不一致的程度。在酶?jìng)鞲衅鞯氖褂弥?，常伴隨酶的失活或者部分失活，因此酶?jìng)鞲衅髟谑褂靡欢螘r(shí)間后要重新進(jìn)行校正。1 2 2 生物傳感器的動(dòng)態(tài)特性在測(cè)定靜態(tài)信號(hào)時(shí)，生物傳感器的輸入一輸出特性之間存在一一對(duì)應(yīng)的關(guān)系。但在生物傳感器的實(shí)際使用過程中，被測(cè)信號(hào)隨時(shí)間變化。而生物傳感器對(duì)動(dòng)態(tài)信號(hào)的測(cè)量，不僅需要精確地測(cè)量信號(hào)值的大小，還要記錄信號(hào)變化與時(shí)間的關(guān)系。研究動(dòng)態(tài)特性可以從時(shí)域和頻域兩個(gè)方面采用順態(tài)響應(yīng)法和頻率響應(yīng)法來分析。由于輸入信號(hào)的時(shí)間函數(shù)形式多種多樣，在時(shí)域內(nèi)研究生物傳感器的響應(yīng)特性時(shí)，只能研究幾種特定的輸入時(shí)間函數(shù)，如階越函數(shù)、脈沖函數(shù)和斜坡函數(shù)等的響應(yīng)特性。在頻域內(nèi)一般采用正弦函數(shù)得到頻率響應(yīng)特性【l 】。1 3 酶的固定化酶的固定化主要是應(yīng)用物理或化學(xué)方法將溶液酶轉(zhuǎn)化為不溶于水的可以重復(fù)利用的固定態(tài)酶。其主要目的是在不妨礙被分析物自由擴(kuò)散的情況下，將酶等限制在一定空1 河北大學(xué)理學(xué)碩士學(xué)位論文間。與游離態(tài)酶相比，固定化酶具有一系列的優(yōu)點(diǎn)：( 1 ) 酶可以從反應(yīng)物中分離，重復(fù)使用，降低成本；( 2 ) 大多數(shù)酶經(jīng)過固定化后，其穩(wěn)定性增加：( 3 ) 減少其他物質(zhì)的干擾；( 4 )便于實(shí)現(xiàn)生產(chǎn)的連續(xù)化和自動(dòng)化。固定化方法有【6 】：1 3 1 基本方法適合生物傳感器的常用固定化方法分為6 種：夾心法、包埋法、吸附法、共價(jià)結(jié)合法、交聯(lián)法和微膠囊法。夾心法是將活性材料封閉在雙層濾膜之間，固定酶的膜類型為超濾膜或透析膜。這種方法操作簡(jiǎn)單，不需要任何化學(xué)處理，固定生物量大，響應(yīng)速度較快，重現(xiàn)性好。吸附法是經(jīng)非水溶性載體物理吸附或離子結(jié)合作用，如配位鍵和疏水作用等固定生物敏感元件。吸附的牢固程度與溶液的p h 值、離子強(qiáng)度、溫度、溶劑性質(zhì)和種類以及酶濃度有關(guān)。吸附過程一般不需要化學(xué)試劑，對(duì)蛋白質(zhì)分子活性影響較小，但蛋白質(zhì)分子容易脫落。凝膠包埋法是將生物材料包埋并固定在高分子聚合物三維空間網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)基質(zhì)中，主要用于固定酶分子和細(xì)胞。其特點(diǎn)是不產(chǎn)生化學(xué)修飾，對(duì)生物分子活性影響較小，膜的孑l 徑和幾何形狀可任意控制，被包埋物不易滲漏，底物分子可以在膜中任意擴(kuò)散：缺點(diǎn)是分子量大的底物在凝膠網(wǎng)格內(nèi)擴(kuò)散較困難。共價(jià)鍵合法是使生物活性分子通過共價(jià)鍵，直接或間接與不溶性載體結(jié)合而固定的方法。其特點(diǎn)是結(jié)合牢固，蛋白質(zhì)分子不易脫落，載體不易被生物降解，使用壽命長(zhǎng)；缺點(diǎn)是操作步驟較多，酶活性可能因?yàn)榛瘜W(xué)修飾而降低，制備具有高活性的固定化酶比較困難。交聯(lián)法是借助具有兩個(gè)功能基團(tuán)的雙功能試劑，使蛋白質(zhì)結(jié)合到惰性載體或蛋白質(zhì)分子彼此交聯(lián)成網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。廣泛用于酶膜和免疫分子膜制備，操作簡(jiǎn)單，結(jié)構(gòu)牢固，但在進(jìn)行固定化時(shí)需要嚴(yán)格控制p h 值，一般在蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)附近操作，交聯(lián)劑濃度要嚴(yán)格控制。微膠囊法包埋生物活性材料或指示分子，主要采用脂質(zhì)雙分子層組成的內(nèi)部結(jié)構(gòu)為水相的閉合囊泡。自2 0 世紀(jì)6 0 年代以來，一直作為細(xì)胞膜研究的人工模式系統(tǒng)，現(xiàn)廣泛地作為藥物分子載體用于治療。4 第1 章緒論1 3 2l b 膜技術(shù)l b 膜的基本原理是生物分子在潔凈的水表面展開后形成水不溶性液態(tài)單分子膜，小心壓縮表面積使液態(tài)膜逐漸成為一個(gè)分子厚度的擬固態(tài)膜。利用l b 膜技術(shù)制作酶膜主要有兩個(gè)優(yōu)點(diǎn)：一是酶膜可以制得很薄，厚度和層數(shù)可以精確控制：二是可以獲得高密度的酶分子膜，由此可能協(xié)調(diào)響應(yīng)速度和響應(yīng)活性這對(duì)矛盾。但酶分子多溶于水，難以在水相中成膜。1 - 3 3 光平版印刷技術(shù)光平版印刷術(shù)是利用照相原理與化學(xué)腐蝕相結(jié)合，在工件表面制取精密、細(xì)微和復(fù)雜薄層圖形。廣泛用于印刷電路和集成電路的制作以及印刷制版等過程，其基本原理是利用光刻膠感光后因光化學(xué)反應(yīng)而固化的特點(diǎn)將掩模板上的圖形刻制到被加工表面上。1 4 影響酶?jìng)鞲衅魈匦缘囊蛩卦诿競(jìng)鞲衅髦校瑴囟群途彌_液p h 值常使敏感原件酶發(fā)生不可逆失活。反應(yīng)速率隨溫度升高而加快，但在較高的溫度下由于酶的失活作用，反應(yīng)速率反而下降。在電阻應(yīng)變式酶?jìng)鞲衅髦?，溫度一方面引起電阻變化，另一方面?duì)酶反應(yīng)產(chǎn)生影響，當(dāng)二者數(shù)量級(jí)相同時(shí)，測(cè)量精度無法保證；在電容式傳感器中，當(dāng)介電常數(shù)的溫度系數(shù)不為零時(shí)，則引起傳感器電容值的改變，從而造成溫度附加誤差。當(dāng)p h 值改變時(shí)，酶的解離狀態(tài)發(fā)生變化，具有催化活性的酶分子數(shù)量隨之變化，從而影響反應(yīng)速率。另外，由于固定化酶內(nèi)擴(kuò)散和外擴(kuò)散的作用，影響了底物與酶的接觸，底物需要通過固定介質(zhì)才能與酶發(fā)生反應(yīng)；同時(shí)，在反應(yīng)過程中電子的傳遞受到一定程度的阻礙，從而增大了酶?jìng)鞲衅鞯臏y(cè)量誤差。再者，生物傳感器的輸出信號(hào)非常弱，需要有信號(hào)調(diào)節(jié)電路和轉(zhuǎn)換電路將其放大并轉(zhuǎn)換成容易傳輸、處理、記錄和顯示的形式，在電路的設(shè)計(jì)以及信號(hào)轉(zhuǎn)換過程中，不可避免的引起誤差。上述各影響因素使酶?jìng)鞲衅鬏敵鲂盘?hào)帶有一定程度的非線性，影響了測(cè)量的靈敏度和精確度。河北大學(xué)理學(xué)碩士學(xué)位論文1 5 研究目的和意義酶?jìng)鞲衅魇亲钤绯霈F(xiàn)的生物傳感器，目前研究集中在對(duì)新技術(shù)、新材料和新方法的開發(fā)與利用。新生物材料的應(yīng)用，如d n a 在一定程度上提高了傳感器的精確度；新的固定化技術(shù)，如納米技術(shù)對(duì)提高酶?jìng)鞲衅鞯撵`敏度做出了突出貢獻(xiàn)，但當(dāng)前對(duì)酶?jìng)鞲衅髦忻舾胁牧系幕咎匦匝芯坎⒉欢嘁?。辣根過氧化物酶活性穩(wěn)定，價(jià)格低廉容易得到，在酶?jìng)鞲衅?、生物修?fù)以及生物降解等研究中廣泛應(yīng)用。因此，反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)機(jī)制對(duì)研究酶降解有機(jī)污染物及檢測(cè)有毒物質(zhì)的研究有重要意義。本文通過數(shù)值模擬研究了辣根過氧化物酶催化h 2 0 2 氧化苯酚的反應(yīng)，得到了中間產(chǎn)物的變化規(guī)律，以及底物濃度與反應(yīng)時(shí)間之間的關(guān)系。并探討了在溫度和p h 值綜合影響下，聚硫堇和納米金固定辣根過氧化物酶?jìng)鞲衅鞯捻憫?yīng)特征，得到了該酶?jìng)鞲衅髯罴训墓ぷ鳁l件。在實(shí)際生產(chǎn)中，被測(cè)信號(hào)往往并不是單一的穩(wěn)定信號(hào)。為了適應(yīng)實(shí)際測(cè)量的需要，復(fù)合酶?jìng)鞲衅鞯难芯渴钱?dāng)前研究的熱點(diǎn)之一。多種酶以及酶與其它生物材料的聯(lián)合固定提高了酶?jìng)鞲衅鞯臋z測(cè)效率。但是為了避免生物材料或被測(cè)信號(hào)相互干擾，復(fù)合傳感器對(duì)固定的敏感材料以及被測(cè)物有嚴(yán)格的要求。另外，對(duì)多指標(biāo)評(píng)價(jià)系統(tǒng)的研究并沒有明確標(biāo)準(zhǔn)。通過對(duì)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)免疫研究，發(fā)現(xiàn)在甲殼動(dòng)物免疫力評(píng)價(jià)中，存在著不同指標(biāo)間不能進(jìn)行科學(xué)比較，以及不能綜合反應(yīng)免疫力變化情況的問題。本文從動(dòng)力學(xué)角度探討了飼料中硒對(duì)中華米蝦抗氧化酶系統(tǒng)的可能作用機(jī)制；定義了甲殼動(dòng)物免疫力綜合指標(biāo)，并確定了數(shù)學(xué)表達(dá)式為權(quán)重累加形式，給出了計(jì)算權(quán)重的兩種方法：一是根據(jù)評(píng)價(jià)者主觀上對(duì)各指標(biāo)的重視程度來決定權(quán)重的層次分析法；一是根據(jù)各指標(biāo)的聯(lián)系程度或各指標(biāo)所提供的貢獻(xiàn)量來決定指標(biāo)的權(quán)重的主成分分析法。為復(fù)合酶?jìng)鞲衅鬟M(jìn)行多指標(biāo)系統(tǒng)測(cè)量的定量研究提供了數(shù)學(xué)基礎(chǔ)。第2 章辣根過氧化物酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的數(shù)值模擬第2 章辣根過氧化物酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的數(shù)值模擬2 1 引言生化反應(yīng)動(dòng)力學(xué)是研究生化反應(yīng)過程的速率及其影響因素的科學(xué)。目前，對(duì)反應(yīng)速率及影響因素的研究，多數(shù)以經(jīng)驗(yàn)的方法為主。但隨著學(xué)科間的融合與發(fā)展，采用數(shù)值模擬的方法來進(jìn)行研究正迅速發(fā)展起來【9 j 。為了研究輔酶重建對(duì)基于酶促反應(yīng)的光學(xué)生物傳感器性能的影響作用，j e n n ar i c k u s 【1 0 】等人( 2 0 0 5 ) 通過建立模型，以數(shù)值積分的方式，研究了酶?jìng)鞲衅鞯撵`敏度、響應(yīng)時(shí)間等性能參數(shù)。為了考察膜反應(yīng)器的一系列性能，e l i oe g o n z ai n 】等( 2 0 0 7 ) 建立了一個(gè)簡(jiǎn)便而易用的數(shù)值模擬方法，模擬了反應(yīng)器的相關(guān)特性，并取得了很好的效果。2 0 0 6 年，n o b u y o s h i i l 2 1 等詳細(xì)探究了多酶反應(yīng)體系的動(dòng)態(tài)模擬，并給出了以糖酵解酶反應(yīng)為實(shí)例的對(duì)比結(jié)果。2 0 0 7 年l o 月，m a f i aj s c h i l s t r a 1 3 】對(duì)復(fù)雜生化過程的數(shù)值模擬方法進(jìn)行了研究，指明了生化反應(yīng)的數(shù)值模擬應(yīng)遵循的基本理念與基本規(guī)律等。與相關(guān)學(xué)科的融合，使得對(duì)生化反應(yīng)過程的研究更加方便、靈活。通過采用數(shù)值模擬的方法，可使用幾個(gè)關(guān)鍵的變量來代替復(fù)雜的反應(yīng)過程，并將微觀現(xiàn)象與宏觀現(xiàn)象聯(lián)系起來，以預(yù)測(cè)反應(yīng)的結(jié)果，檢測(cè)并發(fā)現(xiàn)可能被忽略掉的變量與參數(shù)，甚至搞清楚反應(yīng)的機(jī)理【9 1 ?；诖?，本文以水相中辣根過氧化物酶催化h 2 0 2 與苯酚反應(yīng)為代表，對(duì)反應(yīng)從開始進(jìn)行直到到達(dá)穩(wěn)定狀態(tài)進(jìn)行了模擬，并由此探討了生化反應(yīng)數(shù)值模擬時(shí)存在的問題及得到的結(jié)論。2 2 酶促反應(yīng)的基本方程1 9 1 3 年，m i c h a e l i s m e n t e n 等人提出了酶催化反應(yīng)歷程1 1 4 】。酶( e ) 與底物( s ) 先成中間化合物( e s ) ，然后中間化合物再進(jìn)一步分解為產(chǎn)物，并釋放出酶( e ) 。s + e z 蘭蘭蘭e s j 泣一e + p( 2 1 )k _ l式中，k - i , k + ，k 收各級(jí)反應(yīng)速率常數(shù)h r p 是以鐵卟啉為輔基的血紅素蛋白，在h 2 0 2 存在時(shí)，它能夠催化一系列底物發(fā)生反應(yīng)。其催化反應(yīng)過程包含多種中間化合物的形成，首先是h r p 的血紅素基團(tuán)經(jīng)過兩電子氧化而成為化合物h r p i ，然后化合物h r p 1 與底物發(fā)生反應(yīng)形成化合物h r p i i ，7 河北大學(xué)理學(xué)碩士字位論文化合物h r p i i 可以還原為h r p 狀態(tài)。h r p i 與h i 沖1 i 均在很短的時(shí)間內(nèi)形成，并且滯留的時(shí)間非常短f 1 5 】，隨即參加下一步的反應(yīng)。本文忽略了各逆反應(yīng)的發(fā)生，并假定了酶在反應(yīng)過程中不失活，反應(yīng)條件穩(wěn)定。由此，上述反應(yīng)體系的反應(yīng)過程包括以下三個(gè)步驟【1 6 】：h r p + h 2 0 2 ! 嶼h r p - i( 2 2 )h r p - i + a h 2 蘭qh r p i i + * a h( 2 3 )h r p i i + a h 2 山h p r + a h( 2 4 )式中，h r p 游離態(tài)酶；a h ：苯酚；a h 苯酚脫氫產(chǎn)物。上述反應(yīng)過程，改用微分方程表示，則參與反應(yīng)的各物質(zhì)的反應(yīng)速率為：了d h r p ：一t 。 h r p h 2 0 2 】+ k 【h r p i i a h 2 】( 2 5 )n ld h _ r p - i ：t 。 h r p 【h 2 0 2 卜： h r p i 】 a h 2 】( 2 6 )d h r = p - 一i i ：k , 2 h r p i 】【a h 2 卜k + 3 h r p 1 1 1 a h 2 】( 2 7 )d a - h 一2 ：一缸2 h r p i 】 a h 2 卜t 3 h r p i i 】 a h ：】( 2 8 )t坐掣：k h r p i 】 a h 2 + t 3 h r p i i a h 2 】( 2 9 )d _ h 2 0 2 ：一k 。 h r p 【h 2 0 2 】( 2 1 0 )式中，【h r p 】游離態(tài)酶的濃度；【h ：o ：卜一過氧化氫的濃度；【h r p i 卜一中間產(chǎn)物i 的濃度；【h r p i i 】中間產(chǎn)物i i 的濃度；【a h ：】苯酚的濃度；【a h 卜一苯酚脫氧產(chǎn)物的濃度。2 3 方程求解在方程( 5 ) 一( 1 0 ) 所表述的反應(yīng)體系中，因變量 h r p i 】、【h r p i i 】與【a h 隨自變量【h r p 、【h 2 0 2 與 a h 2 的變化而變化。因此，可以通過改變h r p 、h 2 0 2 與a h 2 的濃度比例來探討底物濃度與酶濃度變化對(duì)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的影響。由于【h f u p i 】與【h r p - i i 】相對(duì) h r p 、【h 2 0 2 】變化極快【1 5 l ，因此該反應(yīng)體系的方程屬于剛性方程組。經(jīng)驗(yàn)證，上述反應(yīng)體系的剛性方程組不能通過龍格庫(kù)塔法【1 7 l o d e 4 5 進(jìn)行有效求解，本文采用o d e l 5 s求解并得到了反應(yīng)過程中各組分的動(dòng)力學(xué)曲線。r 第2 蘋辣根過氧化物酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的數(shù)值模擬p h 值在5 9 之問時(shí)，t 。與p h 值無關(guān)，k ，扎只因底物的不同而變化。各級(jí)反應(yīng)的速率常數(shù)分別源于文獻(xiàn)f 1 6 】：t l = 1 o x l 0 7 t o o l s ；( 2 1 1 )k = 2 7 6 x1 0 6 m o l j ；( 2 1 2 )k = 2 8 5 x 1 0 5 t o o l s ；( 2 1 3 )為了驗(yàn)證模擬的可靠性，這里采用了和文獻(xiàn)中相同的濃度，即當(dāng)h r p 、h 2 0 2 與a h 2的初始濃度分別為5 0 x 1 0 。6 m o l l - 1 ，5 0 x 1 0 4 m 0 1 l 1 ，5 0 1 0 m o l l - 1 時(shí)，對(duì)反應(yīng)進(jìn)行模擬，得到h r p 、h r p 1 與h r p i i 的濃度變化曲線( 如圖2 1 與圖2 2 所示) 。；、一藿乞。燧矮- 。-吐生：、j石ehbo螂蟶=正叱- i 圖2 1h r p ，h r p 1 與h r p i i 濃度隨時(shí)問變化f i g 2 1c o n c e n t r a t i o n so f h r p , h r p 一1a n dh r p - l l v a r yo v e rt i m e河北大學(xué)理學(xué)碩士學(xué)位論文圖2 2h r p i i 濃度隨時(shí)間變化f i g 2 2c o n c e n t r a t i o no fh r p i iv a r i e so v e rt i m e在反應(yīng)體系中a h 2 是氫供體底物，h 2 0 2 是氫受體底物。對(duì)沒有引入任何氫供體底物h r p 與h 2 0 2 反應(yīng)生成h r p i ，繼而生成h r p i i 這一現(xiàn)象是許多研究中都得到證型1 8 】。改變a h 2 初始反應(yīng)物濃度，當(dāng)h r p ，h 2 0 2 與a h 2 的初始濃度分別為5 0 1 0 m o l u 1 ，5 0 1 0 4 t o o l l - 1 ，5 0 x 1 0 - 4 m o l l 1 時(shí)獲得另外一組濃度變化曲線( 如圖2 3 所示) 。圖2 3h r p 、h r p l 與h r p i i 濃度隨時(shí)間變化f i g 2 3c o n c e n t r a t i o n so fh r p 、h r p - ia n dh r p i iv a r yo v e rt i m e- l o 一一10e?？凇Ｊ腊灰籱叱工一一_1pe、bo避疑正叱工一1io、bo越蟥hd叱工一一-peoo隧避一i-正叱工第2 章辣根過氧化物酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的數(shù)值模擬2 4 結(jié)果與討論通過對(duì)微分方程組的求解，得到了h r p 以及其中間產(chǎn)物h r p i 與h r p i i 自反應(yīng)開始直到到達(dá)穩(wěn)定階段的濃度變化曲線( 如圖2 1 ，2 2 ，2 3 所示) 。陳建波等i l5 j 采用停留光譜法檢測(cè)到h r p 催化h 2 0 2 氧化聯(lián)苯胺的反應(yīng)體系中吸收光譜的變化，證實(shí)中間復(fù)合物在0 0 0 2 5 s 內(nèi)迅速形成，并在o 0 0 5 s 后消失( 如圖2 4 所示) 。與模擬結(jié)果基本一致，中間復(fù)合物在反應(yīng)的開始階段迅速產(chǎn)生，并達(dá)到平衡，反應(yīng)完成后消失。通過模擬，可知當(dāng)h r p ，h 2 0 2 與a h 2 的初始濃度分別為5 0 1 0 由m o l l ，5 0 x 1 0 - 4m o l l ，5 o x l 0 7m o l l 時(shí)，h p r 濃度在反應(yīng)初始階段降低，這是由于游離酶與底物結(jié)合成中間復(fù)合物，因此h r p i 與h r p i i 濃度升高，并且在反應(yīng)進(jìn)行1 5 x 1 0 - 3 s 時(shí)h r p 與h r p i 濃度不再變化，h r p i i 濃度繼續(xù)緩慢上升( 如圖2 1 所示) 。當(dāng)反應(yīng)時(shí)間達(dá)到0 5 s時(shí)，h r p i i 濃度不再變化，達(dá)到穩(wěn)定( 如圖2 2 所示) ，此時(shí)未與底物結(jié)合的游離酶以及兩種中間復(fù)合物的濃度和，等于初始加入的酶的濃度，模擬結(jié)果符合b r i g g s - h a l d a n e 方型9 1 。由于a h 2 濃度較低限制了第二步反應(yīng)的進(jìn)行，因此反應(yīng)體系中h r p i 濃度要高于h r p i i 。這說明，數(shù)值模擬嚴(yán)格遵循著b h 方程，能夠準(zhǔn)確的再現(xiàn)生化反應(yīng)的過程。圖4 不同波長(zhǎng)下吸光度隨時(shí)間的變化曲線( 摘自文獻(xiàn)1 5 )f i g 4t h ev a r i a t i o ni na b s o r b a n c ed i f f e r e n tw a v e l e n g t h s ( s e er e f 15 )提高a h 2 濃度為h r p 的1 0 0 倍，其反應(yīng)過程如圖2 3 所示，由圖可知，隨著a h 2濃度與h r p 濃度比值的提高，h r p i 與a h 2 的反應(yīng)速率逐漸加快。在反應(yīng)過程中，h r p濃度逐漸降低，h r p i 濃度隨著反應(yīng)的進(jìn)行先升后降，在0 5 x 1 0 3 s 時(shí)出現(xiàn)峰值，其原因1 l 一孑曼夏ij2五1童河北大學(xué)理學(xué)碩士學(xué)位論文可能是由于屯。高于k ，即生成h r p i 的速率高于h r p 一1 1 ，所以在反應(yīng)初始階段，h i 心一i有短暫的積累，隨著反應(yīng)的進(jìn)行，h r p i 被下一級(jí)反應(yīng)消耗，濃度逐漸降低；而h r p - i i逐漸升高，最終三者在4 5 x 1 0 - 3 s 左右達(dá)到穩(wěn)定，濃度不再變化。和前邊的反應(yīng)對(duì)比可知，當(dāng)增大a h 2 濃度后，反應(yīng)達(dá)到穩(wěn)定的時(shí)間要遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于增大濃度前的反應(yīng)體系。目前，在對(duì)酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)及其中間產(chǎn)物研究過程中，多數(shù)采用分光光度法對(duì)反應(yīng)過程中的中間產(chǎn)物進(jìn)行濃度的分析，以探求生化反應(yīng)的機(jī)制。陳海明1 1 8 】等采用停流快速混合技術(shù)，利用快速掃描紫外可見分光光度計(jì)得到h r p 催化過氧化氫氧化苯酚聚合過程的瞬態(tài)光譜數(shù)據(jù)。對(duì)該測(cè)量數(shù)據(jù)矩陣用正交投影及遺傳算法解析后，確定體系中含有h r p 及其中間復(fù)合物，并且當(dāng)h r p 與底物以l ：1 0 0 的比例混合時(shí)檢測(cè)到大量h r p i i ，而由于h r p i 存在時(shí)間較短不易檢測(cè)到。陳建波【l5 j 等用停流法探討了2 5 。c 時(shí)辣根過氧化物酶氧化聯(lián)苯胺反應(yīng)過程中h r p i 在0 0 0 5 s 后基本完全消失。本文通過設(shè)定相同的模擬條件，模擬結(jié)果與上述文獻(xiàn)通過光譜分析得到的結(jié)果基本一致。此外，本模擬可設(shè)定不同的濃度值，能夠更加方便的研究濃度的逐漸變化與反應(yīng)速率的關(guān)系，而不必在實(shí)際中對(duì)每一個(gè)濃度的都進(jìn)行試驗(yàn)，可節(jié)約大量的試驗(yàn)時(shí)間與費(fèi)用，圖2 5 、2 6 給出了不同a h 2 和h 2 0 2 濃度下的反應(yīng)過程曲線。、i 一百eho、t - 一-墼蟶- 一正叱工圖2 5 不同a h 2 濃度下 h r p i 】變化1 【a h 2 1 = 5 0 10 m o l l ，2 - 一【a h 2 - - 5 0 10 擊m o l l ，3 f a h 2 】= 5 0 10 - m o l l ，4 _ 1 a h 2 】= 5 0 10 4m o l l f i g 2 5t h ev a r i a t i o no f h r p i 】a td i f f e r e n t 【a h 2 】第2 章辣根過氧化物酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)模擬、- j二oei -i oo世蠖_ _c i i叱 1 -2 5 結(jié)論t 1 0 3 s圖2 6 不同h 2 0 2 濃度f h r p - i 】變化l 【h 2 0 2 】= 5