（微生物與生化藥學(xué)專業(yè)論文）大腸桿菌對(duì)有機(jī)溶劑的耐受性研究.pdfVIP

天津科技大學(xué) 學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明 本人鄭重聲明：所呈交的論文是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下獨(dú)立進(jìn)行研究所取得的 研究成果。除了文中特別加以標(biāo)注引用的內(nèi)容外，本論文不包括任何其他個(gè)人或 集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫的成果內(nèi)容。對(duì)本文的研究做出重要貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體，均 已在文中以明確方式標(biāo)明。本人完全意識(shí)到本聲明的法律后果由本人承擔(dān)。 、? 作者簽名：土 j 圩、 日期：加暑年弓月；f 日 專利權(quán)聲明 本人鄭重聲明：所呈交的論文涉及的創(chuàng)造性發(fā)明的專利權(quán)及使用權(quán)完全歸天 津科技大學(xué)所有。本人完全意識(shí)到本聲明的法律后果由本人承擔(dān)。 -1r 作者簽名：土沖。圩 日期：z n 睜弓月日 學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書 本學(xué)位論文作者完全了解學(xué)校有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，同意學(xué)校保 留并向國家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允許論文被查閱和借 閱。本人授權(quán)天津科技大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫 進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存和匯編本學(xué)位論文。 保密口( 請?jiān)诜娇騼?nèi)打“ ， ) ，在年解密后適用本授權(quán)書。 本學(xué)位論文屬于 不保密彳( 請?jiān)诜娇騼?nèi)打“ ) 。 作者簽名：王辛廳、 導(dǎo)師簽名：壬及 - - - r _ 一 日期：伽留年；月f 日 日期：力呀年歲月；je l 摘要 在有機(jī)溶劑水兩相體系生物轉(zhuǎn)化技術(shù)應(yīng)用中，有機(jī)溶劑對(duì)細(xì)胞的毒害是其中的 重要障礙。研究有機(jī)溶劑對(duì)細(xì)胞的毒害及微生物對(duì)有機(jī)溶劑的耐受機(jī)制，對(duì)改造、選 育耐有機(jī)溶劑的菌株，增強(qiáng)在生物轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用有著重大意義。本文以大腸桿菌 ( e s c h e r i c h i ac o l i ) k 1 2 為模式菌株，研究了在有機(jī)溶劑水兩相系統(tǒng)中，有機(jī)溶劑甲 苯、四氯化碳、正己烷、鄰苯二甲酸二乙酯對(duì)e c o l ik 1 2 生長和e c o l ik 1 2 細(xì)胞膜的 影響，初步探討了e c o l ik 1 2 對(duì)有機(jī)溶劑的耐受機(jī)制。 通過研究甲苯、四氯化碳、正己烷、鄰苯二甲酸二乙酯對(duì)e c o l ik 1 2 生長的影響 可以得到以下結(jié)果： e c o l ik 1 2 對(duì)四種l o g p 值不同的有機(jī)溶劑的耐性不同：對(duì)正己烷耐性較強(qiáng)，依 次是鄰苯二甲酸二乙酯、四氯化碳，對(duì)甲苯的耐受性最弱。 大腸桿菌對(duì)不同濃度的有機(jī)溶劑耐受性不同：在1 5 、1 0 9 6 、0 3 ( v v ) 的甲 苯、四氯化碳、正己烷、鄰苯二甲酸二乙酯存在下，可以看到明顯的o d 值變化的差 異。 在0 3 的甲苯、四氯化碳等溶劑存在下，大腸桿菌存活率隨作用時(shí)間延長而降 低，甲苯尤其明顯。在添加0 3 的甲苯3 0 m i n 后，大腸桿菌的存活率僅為2 4 8 。 采用羅丹明1 2 3 ( r h l 2 3 ) 、二乙酸熒光素( f i ) a ) 熒光法測定在o 3 的甲苯、四 氯化碳等有機(jī)溶劑存在下，大腸桿菌細(xì)胞膜電位、細(xì)胞膜通透性的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在 添加0 3 的四氯化碳3 0 r a i n 后，r h l 2 3 和f d a 熒光強(qiáng)度下降了1 6 3 、3 4 5 ，即相 當(dāng)于膜電位下降了1 6 3 ，膜滲透性增加了3 4 5 。當(dāng)培養(yǎng)液中添加0 3 的甲苯時(shí)， f d a 熒光強(qiáng)度下降6 5 9 ；表明細(xì)胞膜完整性受到嚴(yán)重破壞。 用氣相色譜法研究了大腸桿菌細(xì)胞膜脂肪酸組成的變化，發(fā)現(xiàn)在鄰苯二甲酸二乙 酯、四氯化碳存在的情況下，細(xì)胞膜脂肪酸組成中飽和脂肪酸的含量增加。盡管甲苯 對(duì)大腸桿菌的抑制作用最強(qiáng)，但甲苯對(duì)膜脂肪酸組成影響卻不明顯。脂肪酸飽和度的 增加改變了細(xì)胞膜的流動(dòng)性，增強(qiáng)了對(duì)有機(jī)溶劑的耐受性。 關(guān)鍵詞：大腸桿菌；有機(jī)溶劑：細(xì)胞膜：脂肪酸：有機(jī)溶劑耐受性 a bs t r a c t t h et o x i ce f f e c t so fo r g a n i cs o l v e n t so nw h o l ec e l l sa r eas e r i o u sd r a w b a c kf o rt h e a p p l i c a t i o no ft h e s ec e l l si n at w o - l i q u i dp h a s eb i o r e a c t o r i nt h i sr e s e a r c h ，t h eo r g a n i c s o l v e n tt o l e r a n c eo fe s c h e r i c h i ac o l ik 1 2i nat w o - p h a s es y s t e mh a db e e ns t u d i e d e l e m e n t a r i l y t h er e s u l t so b t a i n e dw i l lb eu s e f u la sar e f e r e n c ef o rf u t u r es t u d i e so r g a n i c s o l v e n tt o l e r a n tm e c h a n i s mo f e c o i l s e v e r a lo r g a n i cs o l v e n t s ，s u c ha sn - h e x a n e ，d i r t h y lp h t h a l a t e ，c a r b o mt e t r a c h l o r i d ea n d t o l u e n e ，w h i c hm a y b eh a v ee f f e c to nt h ee c o l ik 1 2a r ed i s c u s s e dw i t ht h et u r b i d i t ya t6 6 0 b i n ( o d 6 面，c e l ls u r v i v a lr a t e sa n dt h ea l t e r a t i o n so fc e l ls h a p ea st a r g e t t h er e s u l t sa r e s u m m a r i z e di nt h r e ea s p e c t sa sf o l l o w s ： 田塢o r g a n i cs o l v e n tt o l e r a n c eo fe c o l ik 1 2i sd i f f e r e n tf o rt h e s eo r g a n i cs o l v e n t s e c o l ik 1 2s t r a i nc a nt o l e r a t en - h e x a n e ，l o wc o n c e n t r a t i o n so fd i r t h y lp h t h a l a t ea n dc a r b o m t e t r a c h l o r i d e ，r e s p e c t i v e l y t h eg r o w t hi n h i b i t i o nc a u s e db yt o l u e n ew a sv e r yo b v i o u s t h es u p p l e m e n t a r yc o n c e n t r a t i o no fo r g a n i cs o l v e n ti sa ni m p o r t a n ti n f l u e n c i n g f a c t o rf o re c o l ik 1 2 e c o l ik 1 2d i d n tg r o wi nt h ep r e s e n c eo f0 3 ( v v ) t o l u e n e t h e s u p p l e m e n t a r yc o n c e n t r a t i o n so fd i r t h y lp h t h a l a t ea n dc a r b o mt e t r a c h i o f i d ef o rr e s t r a i n i n g e c o l ik 1 2g r o w t hw c 他1 5 a n d1 0 ( v v ) ，r e s p e c t i v e l y ( 耖r o l u e n ei sh i g h l yt o x i cf o re c o l ik 1 2 t h ec e l ls u r v i v a lr a t e sw a s2 4 8 w i t h i n3 0 m i nw h e ne c o l ik 1 2g r o w ni nl bs u p p l e m e n t e dw i t h0 3 ( v v ) t o l u e n e t h ec e l lm e m b r a n ep o t e n t i a la n dp e r m e a b i l i t yw e r ee x a m i n e db ym e a s u r i n gt h e f l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yo fc e l l sl a b e l e db yf l u o r e s c e i nd i a c e t a t e ( f d a ) a n dr h o d a m i n e 1 2 3 ( r h l 2 3 ) u s i n gt h ef l u o r e s c e n c es p e c t r o p h o t o m e t e r w h e nt h ec e l l sw e r et r e a t e dw i t h c a r b o nt e t r a c h l o f i d ef o r3 0m i n r h l 2 3a n df d ad e c r e a s e db y1 6 3 a n d3 4 5 ，i t i n d i c a t e dt h a tc e l lm e m b r a n ep o t e n t i a ld e c r e a s e d eb y1 6 3 a n dm e m b r a n ep e r m e a b i l i t y i n c r e a s e db y3 4 5 t h ed e g r e s s i v ee x t e n to ff d ar e l a t i v ef l u o r e s c e n c ei n t e n s i t yw a s m a x i m a la n dd e s c e n d e d6 5 9 i nt h ep r e s e n c eo ft o l u e n ea f t e r3 0m i ni n c u b a t i o n f a t t ya c i dc o m p o s i t i o nw a sa n a l y z e du s i n gg a sc h r o m a t o g r a p h y c o m p a r e dw i t hn o s o l v e n t , t h es y n t h e s i so fl i p i d sc o n t a i n i n gs a t u r a t e df a t t ya c i d si nt h ep r e s e n c eo fd i r t h y l p h t h a l a t ea n dc a r b o mt e t m c h i o f i d eh a da ni n c r e a s e d e s p i t et h et o x i cp o t e n c yo ft o l u e n ea s ag r o w t hi n h i b i t o rf o re c o l ik 1 2 ，l i t t l ec h a n g e si nf a t t ya c i dc o m p o s i t i o nw e r eo b s e r v e d w h e ne c o l ik 1 2g r o w nw i t ht o l u e n e a l t e r a t i o n si nt h es a t u r a t i o nd e g r e eo ff a t t ya c i d s c h a n g e dt h ef l u i d i t yo fc e l lm e m b r a n e sa n dp r o v i d e de c o l ik 1 2w i t hap e r m e a t i o nb a r r i e r t oh y d r o p h o b i cc o m p o u n d sa n di nt h i sw a yc o m p e n s a t ef o rt h ee f f e c t sc a u s e db ys o l v e n t s k e yw o r d s ：o r g a n i cs o l v e n t s ，c e l lm e m b r a n e ，e s c h e r i c h i ac o l i ，f a t t ya c i d ，o r g a n i cs o l v e n t t o l e r a n c e 目錄 1 前言m ”1 1 1 生物轉(zhuǎn)化概述m 1 1 1 1 生物轉(zhuǎn)化的概念”1 1 1 2 微生物生物轉(zhuǎn)化m 1 1 1 3 生物轉(zhuǎn)化在藥物合成中的應(yīng)用m 1 1 1 4 生物轉(zhuǎn)化中的新技術(shù)、新領(lǐng)域2 1 2 有機(jī)介質(zhì)中完整細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化“3 1 2 1 完整細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化的形式3 1 2 2 有機(jī)相催化的優(yōu)勢和缺點(diǎn)4 1 2 3 有機(jī)溶劑的選擇4 1 3 有機(jī)溶劑對(duì)微生物的影響5 1 3 1 有機(jī)溶劑對(duì)細(xì)胞毒害機(jī)理的研究”5 1 3 2 細(xì)胞對(duì)有機(jī)溶劑耐受機(jī)理的研究及進(jìn)展6 1 4 大腸桿菌對(duì)有機(jī)溶劑耐受性研究進(jìn)展8 1 5 立題背景8 1 6 主要研究內(nèi)容及思路9 2 材料與方法1 0 2 1 材料 2 1 1 菌株 2 1 2 培養(yǎng)基1 0 2 1 3 相關(guān)溶液 2 1 4 主要藥品m 1 0 2 1 5 主要儀器m 1 1 2 2 實(shí)驗(yàn)方法m 1 1 2 2 1g c o k 1 2 的培養(yǎng) 2 2 2 有機(jī)溶劑添加時(shí)間對(duì)菌體生長的影響1 2 2 2 3 采用單染色法觀察有機(jī)溶劑對(duì)大腸桿菌形態(tài)的影響1 2 2 2 4 采用活菌計(jì)數(shù)法考查有機(jī)溶劑對(duì)大腸桿菌存活率的影響1 2 2 2 5 脂肪酸的提取m “1 2 2 2 6 分析方法m m m 1 3 3 結(jié)果與討論? 1 6 3 1 有機(jī)溶劑對(duì)e c o l ik 1 2 生長的影響m 1 6 3 1 1e c o l ik 1 2 的生長特性 3 1 2e c o l ik 1 2 的菌體形態(tài)1 6 3 1 3 有機(jī)溶劑對(duì)e c o k 1 2 生長的影響1 8 3 1 4 有機(jī)溶劑對(duì)王c o k 1 2 存活率的影響 3 1 5 有機(jī)溶劑對(duì)e c o k 1 2 菌體形態(tài)的影響2 l 3 1 6 有機(jī)溶劑對(duì)e c o k 1 2 代謝活性的影響 3 1 7 金屬陽離子與e c o k 1 2 的有機(jī)耐受性2 4 3 1 8 小結(jié)2 5 3 2 有機(jī)溶劑對(duì)e c o l ik 1 2 細(xì)胞膜的影響” 3 2 1 有機(jī)溶劑對(duì)e c o l ik 1 2 細(xì)胞膜電位的影響2 6 3 2 2 有機(jī)溶劑對(duì)e c o l ik 1 2 細(xì)胞膜通透性的影響“ 3 2 3d 、結(jié)2 7 3 - 3 有機(jī)溶劑對(duì)e c o l ik 1 2 細(xì)胞膜脂肪酸組成的影響 3 3 1 正己烷對(duì)e c o l ik 1 2 細(xì)胞膜脂肪酸組成的影響2 8 3 3 2 鄰苯二甲酸二乙酯對(duì)e c o l ik 1 2 細(xì)胞膜脂肪酸組成的影響3 1 3 3 3 四氯化碳對(duì)e c o l ik 1 2 細(xì)胞膜脂肪酸組成的影響3 3 3 3 4 甲苯對(duì)e c o l ik 1 2 細(xì)胞膜脂肪酸組成的影響3 5 3 3 5 小結(jié)”3 6 4 結(jié)論” 5 展望3 9 6 參考文獻(xiàn)o “4 0 7 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表論文情況4 8 8 致謝- - - - - - - - - - - 4 9 n 5 0 1前言 1 1 生物轉(zhuǎn)化概述 1 1 1 生物轉(zhuǎn)化的概念 生物轉(zhuǎn)化( 亦稱為生物催化，b i o t r a n s f o r m a t i o n ，b i o c o n v e r s i o n , b i o c a t a l y s i s 等) ，指 利用酶或有機(jī)體( 細(xì)胞、細(xì)胞器) 作為催化劑實(shí)現(xiàn)化學(xué)轉(zhuǎn)化的過程，是生物體系( 包括 細(xì)菌、真菌、植物組織、動(dòng)物組織培養(yǎng)系或生物體系的酶制劑) 對(duì)外源性底物進(jìn)行結(jié) 構(gòu)性修飾所發(fā)生的化學(xué)反應(yīng)。其實(shí)質(zhì)是利用生物體系本身所產(chǎn)生的酶對(duì)外源化合物進(jìn) 行酶催化反應(yīng)。催化反應(yīng)類型幾乎包括所有的體外有機(jī)化學(xué)反應(yīng)，如：羥基化、氧化、 脫氫、氫化、還原、水解、水合、酯化、酯轉(zhuǎn)移、脫水、脫羧、?；?、胺化、異構(gòu)化 和芳構(gòu)化等。生物轉(zhuǎn)化大多是在室溫或中性環(huán)境中進(jìn)行，具有無毒、無污染、低能耗、 高效率、高選擇性等優(yōu)點(diǎn)。生物轉(zhuǎn)化還可以合成化學(xué)上難以合成的物質(zhì)，特別是復(fù)雜 的天然活性物質(zhì)。 1 1 2 微生物生物轉(zhuǎn)化 生物轉(zhuǎn)化包括微生物生物轉(zhuǎn)化、植物培養(yǎng)物生物轉(zhuǎn)化等，研究、應(yīng)用較多的是微 生物轉(zhuǎn)化。微生物生物轉(zhuǎn)化法是利用微生物中特定的酶將人工合成的非天然化合物進(jìn) 行生物轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化液經(jīng)分離純化可得所需產(chǎn)品的過程。微生物在生物催化的手性合成 中有著重要的用途，它能提供廉價(jià)和多樣的生物催化劑酶，或以完整細(xì)胞直接進(jìn) 行生物催化，后者又稱為微生物生物轉(zhuǎn)化。微生物可產(chǎn)生多種酶，能催化多種非天然 有機(jī)物發(fā)生轉(zhuǎn)化反應(yīng)，有些反應(yīng)是化學(xué)法難以或不可能完成的化學(xué)反應(yīng)。微生物生物 轉(zhuǎn)化法的優(yōu)點(diǎn)是不需要酶的分離純化和輔酶再生，缺點(diǎn)是副產(chǎn)物可能較多，產(chǎn)物的分 離純化比較麻煩。微生物生物轉(zhuǎn)化法已在一些有機(jī)酸、氨基酸、核苷酸、抗生素、維 生素和甾體激素等方面實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)。 1 1 3 生物轉(zhuǎn)化在藥物合成中的應(yīng)用 1 1 3 1 手性藥物的合成n 1 手性藥物是指只含單一對(duì)映體的藥物。手性是自然界的本質(zhì)屬性之一，作為生命 活動(dòng)重要基礎(chǔ)的生物大分子，如核酸、蛋白質(zhì)、多糖等分別由具有手性的d - d n a 、 l - 氨基酸、d - 單糖構(gòu)成，載體、酶、受體等也都具有手性，它們一起構(gòu)成了人體內(nèi)高 度復(fù)雜的手性環(huán)境。藥物在進(jìn)入體內(nèi)后，其藥理作用是通過與體內(nèi)這些靶分子之間的 嚴(yán)格手性匹配和分子識(shí)別能力而實(shí)現(xiàn)的。立體結(jié)構(gòu)相匹配的藥物通過與體內(nèi)酶、核酸 等大分子中固有的結(jié)合位點(diǎn)產(chǎn)生誘導(dǎo)契合，從而抑制( 或激活) 該大分子的生理活性， 達(dá)到治療的目的。目前手性藥物的生產(chǎn)主要分為化學(xué)法和生物學(xué)法?；瘜W(xué)方法手性拆 分難度大，試劑昂貴，且造成資源浪費(fèi)和環(huán)境污染，不利于工業(yè)化生產(chǎn)；生物轉(zhuǎn)化法 較化學(xué)合成具有明顯優(yōu)勢。生物轉(zhuǎn)化實(shí)質(zhì)是酶促反應(yīng)，酶促反應(yīng)具有化學(xué)選擇性、區(qū) 域選擇性和對(duì)映體選擇性，利用酶的這些性質(zhì)可以合成手性藥物。合成手性藥物的生 1 前言 物轉(zhuǎn)化反應(yīng)大致可分為兩類：一類是把外消旋體拆分為兩個(gè)光活性的對(duì)映體；另一類 是從外消旋體或前手性的前體出發(fā)，通過催化反應(yīng)得到不對(duì)稱的光學(xué)活性產(chǎn)物。 1 1 3 2 天然藥物的合成 天然藥物一般是指來源于植物、動(dòng)物、微生物、海洋生物、礦物的藥物。植物藥 是天然藥物的主要組成部分。我國天然藥物的生產(chǎn)主要是從天然原料中提取或化學(xué)方 法合成，這樣就會(huì)導(dǎo)致原始資源存量減少、破壞生態(tài)環(huán)境，而且提取和化學(xué)合成的程 序繁瑣、效率低、成本高。而采用生物轉(zhuǎn)化的方法則可以克服這些弊端。與傳統(tǒng)方法 相比，生物轉(zhuǎn)化有以下幾個(gè)優(yōu)勢叨： ( 1 ) 生物轉(zhuǎn)化可以為急需開發(fā)針對(duì)特定有效成分或組分的天然藥物的生產(chǎn)技術(shù)提 供一條便捷途徑，替代傳統(tǒng)提取的方法。 ( 2 ) 就天然資源來講，某種植物中不可能僅含有一種活性成分，往往有一些生源 關(guān)系相近或結(jié)構(gòu)類似的化合物。單純依靠從天然資源中提取分離費(fèi)時(shí)、費(fèi)力、浪費(fèi)資 源。因此，可以以生物轉(zhuǎn)化為途徑，尋找合適的反應(yīng)器，以期獲得具有更好生理活性 的化合物。 ( 3 ) 生物轉(zhuǎn)化屬于綠色化學(xué)，能耗低，污染少，保護(hù)環(huán)境，符合可持續(xù)發(fā)展的要 求。 1 1 4 生物轉(zhuǎn)化中的新技術(shù)、新領(lǐng)域 i i 4 1 雙水相系統(tǒng) 雙水相生物轉(zhuǎn)化技術(shù)主要應(yīng)用于不溶底物的轉(zhuǎn)化或是有產(chǎn)物抑制的反應(yīng)，因?yàn)樗?可以將細(xì)胞限于一相而產(chǎn)物迅速萃取到另一相中，這樣可以減少產(chǎn)物抑制或者縮短產(chǎn) 物在細(xì)胞附近的停留時(shí)間來阻止產(chǎn)物的降解，即使產(chǎn)物是高毒性或高度不穩(wěn)定的，雙 水相系統(tǒng)中的反應(yīng)也是專一的，而且還可以使細(xì)胞回收，實(shí)現(xiàn)連續(xù)發(fā)酵，這將有可能 擴(kuò)大到工業(yè)化水平。 1 1 4 2 分子定向進(jìn)化技術(shù) 分子定向進(jìn)化技術(shù)又稱分子進(jìn)化法、體外進(jìn)化法和直接進(jìn)化法。與自然進(jìn)化不同 的是，定向進(jìn)化技術(shù)是在人為引發(fā)條件下發(fā)生，并通過選擇突變后的突變種群來保留 某一方向的進(jìn)化而排除其他方向突變，整個(gè)進(jìn)化過程完全是被事先定向的。酶的定向 進(jìn)化是對(duì)酶進(jìn)行修飾的最新方法，它不僅能使酶演化出非天然特性，還能定向進(jìn)化某 一代謝途徑，而且可以改善酶的穩(wěn)定性、底物特異性、對(duì)映體選擇性等，并在抗體庫、 d n a 結(jié)合位點(diǎn)定向進(jìn)化、抗輻射性等方面也有廣泛的應(yīng)用，極大地拓展了蛋白質(zhì)工 程學(xué)的研究范圍，為指導(dǎo)應(yīng)用( 如藥物設(shè)計(jì)等) 奠定了理論基礎(chǔ)。分子定向進(jìn)化技術(shù)已 被用于上百個(gè)酶的進(jìn)化。如枯草桿菌蛋白酶e 在有機(jī)溶液中( 6 0 9 6 d 眥) 的活性提高了 1 7 0 倍；b 一內(nèi)酰胺酶的耐抗菌素c e f o - - - t a x i m c 濃度提高了3 2 0 0 0 倍啷。 i i 4 3 酶和細(xì)胞的固定化技術(shù) 酶和細(xì)胞的固定化技術(shù)是指利用化學(xué)或物理的手段將游離的細(xì)胞或酶定位在有 天津科技大學(xué)碩士學(xué)位論文 限的空間中并保持其活性的一種手段。在生物轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的反應(yīng)中，要求催化劑不但要 穩(wěn)定而且能夠重復(fù)使用，實(shí)現(xiàn)連續(xù)性操作。應(yīng)用固定化技術(shù)不但可以滿足這一要求， 而且可以提高催化劑的穩(wěn)定性、有利于簡化操作和產(chǎn)物的分離。在采用非水相介質(zhì)的 生物轉(zhuǎn)化中，可以利用酶和細(xì)胞的固定化，使生物催化劑在有機(jī)溶劑中發(fā)揮更高的催 化效率，并且使有機(jī)溶劑引起的酶變性抗性顯著增強(qiáng)。l l a n e s 等h 1 研究了硅藻土固 定化分枝桿菌( m y c o b a c t e r i u ms p ) n r r l b - 3 8 0 5 細(xì)胞對(duì)谷甾醇的側(cè)鏈降解，考察了 不同的硅藻土材料和顆粒大小對(duì)轉(zhuǎn)化率的影響。姜忠義喳1 等對(duì)催化劑的膜固定化技術(shù) 進(jìn)行了研究。 除以上技術(shù)外，有機(jī)溶劑水兩液相體系以及濁點(diǎn)系統(tǒng)在生物轉(zhuǎn)化中的應(yīng)用、基 因工程菌構(gòu)建技術(shù)、超臨界流體技術(shù)、抗體酶、反膠束酶、交聯(lián)酶晶體等新技術(shù)和方 法的發(fā)展及完善，都大大推動(dòng)了生物轉(zhuǎn)化的研究和應(yīng)用。尤其是非水相生物轉(zhuǎn)化，目 前已成為人們研究的最大熱點(diǎn)。 1 2 有機(jī)介質(zhì)中的完整細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化 在非水相生物轉(zhuǎn)化和涉及有機(jī)溶劑的環(huán)境生物技術(shù)中，許多過程都與有機(jī)溶劑和 細(xì)胞或酶的相互作用有關(guān)。在完整細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化過程中，有機(jī)溶劑對(duì)細(xì)胞的毒性則成 為有機(jī)相催化的重大障礙。1 9 8 4 年，z a k s 等阻1 報(bào)道了脂酶在有機(jī)相中的活性。1 9 8 9 年，a l i mi n o u e 等忉發(fā)現(xiàn)了一株可以在高濃度的甲苯存在下存活的假單胞茵 ( p s e u d o m o n a sp u t i 脅) ，這兩個(gè)發(fā)現(xiàn)改變了細(xì)胞和酶在有機(jī)介質(zhì)中不能存活和保持活 力的觀點(diǎn)，從而引起了人們對(duì)有機(jī)溶劑毒害機(jī)理和細(xì)胞溶劑耐受性研究的關(guān)注。 眾多研究方法和技術(shù)的出現(xiàn)及應(yīng)用，極大推動(dòng)了生物催化的研究和應(yīng)用，尤其是 非水相生物催化，已成為目前本研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)研究方向之一。 利用完整細(xì)胞進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，利于解決輔酶再生的問題。在完整細(xì)胞中，不僅各 種酶比較豐富，并且有完備的輔助因子再生系統(tǒng)，實(shí)際上，完整細(xì)胞本身就是有別于 酶的生物催化劑。 1 2 1 完整細(xì)胞生物轉(zhuǎn)化的形式 利用完整細(xì)胞進(jìn)行生物轉(zhuǎn)化，其形式可以分為幾種： ( 1 ) 利用培養(yǎng)中的細(xì)胞。將底物加入到培養(yǎng)到一定時(shí)期的細(xì)胞培養(yǎng)液中，采用 單批次或流加的方式進(jìn)行反應(yīng)。 ( 2 ) 利用休眠細(xì)胞。把培養(yǎng)到一定時(shí)期酶活最高時(shí)的細(xì)胞處理為休眠態(tài)，細(xì)胞 不生長，但具有生長活性，細(xì)胞內(nèi)部的大部分酶都保持了較高的活性。與生長細(xì)胞相 比，它們可以懸浮在各種溶劑包括有機(jī)溶劑中進(jìn)行催化反應(yīng)。這種方式在保持高催化 活性的同時(shí)，產(chǎn)物更易分離，可以避免其他代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，達(dá)到很高的細(xì)胞濃度。 ( 3 ) 利用干細(xì)胞。一定條件下，微生物細(xì)胞干燥脫水后，仍可保留酶的活性和 生長活性，脂酶、酸胺酶、氧化還原酶、蛋白酶和脫氫酶等都能經(jīng)受細(xì)胞干燥脫水過 程。常用的制備方法是冷凍干燥法和丙酮干粉法。利用干細(xì)胞，制備簡單，可以確保 1 前言 實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性，另外在操作時(shí)，不需要無菌操作哺1 。 1 2 2 有機(jī)相催化的優(yōu)勢和缺點(diǎn) 有機(jī)溶劑體系可以分為三類叫：t k 有機(jī)溶劑( 可溶于水) ，雙相系統(tǒng)，單一有機(jī)溶 劑體系。g e r a r das e l l e k 和j u l i a nbc h a u d h u d n 帕將其細(xì)劃分為四類，并對(duì)每一種溶劑 體系進(jìn)行了詳細(xì)的闡述，即( 1 ) 含有小于2 0 ( 體積比) 有機(jī)溶劑的水溶液，( 2 ) 含有大 于2 0 ( 體積比) 有機(jī)溶劑的水溶液，( 3 ) 雙相系統(tǒng)，水有機(jī)溶劑、有機(jī)溶劑水和水 有機(jī)溶劑水，( 4 ) 單一有機(jī)溶劑體系。嚴(yán)格講，利用不含水的有機(jī)溶劑體系才稱為有 機(jī)溶劑介質(zhì)。 利用有機(jī)溶劑作為反應(yīng)介質(zhì)，除了能很好的解決底物的不溶性問題外，還有一些 催化上的其他優(yōu)點(diǎn)，但不可否認(rèn)，也存在一些缺點(diǎn)，其優(yōu)缺點(diǎn)分述如下n 1 1 習(xí)： 利用有機(jī)溶劑作為反應(yīng)介質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)：( 1 ) 提高反應(yīng)物質(zhì)的溶解性；( 2 ) 影響反應(yīng)的 選擇性( 底物選擇性、區(qū)域選擇性、立體選擇性) ；( 3 ) 降低水活度( 改變水解平衡) ； ( 4 ) 減少在水相中可能發(fā)生的副反應(yīng)；( 5 ) 有利于產(chǎn)物的分離，提高得率；( 6 ) 非極性 溶劑中增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性。 利用有機(jī)溶劑作為反應(yīng)介質(zhì)的缺點(diǎn)：( 1 ) 對(duì)生物催化劑有毒性，降低活性；( 2 ) 要 求與傳統(tǒng)催化的不同裝置；( 3 ) 需要控制水活度；( 4 ) 增加了反應(yīng)系統(tǒng)的復(fù)雜性。 1 2 3 有機(jī)溶劑的選擇 兩液相培養(yǎng)中，關(guān)鍵是確定合適的有機(jī)溶劑。其最重要的要求有兩點(diǎn)，一是對(duì)細(xì) 胞不產(chǎn)生毒性且不影響細(xì)胞的生長；二是對(duì)代謝產(chǎn)物有較大的萃取能力，以發(fā)揮有機(jī) 溶劑的作用，減少有機(jī)溶劑在反應(yīng)器中所占的體積。實(shí)際上高分配系數(shù)和好的生物相 容性往往不可兼得。 有機(jī)溶劑對(duì)微生物活性的影響( 稱為抗菌性) 一般采用l 0 9 p ( 溶劑在辛醇和水 的混合物中的分配系數(shù)的對(duì)數(shù)) 來表示n 羽，一般l 0 9 p 值大于4 的有機(jī)溶劑對(duì)生物催 化劑活性無影響，因此是生物相容的；l o g l 值小于2 的有機(jī)溶劑對(duì)生物催化劑活性 影響很大，因此是生物非相容的；而l 0 9 p 值介于2 至4 之間的有機(jī)溶劑對(duì)生物催化 劑活性影響適中，可能是生物相容的，也可能是非生物相容的。l 0 9 p 值和有機(jī)溶劑 在微生物細(xì)胞膜的緩沖系統(tǒng)之間有一定的相關(guān)性，許多研究成果已經(jīng)證實(shí)有機(jī)溶劑在 細(xì)胞膜內(nèi)的積累是造成溶劑對(duì)微生物毒害作用的主要原因，有機(jī)溶劑溶解在膜內(nèi)會(huì)破 壞膜的完整性，影響膜作為屏障和能量轉(zhuǎn)換的功能n 蛔 用i j d g p 值來反映有機(jī)溶劑與生物相容性的關(guān)系己被大家廣泛接受。嚴(yán)格講，該 參數(shù)反映的是溶劑的疏水性，并不等于極性。但實(shí)際的研究表明，生物活性保持和 l o g p 值之間有一定的關(guān)系：l o g p 4 的溶劑，一般都適合作 為生物催化的介質(zhì)。c o l j ai a a n e 等n 叼詳細(xì)敘述了各種溶劑l 0 9 p 值的計(jì)算方法，并探 討了一些機(jī)理。實(shí)際上可以這樣理解，細(xì)胞在有機(jī)溶劑中實(shí)際是處于一種微水環(huán)境狀 天津科技大學(xué)碩士學(xué)位論文 態(tài)，這種環(huán)境確保了該細(xì)胞基本活性或某些方面的活性，l 0 9 p 值越小，疏水性越差， 相反親水性就越強(qiáng)，而過強(qiáng)的親水性會(huì)將細(xì)胞的微水環(huán)境破壞，從而使細(xì)胞失活。 深入研究有機(jī)溶劑選擇規(guī)律，確定細(xì)胞兩液相培養(yǎng)合適的有機(jī)溶劑，一般認(rèn)為n 刀： 一是根據(jù)有機(jī)溶劑的l 0 9 p 值初步確定一定數(shù)量的不同有機(jī)溶劑；二是在這些有機(jī)溶 劑中，測定代謝產(chǎn)物在有機(jī)溶劑和培養(yǎng)液中的分配系數(shù)，去掉分配系數(shù)小的有機(jī)溶劑； 三是研究在細(xì)胞兩液相培養(yǎng)過程中，留下的不同有機(jī)溶劑對(duì)細(xì)胞生長和催化的影響。 因此要確定細(xì)胞兩液相培養(yǎng)合適的有機(jī)溶劑是研究中難度很大的一項(xiàng)工作，所以有必 要根據(jù)細(xì)胞的生理生化特性和有機(jī)溶劑特性，對(duì)有機(jī)溶劑選擇規(guī)律作深入的研究，探 索更簡便、針對(duì)性更強(qiáng)的選擇方法。 1 3 有機(jī)溶劑對(duì)微生物的影響 1 3 1 有機(jī)溶劑對(duì)細(xì)胞毒害機(jī)理的研究 許多有機(jī)溶劑對(duì)細(xì)胞有毒害作用n 蝴1 ，這也是應(yīng)用微生物轉(zhuǎn)化的一個(gè)重要障礙。 但有機(jī)溶劑對(duì)細(xì)胞毒害機(jī)理的研究還非常少，還不是非常透徹，廣泛接受的觀點(diǎn)是溶 劑對(duì)膜脂的作用，會(huì)引起細(xì)胞膜通透性的增加，使細(xì)胞膜的基本功能喪失，膜蛋白酶 失活，質(zhì)子梯度破壞，運(yùn)輸系統(tǒng)崩潰，或者高濃度時(shí)直接使細(xì)胞裂解，從而將細(xì)胞殺 死。普遍認(rèn)為，溶劑在膜中的積累直接導(dǎo)致了對(duì)膜的破壞，導(dǎo)致生理功能的喪失。一 旦溶劑溶解于細(xì)胞膜中，就會(huì)破壞膜的完整性。目前，還沒有一種單一的技術(shù)可以非 常清楚的監(jiān)測溶劑對(duì)膜結(jié)構(gòu)的影響 從溶劑的深層次毒害機(jī)理來看，它在細(xì)胞膜中的濃度基本決定了毒性的大小。 h e i p i e p e r l 2 l 】等認(rèn)為，膜中的實(shí)際濃度是引起細(xì)胞毒性的重要參數(shù)，i s k e n 等啪1 人的研 究證實(shí)，甲苯、乙苯、環(huán)己胺的存在引起假單胞菌( p s e u d o m o n a s p u t i d a ) s 1 2 生物量 降低的程度依賴于它們在膜中的實(shí)際濃度，而和它們的結(jié)構(gòu)不相關(guān)。對(duì)于某些有機(jī)溶 劑，是由它們的化學(xué)特性所決定的，一般來說疏水性的有機(jī)溶劑對(duì)微生物細(xì)胞毒性較 大，這往往與該溶劑的物理化學(xué)特征如分子表面積、分子量、極性等有關(guān)嘲。另外， 有機(jī)溶劑在膜中的濃度在一定程度上和其l d g p 值密切相關(guān)，也就是說，可以用這一 參數(shù)來表征有機(jī)溶劑對(duì)細(xì)胞的毒性。 1 3 1 1 有機(jī)溶劑種類對(duì)細(xì)胞毒性的影響 在兩液相培養(yǎng)的微生物發(fā)酵中，許多研究者探索了有機(jī)溶劑的分子毒性，認(rèn)為有 機(jī)溶劑的功g p 值能很好地表征有機(jī)溶劑對(duì)細(xì)胞的毒性影響，但得出有機(jī)溶劑對(duì)細(xì)胞 毒性隨有機(jī)溶劑的l o g p 值變化規(guī)律不完全一樣。h o c k n a l lmd 等嘲1 認(rèn)為l o g p 4 的有機(jī)溶劑則無毒性；v c r m u em 等啪3 認(rèn)為l o g p 5 的有 機(jī)溶劑則無毒性。b r u c el 等嗍認(rèn)為l o g p 6 的有機(jī)溶劑則無毒性。這些研究者實(shí)驗(yàn)所用的有機(jī)溶劑有不同的飽和烴、 烯烴、氟代烴、醇、脂、醚和芳香烴等。 為了定量研究有機(jī)溶劑對(duì)生物催化劑活性的影響，l a n n cc 等口刀考察了1 0 7 種有 機(jī)溶劑的介電常數(shù)、偶極矩、氫鍵、極化強(qiáng)度和h g p 值等參數(shù)，認(rèn)為只有i j d g p 值能 很好預(yù)測生物相容性。但這只是一個(gè)經(jīng)驗(yàn)性的結(jié)論，l o g p 值相近的溶劑可能對(duì)微生物 的影響完全不同，如腸沙門氏菌( s a l m o n e l l ae n t e r i c a ) 和大腸桿菌( e s c h e r i c h i ac o l i ) 可以在正己烷( 1 0 9 p ，3 5 ) 存在的環(huán)境中存活，卻不能在環(huán)己胺( 1 0 9 p ，3 2 ) 存在 下保持活性。 1 3 1 2 有機(jī)溶劑處理?xiàng)l件對(duì)細(xì)胞毒害的影響 吳兆亮等囪舯1 在紅豆杉細(xì)胞兩液相培養(yǎng)中，研究了有機(jī)溶劑的加入時(shí)間對(duì)細(xì)胞生 長的影響，結(jié)果表明東北紅豆杉、南方紅豆杉，有機(jī)溶劑在細(xì)胞的生長對(duì)數(shù)期中期至 末期加入使細(xì)胞的濕重、干重和細(xì)胞水含量下降較小。因此為減少有機(jī)溶劑對(duì)細(xì)胞的 毒性，在培養(yǎng)過程中應(yīng)在細(xì)胞的生長對(duì)數(shù)期中期至末期加入對(duì)細(xì)胞生長影響最小。吳 兆亮等在紅豆杉細(xì)胞兩液相培養(yǎng)中，也研究了有機(jī)溶劑的加入量對(duì)細(xì)胞生長影響，結(jié) 果表明東北紅豆杉、南方紅豆杉在有機(jī)溶劑油酸、鄰苯二甲酸二丁脂存在時(shí)，隨著有 機(jī)溶劑體積分?jǐn)?shù)增加，細(xì)胞的濕重、干重和細(xì)胞水含量逐漸下降，有機(jī)溶劑對(duì)細(xì)胞毒 性增加。因此為減少有機(jī)溶劑對(duì)細(xì)胞毒性，有機(jī)溶劑加入量越少越好，但有機(jī)溶劑加 入量太少又起不到萃取作用，有機(jī)溶劑加入量需要有一個(gè)最佳值。 1 3 2 細(xì)胞對(duì)有機(jī)溶劑耐受機(jī)理的研究及進(jìn)展 1 3 2 1 細(xì)胞對(duì)有機(jī)溶劑的耐受機(jī)理 非水相生物轉(zhuǎn)化和涉及有機(jī)溶劑的環(huán)境微生物技術(shù)中，有機(jī)溶劑對(duì)微生物細(xì)胞的 毒性使相關(guān)的研究和應(yīng)用受到制約，這些有機(jī)分子進(jìn)入到細(xì)胞膜中，破壞膜的完整性、 增加膜的通透性，使細(xì)胞死亡；但在一些情況下，某些微生物可以通過自身的抗性機(jī) 制在有機(jī)溶劑中存活，而微生物對(duì)有機(jī)溶劑的耐受性主要取決于物理障礙、細(xì)胞膜水 平、主動(dòng)泵出系統(tǒng)三個(gè)層次上相應(yīng)的生理生化作用洲。 一些學(xué)者認(rèn)為細(xì)胞要對(duì)有機(jī)溶劑產(chǎn)生抗性，就必須對(duì)抗由溶劑引起的細(xì)胞膜通透 性的增加，在該水平上，微生物主要通過h o m c o v i c o u sa d a p t a t i o n 機(jī)制( 簡稱h a 機(jī) 制) 嘲和膜脂中脂肪酸的異構(gòu)化來實(shí)現(xiàn)，是對(duì)有機(jī)溶劑抗性反應(yīng)的最簡單的方式。這 種方式是微生物通過調(diào)整膜中脂肪酸的飽和度和脂酞基的長度來維持膜原有的流動(dòng) 性：通過這種機(jī)制，微生物可以產(chǎn)生一定的抗性；在有機(jī)溶劑存在的情況下，微生物 可以非常迅速的通過特殊的方式，改變順式脂肪酸和反式脂肪酸兩者的比例，來對(duì)抗 細(xì)胞膜通透性的增加，特別是在微生物不支持脂肪酸從頭合成的情況下，雙鍵的異構(gòu) 化機(jī)制可以使它適應(yīng)高濃度的毒性。除了這些被動(dòng)的機(jī)制外，有些微生物還有主動(dòng)的 抗性機(jī)制，將有機(jī)溶劑從細(xì)胞膜中泵出來。 關(guān)于微生物在有機(jī)溶劑中的耐受機(jī)制目前有以下幾種說法嗍： ( 1 ) 細(xì)胞質(zhì)膜的適應(yīng)機(jī)制：脂肪酸飽和度的改變，改變膜的透性和穩(wěn)定性，適應(yīng) 天津科技大學(xué)碩士學(xué)位論文 有機(jī)溶劑的存在。 。 ( 2 ) 外膜水平的適應(yīng)機(jī)制：革蘭氏陰性菌細(xì)胞壁有特有的外膜結(jié)構(gòu)。一些離子能 增強(qiáng)外膜組成的穩(wěn)定性和促使脂多糖組成的改變，從而提高對(duì)有機(jī)溶劑的耐受性。 ( 3 ) 有機(jī)溶劑的改變和排出：有一些微生物通過對(duì)有機(jī)溶劑的改變和降解或迅速、 及時(shí)的排出從而提高微生物對(duì)有機(jī)溶劑的耐性。 另外，研究發(fā)現(xiàn)革蘭氏陰性菌對(duì)有機(jī)溶劑的耐受性比革蘭氏陽性菌強(qiáng)一1 ，主要 因?yàn)楦锾m氏陰性菌有一個(gè)外膜結(jié)構(gòu)，能夠通過外膜脂多糖、脂肪酸的改變及膜上泵出 系統(tǒng)的調(diào)節(jié)，降低有機(jī)溶劑對(duì)細(xì)胞的毒害洲。與革蘭氏陰性菌相比，革蘭氏陽性菌缺 少這樣一層外膜，所以只有少數(shù)幾種革蘭氏陽性菌表現(xiàn)一定的有機(jī)耐受性。 1 3 2 2 細(xì)胞對(duì)有機(jī)溶劑耐受機(jī)理的研究進(jìn)展 盡管有機(jī)溶劑對(duì)微生物有毒害作用，但還是發(fā)現(xiàn)一些對(duì)有機(jī)溶劑有耐性的微生 物，研究較多的是假單胞菌( p p u t i d a ) 和大腸桿菌( e c o l i ) 。有學(xué)者從深海環(huán)境里分 離出對(duì)有機(jī)溶劑有耐性的革蘭氏陽性菌，如一些桿菌類，l i n d s e ye h 0 1 等從油蠅幼蟲體 內(nèi)分離出有耐性的溶血性葡萄球菌( s t a p h y l o c o c c u sh a e m o l y t i c u s ) 和腸球菌 ( e n t e r o c o c c u s ) 。另外，可以誘變一些本不耐有機(jī)溶劑的菌株來獲得有耐性的突變株， 如大腸桿菌( ec o ) k 1 2 。大多數(shù)對(duì)有機(jī)溶劑有耐性的細(xì)菌是革蘭氏陰性菌，只有少 數(shù)革蘭氏陽性菌( b a c i l l u s , 尉t z o d o c o c c u s ，e n t e r o c o c c u s 等) 對(duì)有機(jī)溶劑表現(xiàn)出耐受性h h 蜘 鄭曉東，梅樂和等在酵母對(duì)有機(jī)溶劑耐性的研究一文中闡述了酒精酵母比其他 酵母抗非極性溶劑的能力更強(qiáng)。酵母對(duì)有機(jī)溶劑的抗性不僅與溶劑的極性、毒性、劑 量范圍有關(guān)，而且與酵母細(xì)胞膜的成分、生長培養(yǎng)基、溫度等有關(guān)。當(dāng)生長培養(yǎng)基中 的m 礦濃度提高兩倍時(shí)，多數(shù)菌株對(duì)有機(jī)溶劑的抗性沒有影響。溫度對(duì)所檢測酵母的 生長及對(duì)溶劑的抗性都有一定的影響。 a n a n d akg h o s h 等1 4 4 發(fā)現(xiàn)釀酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 在有機(jī)溶劑刺激 下i c t l p 大量表達(dá)，i c t l p 與磷脂酸的合成有關(guān)，磷脂酸又與磷脂的合成有關(guān)，而膜磷 脂的增加是釀酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 耐有機(jī)溶劑的機(jī)制之一。 j a c o br 掣4 5 l 對(duì)丙酮丁醇梭菌( c l o s t r i d i u ma c e t o b u t y l i c u m ) a t c c8 2 4 與有機(jī)溶 劑耐受性相關(guān)的基因進(jìn)行了系列研究，以便更好的理解有機(jī)溶劑耐性基因的調(diào)控表達(dá) 機(jī)制。 對(duì)有機(jī)溶劑耐受性較強(qiáng)的假單胞菌( p p u t i d a ) ，許多學(xué)者進(jìn)行了大量研究，并得 到很多有價(jià)值的發(fā)現(xiàn)。h o l t w i c k 等【蛔認(rèn)為膜脂肪酸的順反異構(gòu)化，增強(qiáng)了細(xì)胞膜的 強(qiáng)度，降低滲透性，從而改變假單胞菌對(duì)有機(jī)溶劑等逆境的適應(yīng)能力。另外，磷脂合 成的增加、抗生的泵出系統(tǒng)等被認(rèn)為有利于增強(qiáng)假單胞菌( p p u t i d a ) 對(duì)有機(jī)的耐受能 力 4 7 1 。e s t r e h ad u q u e 等【船l 認(rèn)為假單胞菌( p p u t i d a ) 編碼2 0 個(gè)e c f s ( e x t r a c y t o p l a s m i c s i g m af a c t o r s ) ，并研究了其中一個(gè)e c t - p p l 2 ，編碼該e c f 的基因稱為r p o t ，發(fā)現(xiàn)r p o t 在有機(jī)耐受性中扮演重要角色。 1 前言 還有學(xué)者研究了腸沙門氏茵( s a l m o n e l l ae n t e r i c a ) 的流出泵基因a c r b 和操縱子 m a r a 和s o x s ，得出結(jié)論認(rèn)為腸沙門氏菌( s a l m o n e l l ae n t e r i c a ) 對(duì)環(huán)己胺的耐受性與 a c r b 基因有關(guān)【鉀刪。 1 4 大腸桿菌對(duì)有機(jī)溶劑的耐受機(jī)理研究進(jìn)展 r i k i z o a o n o 掣5 1 】研究了有機(jī)溶劑耐性菌株e c o l ik 1 2 突變株的細(xì)胞表面特征，認(rèn) 為e c o l ik 1 2 突變株有機(jī)溶劑耐性提高的細(xì)胞較親本疏水性弱，可能是脂多糖增加的 原因，另外，突變株o m p f 合成受到抑制，o m p c 合成得到表達(dá)，發(fā)現(xiàn)表明有機(jī)溶劑 分子可以通過o m p fp o r i n ；o m p f 的缺失可以直接減少有機(jī)溶劑的通道數(shù)目也間接增 加細(xì)胞表面l p s 序列可用區(qū)域，從而改變e c o l ik 1 2 的耐性。 n o g u e h i 等【5 2 】人認(rèn)為培養(yǎng)環(huán)境中氧濃度提高有利于增強(qiáng)e c o l i 對(duì)有機(jī)溶劑的