食品安全性毒理學(xué)評(píng)價(jià)書.doc

第一章 體外試驗(yàn)與生物新技術(shù) 在毒理學(xué)中的應(yīng)用第一節(jié) 體外試驗(yàn) 毒性試驗(yàn)的目的在于獲取一定的數(shù)據(jù)，為社會(huì)需要的外源化學(xué)物的安全使用做出判斷。過去利用整體實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型或稱體內(nèi)試驗(yàn)(in vivo test)模型所提供的資料，判斷外源化學(xué)物及其制品和混合物等對(duì)人類健康是否具有損害作用。體外試驗(yàn)?zāi)Ｐ?in vitro test)在上述過程中也起著重要的作用，尤其是機(jī)理研究方面。但是，在毒理學(xué)研究中整體試驗(yàn)研究的觀點(diǎn)仍占主導(dǎo)地位。目前，此種觀點(diǎn)已發(fā)生變化，因?yàn)椋喝澜缑磕昙s有千種以上的新化合物作為商品進(jìn)入人類的環(huán)境。而且在現(xiàn)有的化合物中，還有相當(dāng)數(shù)量沒有進(jìn)行必要的毒理學(xué)評(píng)價(jià)。在此種情況下，利用經(jīng)典的整體動(dòng)物試驗(yàn)取得完整的毒理學(xué)資料極為困難。解決此種問題的重要方向是體外試驗(yàn)?，F(xiàn)有的整體動(dòng)物毒性試驗(yàn)方法需消耗大量的時(shí)間和昂貴的經(jīng)費(fèi)，而體外試驗(yàn)則可節(jié)省時(shí)間和經(jīng)費(fèi)。動(dòng)物保護(hù)主義運(yùn)動(dòng)的興起，要求盡量減少動(dòng)物的使用，而且應(yīng)當(dāng)盡量減少痛苦地處理動(dòng)物。更重要的是由于生物技術(shù)的巨大進(jìn)步，不僅表現(xiàn)在細(xì)胞組織及器官培養(yǎng)領(lǐng)域，而且在生物分子技術(shù)方面，也為毒性試驗(yàn)和研究提供了新的方法和工具。所以體外試驗(yàn)在毒理學(xué)研究中所占的地位日趨重要，甚至有占主導(dǎo)地位的趨勢。但也需指出，體外試驗(yàn)的發(fā)展，并不排斥體內(nèi)試驗(yàn)本身的重要性，兩者必須相互補(bǔ)充、相互驗(yàn)證才能為毒理學(xué)研究提供堅(jiān)實(shí)的科學(xué)基礎(chǔ)。 一、概述 (一) 分類 毒性試驗(yàn)的目的是提供一些適當(dāng)?shù)馁Y料，以便確定有關(guān)化學(xué)物的毒理學(xué)性質(zhì)。在有些情況下，是要決定一種化學(xué)物在所預(yù)期的條件下使用是否安全，如新藥物開發(fā)即需要這一評(píng)價(jià)。在有些情況下，例如新工業(yè)品或日用化學(xué)品的開發(fā)，必須決定一種新化學(xué)物的接觸安全限量。了解體外毒性試驗(yàn)在上述毒理學(xué)決策過程中有何意義，對(duì)于評(píng)價(jià)體外毒性試驗(yàn)在毒理學(xué)中的地位極有幫助?？梢罁?jù)體外試驗(yàn)在決策過程中所起的作用將其分為3類：篩選試驗(yàn)。它僅提供決策過程的最初的資料，還需要進(jìn)行更權(quán)威的試驗(yàn)，無論是整體還是體外試驗(yàn)。附加試驗(yàn)。它可為協(xié)作部門或法律部門的最終決策過程提供有用的資料，如機(jī)理的研究，但僅有它是不夠充分的。替代試驗(yàn)。它是在大量實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，使體外毒性試驗(yàn)?zāi)芴娲w動(dòng)物試驗(yàn)，以提供更多的信息。 (二) 基本原理 體外試驗(yàn)的基本原理是所觀察到的毒理學(xué)效應(yīng)均是毒物和或反應(yīng)活性代謝產(chǎn)物在敏感性細(xì)胞上或敏感細(xì)胞內(nèi)某一分子靶部位作用的結(jié)果。如將敏感細(xì)胞或某分子靶部位例如酶，在體外條件下，維持其正常的生理功能，并觀察外源化學(xué)物對(duì)其的影響，即將毒理學(xué)中毒物中毒的啟動(dòng)階段，在體外條件下，觀察其對(duì)外源化合物的反應(yīng)和外源化學(xué)物對(duì)它的作用。基于上述原理，體外試驗(yàn)?zāi)Ｐ腿〔姆秶軐?，可取哺乳?dòng)物的離體臟器灌流、臟器切片溫育、細(xì)胞培養(yǎng)、亞細(xì)胞器組份以及提純的某些酶分子或DNA分子等等。 (三) 體外試驗(yàn)的優(yōu)缺點(diǎn) 體外毒性試驗(yàn)的優(yōu)點(diǎn)可歸納在表121。表12-1 體外毒性試驗(yàn)系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)能控制環(huán)境因素可排除相互作用的系統(tǒng)如免疫系統(tǒng)、神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的影響每一劑量水平可利用大量的生物樣品，如細(xì)胞，細(xì)胞器等試驗(yàn)間的誤差較少可同時(shí)和或反復(fù)多次取樣可做成復(fù)雜的互相作用的試驗(yàn)系統(tǒng)，如復(fù)合細(xì)胞培養(yǎng)等較為快速和經(jīng)濟(jì)需要較小量的受試化合物產(chǎn)生較小量的有毒廢物可以利用人體細(xì)胞減少整體動(dòng)物的使用 其中特別值得一提的優(yōu)點(diǎn)是體外試驗(yàn)的簡便和易于利用人體細(xì)胞。體外毒性試驗(yàn)結(jié)果可迅速得出，將減少了解新化學(xué)物毒理學(xué)資料所需的時(shí)間，最終可以縮短從新化學(xué)物的合成到產(chǎn)品進(jìn)人市場的時(shí)間過程。此外，對(duì)鑒定毒理學(xué)資料有問題的新化學(xué)物，可及時(shí)終止開發(fā)，減少由資源到產(chǎn)品的投入。在毒理學(xué)整體試驗(yàn)中禁止直接進(jìn)行人體試驗(yàn)。但毒理學(xué)試驗(yàn)的目的是關(guān)心人類健康，目前主要是將動(dòng)物試驗(yàn)結(jié)果外推至人類，物種間差異為其不確定因素之一。在體外試驗(yàn)中，利用人體細(xì)胞組織進(jìn)行試驗(yàn)，可較好地解決物種差異的問題。 體外毒性試驗(yàn)系統(tǒng)的利用在目前尚有不足之處：體外到體內(nèi)外推的問題。體外試驗(yàn)是依據(jù)毒性作用的始發(fā)階段及繼續(xù)發(fā)生的分子與細(xì)胞反應(yīng)，其與整體系統(tǒng)有差異，如何將產(chǎn)生體外毒性的體外濃度與相應(yīng)體內(nèi)劑量聯(lián)系的問題是最終未解決的難題。它需要更好的工具預(yù)測性毒物代謝動(dòng)力學(xué)來解決，其關(guān)鍵在于發(fā)展有生理學(xué)基礎(chǔ)的毒物代謝動(dòng)力學(xué)模型。另一方面，體外毒性試驗(yàn)中缺乏毒理學(xué)反應(yīng)的調(diào)控因素，如細(xì)胞與組織的修復(fù)過程和免疫系統(tǒng)的不同類型細(xì)胞間的相互影響等。假如有了更全面的毒理學(xué)過程的基礎(chǔ)知識(shí)，可設(shè)計(jì)更符合整體動(dòng)物模型的體外系統(tǒng)。但現(xiàn)階段毒理學(xué)作為一個(gè)學(xué)科的發(fā)展尚缺少許多重要的資料。體外毒性試驗(yàn)難以預(yù)測慢性毒性。因?yàn)?，慢性毒性病理過程的機(jī)理所知甚少，缺乏發(fā)展體外試驗(yàn)的理論依據(jù)，再者，某些體外系統(tǒng)仍難以達(dá)到長期維持生理狀態(tài)的要求。 二、體外試驗(yàn)系統(tǒng) (一) 臟器灌流 1. 肝臟灌流 是毒理學(xué)中研究外源化合物對(duì)肝臟損傷及代謝的常見方法。在灌流液中加入外源化學(xué)物，此外要維持灌流液的pH值、氧含量，還要控制適宜的灌流液流速。一般是以下腔靜脈和門靜脈為插管灌流通路，為此應(yīng)結(jié)扎肝動(dòng)脈、上腔靜脈，在恒溫條件下灌流。有報(bào)道用肝灌流方法研究四氯化碳及其氫取代衍生物三氯甲烷與二氯甲烷對(duì)肝臟毒性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨著灌流時(shí)間延長(在4h之內(nèi))，灌流液的上清液中K+、谷丙轉(zhuǎn)氨酶(SCPT)、山梨醇脫氫酶(SDH)、谷氨酸脫氫酶(GDH)增加，說明三種化合物對(duì)肝細(xì)胞均有損傷，而以四氯化碳為最，且依氯原子被氫取代肝毒減低。需指出肝灌流時(shí)間不能過久，以4h之內(nèi)為宜，否則肝細(xì)胞的功能與生存不能維持。 2. 腸灌流 利用某一部分小腸體外灌流可以研究一些化合物的吸收及動(dòng)力學(xué)過程。如用大鼠，則在麻醉下切腹分離一段小腸，在保持原有血液循環(huán)體系下，將腸兩端插管，清洗凈腸中內(nèi)容物，在恒溫環(huán)境中灌入灌流液。例如有人研究鋅的吸收及其影響因素，以大鼠回腸段為標(biāo)本，證實(shí)鋅吸收呈二室模型(腸腔為室、腸粘膜為室)，苯丙氨酸能增加腸腔與腸粘膜之間鋅的交換，且加速向血流的清除過程。 3. 膈肌-膈神經(jīng)標(biāo)本 取完整的大鼠膈肌-膈神經(jīng)置于恒溫灌流液中，在幾小時(shí)之內(nèi)可維持基本正常的神經(jīng)肌肉傳導(dǎo)。這種標(biāo)本可用在研究神經(jīng)毒物對(duì)神經(jīng)傳導(dǎo)功能的損傷及強(qiáng)度。 (二) 臟器切片 肝臟、腎臟、腦部及心均可以制備切片。例如，腦片和心肌條等是將組織片置于恒溫的孵育液中進(jìn)行有關(guān)試驗(yàn)研究，但需注意切片中的細(xì)胞需保持完好的細(xì)胞基質(zhì)和細(xì)胞之間的交流。切片厚度一般在250m。不同研究期間有別，如肝切片研究CytP-450不應(yīng)超過8h，腦切片一般在6h左右。此系統(tǒng)的優(yōu)點(diǎn)是保持了細(xì)胞之間的結(jié)構(gòu)，其操作也比臟器灌流容易。不足之處是切片內(nèi)的細(xì)胞易于缺氧，且受試物也不易均勻到達(dá)細(xì)胞內(nèi)。 (三) 原代細(xì)胞培養(yǎng) 1. 肝細(xì)胞原代培養(yǎng) 肝細(xì)胞尚未建成傳代的細(xì)胞株系，多用原代培養(yǎng)。肝細(xì)胞原代培養(yǎng)期間細(xì)胞不分裂、不增殖，但發(fā)現(xiàn)基因轉(zhuǎn)錄是存在的(培養(yǎng)初期24h在1或以上)。細(xì)胞原代培養(yǎng)維持生存期12周，但是CytP-450卻在2428h活性減少50左右。據(jù)報(bào)道人肝細(xì)胞中CytP-450活性穩(wěn)定性比大鼠強(qiáng)。 利用原代培養(yǎng)的肝細(xì)胞可以進(jìn)行多種毒理學(xué)研究。如研究化學(xué)物的肝臟毒性，一般認(rèn)為，用原代肝細(xì)胞培養(yǎng)篩檢與鑒定是否化學(xué)物具有肝臟毒性較為可靠，與體內(nèi)試驗(yàn)相符合。有報(bào)道以肝細(xì)胞損傷后某些酶釋放為指征，研究30個(gè)化學(xué)物，結(jié)果除少數(shù)化學(xué)物在肝細(xì)胞培養(yǎng)中表現(xiàn)毒性比體內(nèi)試驗(yàn)低之外，多數(shù)化學(xué)物內(nèi)外毒性符合一致。在體外試驗(yàn)表現(xiàn)毒性較低的化學(xué)物有環(huán)已酰胺(cycloheximiole)、溴苯(bromobenzene)和長春新堿(vincristine)等。 2. 巨噬細(xì)胞 豚鼠或大鼠都可以肺灌洗方法獲取肺巨噬細(xì)胞，小鼠可用腹腔灌洗獲得腹腔巨噬細(xì)胞，甚至人也可通過肺灌洗得到。巨噬細(xì)胞可以用于多種體外試驗(yàn)，例如利用巨噬細(xì)胞的免疫功能檢測外源化學(xué)物的免疫毒性，又如利用巨噬細(xì)胞檢測以肺臟為毒理學(xué)終點(diǎn)的外源化學(xué)物的中毒毒性和機(jī)理。關(guān)于后者，有人利用豚鼠肺巨噬細(xì)胞原代培養(yǎng)純化后，研究二氧化硅(silica，SiO2)致矽肺的機(jī)理。 3. 淋巴細(xì)胞 多用小動(dòng)脈脾臟分離淋巴細(xì)胞或進(jìn)一步分離T、B淋巴細(xì)胞進(jìn)行免疫毒理研究。例如研究鎘的免疫毒性，證明鎘可以抑制淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化和抑制白細(xì)胞介素-2的產(chǎn)生，且在一定條件下使淋巴細(xì)胞內(nèi)游離鈣濃度增加及鈣調(diào)素(CaM)活性降低，此為鎘的免疫毒性機(jī)理研究提供了線索。 4. 腦細(xì)胞 分離的新鮮腦細(xì)胞有助于研究外源化學(xué)物對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)損傷的評(píng)價(jià)與探討其機(jī)理如用小鼠大腦皮質(zhì)分離、溫育后，研究二價(jià)陽離子鈣、鎂、鋅、鎘等對(duì)皮層神經(jīng)細(xì)胞的損傷，發(fā)現(xiàn)這些離子隨著濃度的增加，腦神經(jīng)細(xì)胞的電泳遷移率逐漸減慢。 隨著腦細(xì)胞技術(shù)的發(fā)展，還可在溫育體系中存在外源化學(xué)物情況下，用微電極插入腦細(xì)胞，通過電信號(hào)的變化，更深入地研究外源化學(xué)物對(duì)神經(jīng)細(xì)胞的功能損傷。 5. 心肌細(xì)胞 心肌細(xì)胞用于毒理學(xué)研究的報(bào)道目前還較少。用新生12日齡大鼠心室肌分離心肌細(xì)胞，原代培養(yǎng)4天后，將微電極(直徑0.5um)插入細(xì)胞內(nèi)，研究鎘對(duì)心肌的影響。經(jīng)記錄、分析各心肌細(xì)胞動(dòng)作電位參數(shù)，結(jié)果鎘在520molL濃度下，可使心肌細(xì)胞動(dòng)作電位及最大除極速率顯著降低，表明鎘對(duì)心肌有直接的毒性效應(yīng)。 此外，將分離的心肌細(xì)胞于培養(yǎng)的2448h期間，利用膜片鉗的連細(xì)胞電壓鉗法，描記心肌細(xì)胞上的B型、L型及T型3種Ca2通道的單通道活動(dòng)。當(dāng)在培養(yǎng)液中加入10molL氯化鎘之后，B型通道開放時(shí)間縮短13、關(guān)閉時(shí)間延長45.1、通道開放概率下降55，L型通道開放時(shí)間縮短40.7、關(guān)閉時(shí)間延長23.1、通道開放概率下降50，而對(duì)T型通道無影響。進(jìn)一步證實(shí)鎘對(duì)心肌有毒性效應(yīng)。 (四) 細(xì)胞培養(yǎng) 有些臟器細(xì)胞建立了傳代培養(yǎng)技術(shù)，建成有穩(wěn)定遺傳特征的細(xì)胞株系。有的利用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)建立了特殊的試驗(yàn)方法。 1. 腎細(xì)胞 由于腎小管，尤其是腎近曲管是腎臟重要的功能單位，目前已經(jīng)建立了幾種腎近曲管細(xì)胞株系用于毒理學(xué)研究。例如1926年Hull等人選育傳代培養(yǎng)的LLC-PK1細(xì)胞是來源于Hampshire豬。據(jù)報(bào)道此株系細(xì)胞的各種生物學(xué)特征已進(jìn)行了相當(dāng)深入的研究(包括激素應(yīng)答反應(yīng)、物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)特征、細(xì)胞的代謝功能和標(biāo)志等)。此后又建立了從鼬(opossum)獲得的OK株系、從兔獲得的RC-SVI株系。 近年國內(nèi)利用300次傳代培養(yǎng)的LLCPKl細(xì)胞系對(duì)鉛的腎毒進(jìn)行了研究，包括鉛對(duì)細(xì)胞的損傷、對(duì)細(xì)胞膜脂流動(dòng)性的影響、對(duì)細(xì)胞膜相變溫度的影響、脂質(zhì)過氧化效應(yīng)、胞內(nèi)鈣濃度變化及形態(tài)學(xué)改變等，這對(duì)鉛的腎臟毒性機(jī)理提供了依據(jù)。 2. 胚胎細(xì)胞 利用胚胎細(xì)胞體外培養(yǎng)，篩檢和研究外源化學(xué)物的毒性效應(yīng)。例如我國用人胚肺纖維母細(xì)胞傳代培養(yǎng)人胚肺二倍體細(xì)胞，已建立了以2BS為代表的株系。此株系在用于篩檢致癌物方面做了一些工作。如人胚肺二倍體細(xì)胞在10-710-8molL苯并(a)芘長達(dá)2838代傳代培養(yǎng)下，電鏡鏡檢發(fā)現(xiàn)細(xì)胞核外形不規(guī)則、核膜深陷、出現(xiàn)細(xì)橋(tiny bridge)伴分葉核形成、核內(nèi)胞漿包涵體、核仁巨大或多核等細(xì)胞癌變特征。 此外，人胚主動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞也可作為標(biāo)本傳代培養(yǎng)研究金屬的毒理。 近十年來，毒理學(xué)相繼引入嚙齒類動(dòng)物的著床前全胚胎培養(yǎng)技術(shù)(pre-implantatation whole embryo culture)、著床后全胚胎培養(yǎng)技術(shù)(post-implantation whole embryo culture)，以及器官培養(yǎng)如腭板培養(yǎng)、胚胎枝芽體外培養(yǎng)等篩檢致畸化學(xué)物均取得一些成果。 (五) 組織勻漿 取臟器除血污制備組織勻漿，是用物理學(xué)方法使細(xì)胞壁破壞，細(xì)胞組成成分與細(xì)胞間質(zhì)混合形成混懸液。利用勻漿為標(biāo)本主要是研究外源化學(xué)物對(duì)細(xì)胞酶系統(tǒng)的毒理作用。最常使用的是腦勻漿、肝勻漿，雖然肺、腎、腸等臟器也可制備勻漿，但是因纖維結(jié)締組織或肌細(xì)胞不易破碎影響勻漿的質(zhì)量。 文獻(xiàn)中有機(jī)磷化合物對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)Ache抑制的強(qiáng)度及特征，大量工作是通過以腦勻漿為標(biāo)本，主要是以哺乳動(dòng)物、嚙齒類和昆蟲的腦完成的。不少外源化學(xué)物的代謝和以肝臟為靶器官的外源化學(xué)物的毒性效應(yīng)特征與機(jī)理是通過肝勻漿進(jìn)行的。現(xiàn)雖然不少工作已為其它技術(shù)所取代，但是應(yīng)用勻漿作為過篩與初步研究還是有用的，主要因其制備方法簡單、制備周期很短，且不需復(fù)雜的設(shè)備。 (六) 亞細(xì)胞組分 將細(xì)胞中各亞細(xì)胞組分分離和純化，對(duì)于深入研究外源化學(xué)物的靶位點(diǎn)、探討化學(xué)物毒性效應(yīng)的機(jī)理均十分重要。它較組織勻漿優(yōu)越，排除了勻漿中其它因素的影響?，F(xiàn)代毒理學(xué)中使用最多的亞細(xì)胞組分是細(xì)胞膜、微粒體及線粒體。 1. 細(xì)胞膜 人與動(dòng)物紅細(xì)胞分離后低滲溶血，高速低溫離心可制得紅細(xì)胞膜(或稱血影，ghost)。血影為常用的細(xì)胞膜標(biāo)本。此外肺巨噬細(xì)胞、肺細(xì)胞、突觸小體等均可制備膜標(biāo)本(先將細(xì)胞勻漿破膜，低溫差速離心、梯度離心制備)。使用細(xì)胞膜可以進(jìn)行很多的毒理試驗(yàn)，尤其是在探討化學(xué)物中毒機(jī)理方面。 以紅細(xì)胞膜為例，用人工細(xì)胞為標(biāo)本與0.1mmolL鉛作用僅5min，紅細(xì)胞膜遠(yuǎn)紫外色譜就出現(xiàn)改變，表明膜蛋白的構(gòu)象發(fā)生了變化。 神經(jīng)末梢斷裂脫落的突觸體(synaptosome)具有類似完整細(xì)胞的功能，除可利用突觸體作為標(biāo)本外，還可進(jìn)一步制備突觸體膜(synaptosome membrane)。實(shí)驗(yàn)表明對(duì)硫磷在510-9molL水平即可抑制突觸體的攝鈣功能，并引起突觸體膜脂流動(dòng)性下降。 近年來為純化實(shí)驗(yàn)條件，以利于從分子水平研究外源化學(xué)物的毒效應(yīng)機(jī)理，已將人工膜引入毒理學(xué)研究。所謂人工膜，即是以正常細(xì)胞膜的膜脂組分，人工合成后用之在定介質(zhì)中形成人工膜。 2. 微粒體(microsome) 尤其是肝細(xì)胞制備的微粒體常作為毒理學(xué)研究的標(biāo)本，這是由于肝臟代謝酶系主要存在于肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，即肝細(xì)胞的亞細(xì)胞組分分離后的微粒體中。 有報(bào)道TNT在無氧而加人NADPH環(huán)境下與微粒體溫育，用ESR波譜儀檢測出硝基陰離子自由基(Ar-NO2)；而在有氧環(huán)境中能迅速與分子氧反應(yīng)生成硝基化合物與超氧陰離子(O2 )。 3. 線粒體(mitochondria) 它是細(xì)胞中進(jìn)行呼吸作用的主要場所。據(jù)報(bào)道溴氰菊酯(decamethin)在體外試驗(yàn)中，對(duì)線粒體呼吸功能有明顯抑制作用。又據(jù)報(bào)道鎘對(duì)大鼠肝細(xì)胞線粒體Ca2+-ATPase有抑制作用，且使線粒體膜脂流動(dòng)性下降。 (七) 酶 外源化學(xué)物對(duì)機(jī)體的毒性效應(yīng)，往往表現(xiàn)某種或某些酶的活性變化上，即可以利用標(biāo)志酶活性的變化反映化學(xué)物所損傷的靶器官。 在體外毒理學(xué)中則主要是定量研究外源化學(xué)物對(duì)靶酶作用的特征、性質(zhì)和機(jī)理。此類研究的基礎(chǔ)工作是純化酶，如獲得純化酶，可在體外精確地控制各種因素，對(duì)純化酶作用的體征、性質(zhì)和機(jī)理進(jìn)行研究，如細(xì)胞色素P-450重組系統(tǒng)。由于酶的提純技術(shù)復(fù)雜，故而在一般毒理學(xué)研究中多用臟器勻漿和亞細(xì)胞組分作為酶源。雖然這些酶源標(biāo)本含有多酶成分，但是只要測定酶活性的條件適宜，完全可以得到良好的結(jié)果。 有報(bào)道金屬離子Cd2+、Hg2+、Pb2+對(duì)一些鈣調(diào)素依賴酶就具有雙向效應(yīng)，即在低濃度時(shí)可以激活這些酶，而高濃度時(shí)又可抑制酶的活性。 文獻(xiàn)中早已證明有機(jī)磷化合物的主要靶酶是AChE。經(jīng)酶動(dòng)力學(xué)分析，有機(jī)磷化合物與AChE底物ACh呈競爭性；即有機(jī)磷化合物對(duì)AChE為競爭性的不可逆性抑制物。但是不同結(jié)構(gòu)的有機(jī)磷化合物對(duì)AChE的親合力可有很大差別。 第二節(jié) 哺乳動(dòng)物細(xì)胞制備和培養(yǎng) 一、概述 到目前為止，分離的細(xì)胞是毒理學(xué)中使用最廣泛和最深入的體外實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)。體外系統(tǒng)分離的細(xì)胞包括懸浮液中的新鮮游離細(xì)胞、原代培養(yǎng)細(xì)胞、細(xì)胞株、細(xì)胞系及復(fù)合培養(yǎng)的細(xì)胞。在毒理學(xué)中以哺乳動(dòng)物細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的替代系統(tǒng)日漸廣泛，造成這種趨勢的原因有三：一是來自公眾要求減少實(shí)驗(yàn)中使用動(dòng)物數(shù)量的壓力；二是非整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)可顯著地減少常規(guī)整體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)所需的高額費(fèi)用；三是人們?cè)絹碓讲粷M意實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與人體結(jié)果之間相關(guān)性的缺乏。利用細(xì)胞，可更嚴(yán)格控制實(shí)驗(yàn)條件，有效地研究毒性作用的生化機(jī)理。表12-2詳細(xì)列出細(xì)胞在毒理學(xué)中應(yīng)用的優(yōu)缺點(diǎn)。 表12-2 體外系統(tǒng)細(xì)胞在毒理學(xué)中應(yīng)用的優(yōu)、缺點(diǎn) 優(yōu)點(diǎn) 改善效率，減少費(fèi)用 使用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物較少 僅需少量的受試物 較大程度控制細(xì)胞族的性狀 直接控制胞外基質(zhì)、化學(xué)物濃度及接觸時(shí)間 排除可能的混淆因素如激素；神經(jīng)系統(tǒng)或免疫系統(tǒng)的影響 可從同一實(shí)驗(yàn)體系重復(fù)取樣 缺點(diǎn) 缺少整個(gè)器官的形態(tài)學(xué)觀察 選擇性喪失整體器官特異性功能，如毒性代謝酶的喪失 缺乏可能的調(diào)節(jié)影響因素如激素，神經(jīng)系統(tǒng)或免疫系統(tǒng)， 一般為靜態(tài)系統(tǒng)，將導(dǎo)致營養(yǎng)物質(zhì)的逐漸減少和代謝終產(chǎn)物的逐漸累積。 多為短期試驗(yàn)，對(duì)亞慢性或慢性毒性的評(píng)估價(jià)值不大表12-3 毒理學(xué)研究中常用細(xì)胞各種物種的成纖維細(xì)胞淋巴母細(xì)胞腹水瘤細(xì)胞淋巴細(xì)胞角質(zhì)細(xì)胞肝 細(xì) 胞肝癌細(xì)胞腎臟髓質(zhì)和皮質(zhì)細(xì)胞肺的各種類型細(xì)胞培養(yǎng)的背根膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)的睪丸細(xì)胞膀胱細(xì)胞心臟細(xì)胞脊髓微血管細(xì)胞脂肪細(xì)胞 由于哺乳細(xì)胞作為體外實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的優(yōu)越性，在毒理學(xué)中，已有許多不同類型細(xì)胞應(yīng)用于毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)。表12-3為毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)中常用的細(xì)胞類型，其中有些細(xì)胞可來源于人體組織。利用哺乳動(dòng)物細(xì)胞進(jìn)行毒理學(xué)體外實(shí)驗(yàn)有兩種方法：一是建立正在迅速生長的細(xì)胞株，用以觀察受試物對(duì)整體細(xì)胞的一般毒作用和正在分裂組織的毒作用；二是利用已高度分化的細(xì)胞，無論是原代培養(yǎng)或是特定的細(xì)胞株，研究受試物對(duì)已分化成熟的細(xì)胞或其功能的特殊毒作用； 二、基本技術(shù)（一） 儀器與設(shè)備 1. 培養(yǎng)箱 一般來說，在5CO2，95空氣和99的相對(duì)濕度的條件下，許多細(xì)胞可存活。故細(xì)胞培養(yǎng)的關(guān)鍵設(shè)備是CO2培養(yǎng)箱。其基本要求：精確地溫度控制調(diào)節(jié)，一般在土0.5，箱內(nèi)溫度的均衡可依賴風(fēng)扇；CO2濃度調(diào)節(jié)，利用CO2傳感器監(jiān)測箱內(nèi)CO2濃度；使箱內(nèi)大氣為5CO2，95空氣；箱內(nèi)濕度，可用水盤來維持。有的細(xì)胞培養(yǎng)可以不控制CO2分壓。例如，原代肝細(xì)胞培養(yǎng)，可用LeibovitzL-5介質(zhì)，不需CO2，而要求敞開培養(yǎng)瓶，以供給較高的O2分壓。 2. 冰箱和冷柜 冰箱(4)用于存放培養(yǎng)介質(zhì)，冷柜(20)則存放酶，(如胰蛋白酶)和某些培養(yǎng)介質(zhì)如谷氨酸和血清。 3. 顯微鏡 最基本的配置是一臺(tái)簡單的倒置顯微鏡，用作日常觀察培養(yǎng)中的細(xì)胞，以便依據(jù)細(xì)胞生長狀況，進(jìn)行調(diào)整或?qū)ξ廴具M(jìn)行補(bǔ)救或處理。進(jìn)行進(jìn)一步的研究，則需要更高級(jí)的顯微鏡，例如，相差顯微鏡或熒光顯微鏡，并附有照相裝置或攝影裝置。 4. 超凈工作臺(tái) 在沒有無菌操作室的條件下；可用超凈工作臺(tái)。它是一無菌操作裝置，主要是利用鼓風(fēng)機(jī)，驅(qū)動(dòng)空氣通過高效濾膜凈化后，緩緩?fù)ㄟ^工作臺(tái)面，使工作部位構(gòu)成無菌環(huán)境。它具有占地面積小，操作方便等優(yōu)點(diǎn)，但它尚難絕對(duì)除去病毒類微生物，而且灰塵過多對(duì)凈化作用不利，故超凈工作臺(tái)最好安置在清潔無塵的房間。 5. 清洗和消毒設(shè)置：培養(yǎng)中所用玻璃器皿可用電熱干燥箱消毒，要求溫度160以上，最好使用較大規(guī)格的干燥箱，如650500500mm。 器皿的清洗可用超聲波洗滌器。吸管的清洗采用虹吸原理制成的沖洗裝置。金屬器械如解剖刀、虹膜剪、鑷子、尖鑷、止血鉗等可用高壓蒸汽消毒。 6. 培養(yǎng)器皿 為了清洗的方便，塑料瓶皿正逐步取代玻璃瓶皿。特制的塑料瓶皿具有透明、平滑、無毒性、有利于細(xì)胞生長的優(yōu)點(diǎn)。主要的塑料瓶皿有；多孔培養(yǎng)板，其規(guī)格有4孔、6孔、24孔及96孔，它體積小，適于少量細(xì)胞或單個(gè)細(xì)胞克隆的生長；培養(yǎng)皿，規(guī)格有直徑30mm、60mm及l(fā)00mm，與玻璃培養(yǎng)皿相同，尤其有利于集落形成和細(xì)胞轉(zhuǎn)化等試驗(yàn)；培養(yǎng)瓶，帶有螺旋蓋塞，規(guī)格有30ml、50ml、l00ml及500ml，適于在CO2培養(yǎng)箱中使用；其它：凍存細(xì)胞的塑料安瓿及微量加樣器頭，后者的規(guī)格有20010001和1l100l二種。 玻璃器皿在實(shí)驗(yàn)室仍不能完全被塑料制品取代，除培養(yǎng)皿和培養(yǎng)瓶外，主要還有：吸管，它包括刻度吸管和移液管，常用規(guī)格有l(wèi)0ml，5ml和lml；玻璃瓶，用于配制各種培養(yǎng)液的儲(chǔ)貯存液和血清等，可用生理鹽水瓶或血漿瓶代替，規(guī)格有500ml、250ml和l00ml； 離心管，規(guī)格有50ml、l0ml和5ml，用于細(xì)胞洗滌。 7. 液氮貯存器 貯存細(xì)胞多用液氮，液氮溫度在-196，具有經(jīng)濟(jì)、省力和能較好保持細(xì)胞生物學(xué)特性的優(yōu)點(diǎn)。液氮貯存器有25L和50L兩種規(guī)格，它與液氮運(yùn)輸瓶，或稱杜瓦瓶不同，因液氮貯存器一般每兩周需補(bǔ)充一次液氮。如有需要可配置貯存器和運(yùn)輸瓶。 8. 水純化裝置 細(xì)胞培養(yǎng)對(duì)水的要求較高，通常要求使用三次蒸餾水配制各種培養(yǎng)液。對(duì)玻璃器皿也應(yīng)用純水清洗。但是，在細(xì)胞培養(yǎng)中，不宜使用去離子純水，因其不能有效地去除有機(jī)物。 實(shí)驗(yàn)室應(yīng)配備自動(dòng)加水石英玻璃管加熱的蒸餾器，具有蒸餾速度快，使用安全等優(yōu)點(diǎn)。外購蒸餾水或去離子，應(yīng)在本實(shí)驗(yàn)室重蒸后使用。對(duì)水質(zhì)量應(yīng)經(jīng)常檢測，如pH和電導(dǎo)系數(shù)。同一實(shí)驗(yàn)盡量使用同一水源，避免水質(zhì)量造成結(jié)果的差異。 9. 濾過消毒裝置 培養(yǎng)介質(zhì)不能經(jīng)高壓蒸汽消毒，而需通過孔徑為0.22l的濾膜過濾消毒。濾過消毒裝置由抽氣泵(水流玻璃抽氣泵或真空泵)、安全瓶、抽濾瓶和濾器組成。10. 一般設(shè)備 離心機(jī)，用于對(duì)細(xì)胞懸液離心處理，以達(dá)到細(xì)胞洗滌、調(diào)節(jié)細(xì)胞濃度等。 天平，包括普通臺(tái)秤、扭力天平和分析天平，用于配制各種培養(yǎng)液、酶消化液及生理鹽水等。 酸度計(jì)，用于準(zhǔn)確調(diào)整各種介質(zhì)及生理鹽水的pH。 電磁攪拌器，微量加樣器等。 (二) 培養(yǎng)用液 指細(xì)胞培養(yǎng)中所使用的溶液，如培養(yǎng)液、消化液、pH調(diào)整液、染液及細(xì)胞洗滌液等。培養(yǎng)液的選擇取決于細(xì)胞生長的要求，故它是維持細(xì)胞生存和生長所需的基本溶液，它的主要成分為平衡鹽溶液和適應(yīng)細(xì)胞體外培養(yǎng)的各種溶液。 培養(yǎng)液在制備過程中應(yīng)嚴(yán)格操作，避免混入雜質(zhì)。應(yīng)特別注意下列問題：容器，應(yīng)仔細(xì)認(rèn)真清洗，必要時(shí)須消毒；水，三次重蒸蒸餾水；嚴(yán)格選擇品質(zhì)優(yōu)良的藥品；制備好的培養(yǎng)介質(zhì)要標(biāo)明名稱、配制日期及配制者；貯存與消毒。 1. 平衡鹽溶液 常用的有Hanks液、Eagle液及磷酸鹽緩沖液 (PBS)等。它具有維持滲透壓、控制酸堿度平衡的作用及供給細(xì)胞生存所需的能量和無機(jī)鹽的成分。它是配制各種培養(yǎng)介質(zhì)的基礎(chǔ)溶液，也是洗滌細(xì)胞的溶液。 2. 小牛血清 是細(xì)胞培養(yǎng)中最常見的天然培養(yǎng)基，它具有豐富的營養(yǎng)物質(zhì)，對(duì)細(xì)胞附著和保護(hù)也有明顯的作用。但它有成分較為復(fù)雜、個(gè)體差異較大、來源也有一定的限制等不足。彌補(bǔ)個(gè)體差異的辦法是對(duì)血清進(jìn)行無菌檢測和支持生長能力測定后，混合使用。天然培養(yǎng)基除小牛血清外，還有雞血漿、雞胚浸出液、水解乳蛋白和鼠尾膠原等。 3. 合成培養(yǎng)基 系依據(jù)天然培養(yǎng)基的成分，用化學(xué)物質(zhì)模擬合成的。如最簡單的MEMEagle培養(yǎng)液，包括12種必需氨基酸、谷氨酸胺和8種維生素。根據(jù)需要可添加某些成分，如碳水化合物(葡萄糖、核糖、脫氧核糖及丙酮酸鈉等)、核酸的前體物(嘌呤和嘧啶類化合物)及氧化還原劑，抗壞血酸、谷胱甘肽等。 如進(jìn)行無血清培養(yǎng)，除上述營養(yǎng)成分外，還應(yīng)加入纖維連結(jié)素、多聚賴氨酸和膠原等成分以促進(jìn)細(xì)胞貼壁。有時(shí)，還需要加入酶的抑制劑，如大豆胰酶抑制劑。 為了防止由于操作不慎所致的污染，可加入抗生素。常用抗生素有青霉素、鏈霉素及慶大霉素等。 4. 消化液 進(jìn)行傳代細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，為了使細(xì)胞脫離生長表面和細(xì)胞離散成單個(gè)細(xì)胞，通常使用消化液。常用的消化液有胰蛋白溶液(0.25或0.125)和乙二胺四乙酸二鈉(Na2-EDTA)溶液(0.02)。 5. 其它 pH調(diào)整液，為了營養(yǎng)成分穩(wěn)定和延長貯存時(shí)間，配制生理鹽溶液，和培養(yǎng)液時(shí)，均在臨用前加入NaHCO3溶液。常用濃度有3.7、5.6和7.4%。此外，還有HEPES溶液，是一種氫離子緩沖劑，能較長時(shí)間保持恒定的pH值范圍。使用終濃度為1015mmolL。 染色液：常用的有蘇木精-伊紅染色液或稱H.E染色；Giemsa染色液。 固定液：常用的有中性緩沖福爾馬林，相當(dāng)于10的福爾馬林；Bouin氏固定液；醋酸甲醇，臨用前配制，結(jié)合Giemsa染色效果較好；FAA固定液，由福爾馬林、冰醋酸及80酒精組成，用于蓋片單層培養(yǎng)的固定。 (三) 消毒技術(shù) 在細(xì)胞培養(yǎng)中，消毒是最基本的一項(xiàng)工作，它直接影響實(shí)驗(yàn)的結(jié)果。消毒措施應(yīng)在細(xì)胞培養(yǎng)的每個(gè)環(huán)節(jié)嚴(yán)格執(zhí)行。細(xì)胞培養(yǎng)的微生物污染，包括細(xì)菌、真菌及病毒，它們主要來源于：操作者的粗心；操作表面或周圍的環(huán)境；培養(yǎng)液及培養(yǎng)器皿的滅菌不徹底或存放時(shí)間過久等。 對(duì)不同的細(xì)胞培養(yǎng)所用物品，可采用不同的消毒滅菌的方法。一般有兩類：一是物理滅菌法，即利用紫外線、干熱及微孔過濾等；二是化學(xué)滅菌法，即利用化學(xué)消毒劑。主要消毒方面法介紹如下： 1. 紫外線 適于消毒空氣、操作表面及一些不宜用其它方法消毒的物品和培養(yǎng)板等，使用方便，效果較好。應(yīng)注意其可產(chǎn)生臭氧，影響健康。 2. 高壓蒸氣消毒 它適于金屬器械、膠塞、布類及某些培養(yǎng)液。一般要求15磅壓力下20min?；蛘吒唵蔚?，煮沸消毒，其不足是濕度大，不易久存。 3. 干熱消毒 適于玻璃器皿，消毒后器皿保持干燥并便于使用貯存。加溫應(yīng)到160，保持90-120min。 4. 濾過消毒 適于大多數(shù)培養(yǎng)用液。選擇孔徑為0.22m的微孔濾膜，過濾除菌效果較佳。 5. 消毒劑 適于操作者的皮膚、操作表面和臺(tái)面、桌椅及墻壁等，常用的消毒劑有來蘇兒、新潔爾滅、過氧乙酸及70酒精。 三、培養(yǎng)細(xì)胞的鑒定 對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的鑒定有兩個(gè)目的：一是觀察培養(yǎng)有無變化，以決定是否終止培養(yǎng)，并從冷凍貯存的樣品重新建立新的培養(yǎng)細(xì)胞；二是培養(yǎng)條件(如培養(yǎng)液)變化，對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的影響。因?yàn)榕囵B(yǎng)條件的一致性，對(duì)于實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信性有極為重要的影響。對(duì)于培養(yǎng)細(xì)胞的鑒定包括污染鑒定、生存指標(biāo)及細(xì)胞性質(zhì)(如細(xì)胞形態(tài)、生長特性、染色體數(shù)目及結(jié)構(gòu)等)。 (一) 污染鑒定 細(xì)胞培養(yǎng)中常見的污染有真菌、細(xì)菌和支原體等，此外有化學(xué)物和非同一種細(xì)胞的污染。受到污染的細(xì)胞培養(yǎng)可明顯地改變生長特性，引起pH變化和生長遲緩。污染常常表現(xiàn)為pH變化，培養(yǎng)液表面起泡或起膜，培養(yǎng)液中的絮狀物及細(xì)胞生長表面的斑點(diǎn)，搖動(dòng)培養(yǎng)器皿可消失。肉眼見不到的污染可影響細(xì)胞的代謝。 1. 鑒定方法 真菌或細(xì)菌的污染可用肉眼或低倍光學(xué)顯微鏡觀察，支原體僅能用特別的熒光染料如Hoechst 33258染色后在光學(xué)顯微鏡下，或用掃描電子顯微鏡觀察。由于用肉眼無法發(fā)現(xiàn)支原體的污染，在細(xì)胞培養(yǎng)過程中應(yīng)經(jīng)常定期檢查，例如每三個(gè)月。最簡便和最可靠的檢測支原體的方法是用熒光染料染色在顯微鏡下觀察。 2. 處理 基本的良好消毒技術(shù)并不一定能防止污染，還應(yīng)注意下列方面：消毒步驟(如高壓鍋和干熱消毒柜)的效果；多層流防護(hù)罩的消毒效果；經(jīng)常檢查培養(yǎng)器皿；每個(gè)工作者有自己配制的培養(yǎng)用液，處理受污染的培養(yǎng)用具和環(huán)境。對(duì)于已污染或懷疑污染的培養(yǎng)用具均可用2.5高氯酸處理。用抗生素對(duì)預(yù)防或去除細(xì)菌污染較為有效。對(duì)支原體污染，消除方法較多，如抗生素、加溫及動(dòng)物體內(nèi)接種等，但都較為繁瑣，且效果不甚滿意，最好的辦法是棄去，再重新培養(yǎng)。 (二) 生存指標(biāo) 1. 臺(tái)盼藍(lán)排斥試驗(yàn) 是判定細(xì)胞損傷的快速試驗(yàn)，它還可很方便進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。具體方法如下： 取少量細(xì)胞混懸液，加人等量的0.5臺(tái)盼藍(lán)溶液。 放置1-5min后，將混合液滴入血細(xì)胞計(jì)數(shù)池內(nèi)。 顯微鏡下，細(xì)胞顯藍(lán)色的為死亡細(xì)胞，尤其是核深染，而未染的細(xì)胞為存活細(xì)胞。統(tǒng)計(jì)出細(xì)胞總數(shù)后，可計(jì)算出細(xì)胞存活率。 2. 酶漏出的檢測 胞漿酶如乳酸脫氫酶(LDH)的漏出檢測也與染料排斥試驗(yàn)有同樣的靈敏度，同時(shí)，可更精確地進(jìn)行定量，但操作時(shí)間較長。 (1) 儀器：分光光度計(jì)，最好配有溫育(37)的裝置。 (2) 試劑： 溶液 0.9NaCl，0.1TritorX-100和0.1牛血清白蛋白。 底物 3.5g K2HPO4，0.45gkH2PO4和31.0mg丙酮酸鈉溶于450ml的蒸餾水。配好后，可貯存于-20的冰箱內(nèi)。 NADH，稱42mg，溶于4.5ml的1NaHCO3，臨用前配制。 (3) 操作步驟：離心，以適當(dāng)速度使所有細(xì)胞沉淀而不引起細(xì)胞損傷。例如肝細(xì)胞用50g2min。取出上清，放人干凈試管，并保持0以下備用，加入等量的溶液至細(xì)胞沉淀，用漩渦混合器混合。保持在0以下，備用。 取一比色杯，加3ml底物，50l的NADH和25200l的樣品(取決于培養(yǎng)細(xì)胞的種類)，迅速混合后，在340nm處進(jìn)行比色。整個(gè)過程應(yīng)在37條件下完成。計(jì)算上清或沉淀(即溶液中細(xì)胞)的LDH活性，漏出率表示方法為培養(yǎng)液中LDH活性占總的LDH活性的百分率。 3. 其它方法 鉻的釋放，利用51Cr3+可被活細(xì)胞吸收，并還原成51Cr3+，留在胞內(nèi)，而死亡細(xì)胞則釋放51Cr3+。用r-計(jì)數(shù)器檢測無細(xì)胞上清液中51Cr3+的量，即可判斷培養(yǎng)細(xì)胞的存活情況。還有貼壁效率和ATP含量等指標(biāo)可鑒定培養(yǎng)細(xì)胞的存活情況。 (三) 細(xì)胞特性鑒定 在連續(xù)培養(yǎng)期間，細(xì)胞可能發(fā)生某些變化，如細(xì)胞與原始細(xì)胞的差異逐漸加大。但每一細(xì)胞株具有一系列細(xì)胞特性“正?！钡膮?shù)，可供鑒定評(píng)價(jià)。例如，形態(tài)學(xué)參數(shù)、生長特性及染色體分析等皆為細(xì)胞特性鑒定的指標(biāo)，其中形態(tài)學(xué)與生長特性的測定相對(duì)容易進(jìn)行。 1. 形態(tài)學(xué)檢查 評(píng)價(jià)細(xì)胞正常與否的最簡單方法是形態(tài)學(xué)檢查；應(yīng)在每次傳代時(shí)用倒置顯微鏡進(jìn)行觀察，最好拍照記錄細(xì)胞的形態(tài)。要詳細(xì)地描述每一細(xì)胞系的形態(tài)。若因限于篇幅，不能詳述，可掌握兩個(gè)述語，即“成纖維樣”和“上皮樣”細(xì)胞，即可描述所觀察的細(xì)胞。成纖維樣細(xì)胞系指在單層細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，細(xì)胞的長度要大于其寬度的兩倍的細(xì)胞，而上皮樣細(xì)胞系指呈多角形的細(xì)胞。 2. 生長特性的檢查 在培養(yǎng)細(xì)胞時(shí)，其生長特性的檢查較易進(jìn)行，主要通過測定更換培養(yǎng)液的時(shí)間和傳代的時(shí)間來完成。雖然不同的細(xì)胞其傳代時(shí)間和更換培養(yǎng)液的時(shí)間不同，但對(duì)于每一細(xì)胞系應(yīng)該較為固定，因?yàn)橹饕Q于細(xì)胞生長速率。 每個(gè)細(xì)胞系均有其自己的生長循環(huán)周期，這取決于接種進(jìn)行培養(yǎng)的細(xì)胞數(shù)目。一般認(rèn)為，在培養(yǎng)中的細(xì)胞，是處于不同的生長階段。進(jìn)行生長分析，應(yīng)觀察單個(gè)細(xì)胞的生長速率。在實(shí)際工作中，是測定克隆效率或者接種效率。克隆效率是測定由單個(gè)細(xì)胞生長的克隆。接種效率是測定植入小量細(xì)胞(250個(gè)cm2)后，等生長至可分辨的小克隆時(shí)，經(jīng)用生理鹽水洗滌，甲醇固定，吉姆沙染色(2ml25cm2)和清水沖洗后，計(jì)算克隆數(shù)。接種效率= 一般認(rèn)為，傳代效率小于30表示生長不正常。此項(xiàng)指標(biāo)可用于正常細(xì)胞生長的監(jiān)測，貯存細(xì)胞的復(fù)蘇及鑒定每一批血清等。 在細(xì)胞培養(yǎng)試驗(yàn)中，一般監(jiān)測指標(biāo)可采用形態(tài)學(xué)、生長模式及接種效率即可。 3. 其它檢查 除上述指標(biāo)外，在細(xì)胞培養(yǎng)時(shí)，可進(jìn)行染色體分析，包括染色體的數(shù)目和結(jié)構(gòu)以及DNA、RNA和蛋白質(zhì)的含量測定，來判斷培養(yǎng)細(xì)胞的特性。 七、細(xì)胞培養(yǎng)在食品毒理學(xué)中應(yīng)用 利用培養(yǎng)的細(xì)胞，可進(jìn)行多方面的毒理學(xué)研究，如表12-4中所列。表12-4 培養(yǎng)細(xì)胞用于毒理學(xué)體外實(shí)驗(yàn)的實(shí)例 一般毒性：主要為急性細(xì)胞毒性 器官特異性毒性：利用有代表性細(xì)胞類型如肝細(xì)胞、腎近曲小管細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞及心肌細(xì)胞等： 毒作用機(jī)理 生物轉(zhuǎn)化、毒性代謝產(chǎn)物的形成 遺傳毒性，如程序外DNA合成測定 繁殖毒性 聯(lián)合毒性 不同物種間的比較毒性 光敏毒性 以下重點(diǎn)討論毒理學(xué)中應(yīng)用細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)時(shí)應(yīng)注意的幾個(gè)問題。 1. 細(xì)胞類型的選擇 細(xì)胞類型的選擇取決于實(shí)驗(yàn)的目的。一般性篩選系列化合物的一般毒性時(shí)，應(yīng)選擇生長迅速且易于處理的細(xì)胞系。機(jī)理研究多不用細(xì)胞系，因?yàn)榕囵B(yǎng)的細(xì)胞會(huì)逐漸喪失許多功能，如細(xì)胞色素P-450的活性。 細(xì)胞培養(yǎng)的優(yōu)點(diǎn)之一是可選擇來源于人體的組織細(xì)胞，可減少試驗(yàn)結(jié)果的物種差異。成纖維樣細(xì)胞和上皮樣細(xì)胞均可選用。常用的細(xì)胞系有CHO、V79、Hela、BHR及L929等。 2. 代謝活化 細(xì)胞經(jīng)8-24h培養(yǎng)后，細(xì)胞色素P-450活性將迅速下降。而在CHO細(xì)胞系中，涉及代謝活化的酶活性下降。所以，培養(yǎng)細(xì)胞對(duì)需代謝活化的化學(xué)物不能夠敏感。 解決這個(gè)問題有兩個(gè)方法，一是加S9，二是與原代肝細(xì)胞復(fù)合培養(yǎng)。S9需要NADPH才具有代謝活化作用，故在培養(yǎng)液中應(yīng)加有NADPH生成系統(tǒng)(葡萄糖-6-磷酸脫氫酶、葡萄糖-6-磷酸和NADP)。與原代肝細(xì)胞進(jìn)行復(fù)合培養(yǎng)時(shí)也可采用其它不同的細(xì)胞系，如V79、中國地鼠肺成纖維細(xì)胞和人成纖維細(xì)胞。 3. 受試物的給予許多 受試物由于水溶性較低，在加入培養(yǎng)液前，常需溶于有機(jī)溶劑有機(jī)溶劑對(duì)細(xì)胞有損害作用，故應(yīng)限制有機(jī)溶劑濃度在1以下。在試驗(yàn)中可設(shè)立適當(dāng)?shù)挠袡C(jī)溶劑對(duì)照和培養(yǎng)液對(duì)照。例如，需用S9混合液；有機(jī)溶劑的濃度應(yīng)限制在0.1，因?yàn)樵S多有機(jī)溶劑可抑制酶的活性。不溶性的受試物如，顆粒和油劑在給予培養(yǎng)液時(shí)仍存在問題。一般是混懸于培養(yǎng)液或者先溶于溶劑，再加人培養(yǎng)液，但有時(shí)會(huì)產(chǎn)生不同的毒性結(jié)果。例如，黃樟醚和降脂乙醚等油性受試物，假如使用高劑量時(shí)將有某些塑料培養(yǎng)皿成分的溶出，則所觀察到的毒性作用可能部分地是由于某些塑料成分所致。 4. 設(shè)立陽性對(duì)照組 實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)的重現(xiàn)性應(yīng)該用陽性對(duì)照物來檢查。陽性對(duì)照物指采用經(jīng)過研究或公認(rèn)有特定作用的化學(xué)物。例如在代謝活化研究中常選擇環(huán)磷酰胺為陽性對(duì)照物，在細(xì)胞毒性篩檢時(shí)可選二甲基環(huán)己基烴乙基戊二酰亞胺和二硝基苯酚為陽性對(duì)照物。 5. 毒性指標(biāo)的選擇 依據(jù)不同的試驗(yàn)?zāi)康暮驮囼?yàn)條件，可選擇不同的觀察指標(biāo)。下列指標(biāo)在毒理學(xué)中經(jīng)常采用： (1) IC50：即經(jīng)3天培養(yǎng)后，引起生長速率減至對(duì)照組一半時(shí)所需受試物的濃度生長速率可用蛋白總濃度來表示，可用于細(xì)胞毒性的常規(guī)篩檢。此外，前述評(píng)價(jià)細(xì)胞特性的指標(biāo)，如形態(tài)學(xué)和接種效率等，均可采用。 (2) 細(xì)胞膜損傷：可選擇臺(tái)盼藍(lán)攝取、胞漿酶漏出、Ca2+的釋放以及鈣泵的變化等指標(biāo)來評(píng)價(jià)細(xì)胞膜的損傷。 (3) 大分子物質(zhì)合成與降解的改變：可選用14C亮氨酸蛋白試驗(yàn)和3H尿嘧啶參入RNA試驗(yàn)等指標(biāo)，以判斷受試物對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的大分子合成與降解的有無作用。 (4) 代謝能力：除可選擇ATP濃度、NADPNADPH比、谷胱甘肽含量、氧消耗量等指標(biāo)外，還有毒物代謝酶的活性、細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化作用及14C-葡萄糖氧化代謝成14CO2的速率，均可反映出細(xì)胞的代謝能力。 (5) 形態(tài)學(xué)觀察：通過光學(xué)顯微鏡和電子顯微鏡觀察，可了解受試物對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)改變情況。 第三節(jié) 亞細(xì)胞組分制備及其檢測方法 細(xì)胞由許多亞細(xì)胞組分組成，如核、線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜、溶酶體及高爾基氏體等，它們?cè)诰S持細(xì)胞正常生理功能方面起著重要的作用。故許多外源化學(xué)物引起機(jī)體的損害作用，有可能與亞細(xì)胞組分的結(jié)構(gòu)與功能損傷有關(guān)。在毒理學(xué)中，亞細(xì)胞組分作為遺傳毒性測定中的代謝活化系統(tǒng)，如S9已普遍運(yùn)用。此外，亞細(xì)胞組分主要用于中毒機(jī)理的分子水平研究，因它們是從整體細(xì)胞上在自然環(huán)境下分離出來的，使毒理學(xué)家在體外條件下，有可能更深入了解外源化學(xué)物在毒作用部位的作用機(jī)理。但它離開子整體細(xì)胞，也有其局限性；即它僅提供有關(guān)一些特殊作用能力的特定信息。對(duì)外源化學(xué)物毒作用機(jī)理研究，還應(yīng)結(jié)合其它研究如整體試驗(yàn)、細(xì)胞試驗(yàn)等，綜合作出評(píng)價(jià)。現(xiàn)就微粒體和線粒體的制備及其檢測方法加以介紹。 一、基本技術(shù) (一) 設(shè)備 1. 勻漿器(homogenizer) 常用勻漿器為Potter型，由一聚四氟乙烯杵和玻璃套管組成。它是利用兩者的間隙將細(xì)胞破碎，其間隙一般在0.150.25nm。杵是由馬達(dá)傳動(dòng)，其速度在2000rpm以內(nèi)，且可調(diào)節(jié)。它較適合肝細(xì)胞、腎細(xì)胞及腦細(xì)胞的破碎，而對(duì)肺、甲狀腺等結(jié)締組織較多的組織效果不佳。勻漿器可從5ml至50ml大小不等，依實(shí)驗(yàn)需要加以選擇。使用本法破碎細(xì)胞應(yīng)注意：在低溫下操作避免勻漿磨擦生熱和室溫影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果；馬達(dá)速度不宜過快，慢速可獲更大的扭力矩；勻漿上下次數(shù)，即杵由玻璃套管上部下到底部，再回到上部，一般肝細(xì)胞勻漿上下810次即可達(dá)到破碎目的。 2. 離心機(jī) 是亞細(xì)胞組分制備的關(guān)鍵設(shè)備，一般需要低溫高速離心機(jī)，最大轉(zhuǎn)速為18 00024000rpm，和超速離心機(jī)，最大轉(zhuǎn)速為5000075000rpm。離心機(jī)應(yīng)配備各種類型的轉(zhuǎn)頭，以供亞細(xì)胞組分制備時(shí)差速離心選用。離心管最好為聚丙烯的，因其透明性較好。 (二) 勻漿介質(zhì)和緩沖液 最常用的勻漿介質(zhì)為等滲的蔗糖(0.25molL)和氯化鉀(0.154molL)。蔗糖為經(jīng)典亞細(xì)胞組分分離研究所選用，而氯化鉀更適合外源化學(xué)物代謝酶的研究，如它可更有效除去微粒體制備物中的血紅蛋白，減少光譜測定的干擾。勻漿介質(zhì)在使用前應(yīng)將pH調(diào)至7.4左右。勻漿緩沖液可含有550mmolL的Tris或Hepes。 大多數(shù)研究中常用的勻漿緩沖液為含0.154molL KCl的50mmolL TrisHCI緩沖液，pH7.4。此緩沖液在4條件下，至少貯存12周不變質(zhì)。 (三) 生物樣品 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物如大鼠、小鼠、金黃地鼠應(yīng)迅速處死，常用的方法是斷頭處死。應(yīng)避免使用麻醉劑，如乙醚、巴比妥類藥物，它們將影響毒物代謝酶的活力。對(duì)于大實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，如狗等，應(yīng)在適當(dāng)?shù)穆樽項(xiàng)l件下，放血處死。盡快取出所需臟器，如肝、腎、肺及腦等，置人冰的勻漿介質(zhì)中。為了減少實(shí)驗(yàn)誤差，應(yīng)參考動(dòng)物的年齡、性別、品系、健康狀況、飲食類型和飼養(yǎng)環(huán)境等因素。此外，為避免晝夜節(jié)律影響，每次實(shí)驗(yàn)應(yīng)在相同時(shí)間處死動(dòng)物。為避免肝糖原影響，大鼠應(yīng)禁食過夜。 (四) 微粒體酶的誘導(dǎo)方法 1. 苯巴比妥鈉 它是常用的誘導(dǎo)劑之一。其方法是以小鼠80mg(kgd)，大鼠100mg(kgd)，經(jīng)腹腔注射或與生理鹽水混合灌胃，連續(xù)35天即可誘導(dǎo)細(xì)胞色素P-450的活力。還可以將藥溶于飲水，1ngml，大約7天后，可達(dá)到誘導(dǎo)效果。主要誘導(dǎo)細(xì)胞色素P-450。 2. p-萘黃酮(-naphthoflavone) 它是多環(huán)芳烴類的誘導(dǎo)物，可誘導(dǎo)細(xì)胞色素P448，同類誘導(dǎo)物還有3-甲基膽葸(3-methylcholanthrene)。-萘黃酮的使用方法是小鼠40mg(kgd)，大鼠80mg(kgd)，經(jīng)腹腔注射，連續(xù)34天，即可達(dá)到誘導(dǎo)作用。主要誘導(dǎo)細(xì)胞色素P448。 3. 多氯聯(lián)苯 常用多氯聯(lián)苯誘導(dǎo)物是Arochlorl254，它是混合型的誘導(dǎo)物，即同時(shí)誘導(dǎo)細(xì)胞色素P-450和細(xì)胞色素P-448，劑量依多氯聯(lián)苯種類不同而異，需做預(yù)試驗(yàn)來確定。 二、微粒體的制備 微粒體(microsome)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在細(xì)胞勻漿過程中形成的碎片，并非獨(dú)立的細(xì)胞器。由于微粒體含有混合功能氧化酶，其在毒理學(xué)研究中有著重要地位，故微粒體是毒理學(xué)中較常用的體外系統(tǒng)。 (一) 肝微粒體制備 1. 以斷頭方法處死動(dòng)物，迅速取出肝臟，用預(yù)冷生理鹽水或勻漿介質(zhì)洗凈血污，剪去粘連的組織，用濾紙輕輕吸干表面水分，稱重。 2. 將肝轉(zhuǎn)入小燒杯，用剪刀剪碎肝臟，加入適當(dāng)勻漿介質(zhì)，一般為3mlg肝臟。放人Potter勻漿器中，上、下8次，制成肝勻漿。 3. 按示意圖操作離心。 肝勻槳離心，10000g 20 min 上清液 沉淀離心，10500g 1h沉淀 （微粒體） 上清液棄去在第一次離心去除線粒體、核等物質(zhì)時(shí)，離心管上層漂浮有脂質(zhì)層，應(yīng)用吸管將其除去，再收集上清液。在第二次超速離心后，如為了減少血紅蛋白的影響，可加勻漿介質(zhì)將沉淀重新懸浮，將所制備的微粒體再洗滌一次。沉淀即微粒體，懸浮于10mmolL HepesHCl緩沖液，pH7.6，內(nèi)含0.154molL KCl，l mmolLEDTA和20甘油，貯存于-2070或是液氮中。應(yīng)強(qiáng)調(diào)的是貯存方式和時(shí)間對(duì)微粒體酶的活性或特征會(huì)有不同程度的影響。 4. 其它方法 除超速離心法制備微粒體外，還有凝膠過濾、鈣沉淀法和等電點(diǎn)沉淀法也可以制得微粒體。凝膠過濾法不適于做多個(gè)樣品。鈣沉淀法適于沒有超速離心機(jī)的實(shí)驗(yàn)室使用。其方法是在去線粒體的上清液