血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性的測(cè)定.ppt

賴(lài)氏法測(cè)定血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性 ALT 目的要求 1 掌握血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性測(cè)定的基本原理 2 熟悉血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性測(cè)定的具體操作方法 3 了解血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性測(cè)定的臨床意義 實(shí)驗(yàn)原理 ALT催化丙氨酸與 酮戊二酸之間的氨基轉(zhuǎn)移 生成丙酮酸和谷氨酸 在37 pH7 4 經(jīng)30min反應(yīng)之后 加入2 4 二硝基苯肼終止反應(yīng) 并與反應(yīng)中的二種 酮酸生成2 4 二硝基苯腙 在堿性條件下顯紅棕色 于波長(zhǎng)505nm處讀取A值 兩種苯腙的吸收光譜曲線(xiàn)在500 520nm處差異最大 丙酮酸苯腙的呈色強(qiáng)度是 酮戊二酸苯腙的3倍 據(jù)此可以計(jì)算出丙酮酸的生成量 后者與血清中的ALT的活性濃度成正比 實(shí)驗(yàn)原理 丙氨酸 酮戊二酸 丙酮酸 谷氨酸 ALT 2 4 二硝基苯肼 酮戊二酸 2 4 二硝基苯腙 丙酮酸 2 4 二硝基苯腙 0 4mol LNaOH 紅棕色 紅棕色 三倍 卡門(mén)單位 1ml血清在25 340nm 體積為3ml 光徑為1cm每分鐘光密度下降0 001的酶量 1 主要器具 微量移液器 實(shí)驗(yàn)儀器 可見(jiàn)分光光度計(jì) 實(shí)驗(yàn)試劑 1 0 1mol L磷酸鹽緩沖液 pH7 4 2 基質(zhì)緩沖液精確稱(chēng)取D L 丙氨酸1 79g 酮戊二酸29 2mg 先溶于0 1mol L磷酸鹽緩沖液約50ml中 用1mol LNaOH調(diào)pH至7 4 再加磷酸鹽緩沖液至100ml 每升底物緩沖液中可加氯仿防腐 4 保存 3 1 0mmol L2 4 二硝基苯肼溶液4 0 4mol LNaOH溶液5 2 0mmol L丙酮酸標(biāo)準(zhǔn)液6 待測(cè)標(biāo)本 病人血清或質(zhì)控血清 操作步驟 1 待測(cè)血清的測(cè)定 混勻 室溫放置5min 在波長(zhǎng)為505nm處比色 蒸餾水調(diào) 0 操作步驟 2 校正曲線(xiàn)的制備 混勻 室溫放置5min 在波長(zhǎng)為505nm處比色 蒸餾水調(diào) 0 取7支試管 按下表操作 混勻 室溫放置5min 在波長(zhǎng)為505nm處比色 蒸餾水調(diào) 0 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 1 校正曲線(xiàn)的制備以標(biāo)準(zhǔn)管各管的A值 0 號(hào)管的A值 所得差值與對(duì)應(yīng)酶卡門(mén)氏單位作圖 即成校正曲線(xiàn) 2 測(cè)定管測(cè)定管A值 對(duì)照管A值 根據(jù)所得差值 從校正曲線(xiàn)查得標(biāo)本中ALT的卡門(mén)氏單位 參考值范圍 5 25卡門(mén)單位 注意事項(xiàng) 1 血清和底物應(yīng)于37 水浴后操作 最好置37 水浴箱中操作 以一定時(shí)間加入 各管即時(shí)混勻 以第一管開(kāi)始計(jì)時(shí) 準(zhǔn)確反應(yīng)30分鐘 各管加入時(shí)間間隔一致 保證每管反應(yīng)時(shí)間均為30分鐘 2 加入2 4 二硝基苯肼溶液后 應(yīng)充分混勻 使反應(yīng)完全 3 加入NaOH溶液的方法和速度要一致 如液體混合不完全或加入速度不同均會(huì)導(dǎo)致吸光度的差異 4 底物和顯色劑均為呈色物質(zhì) 稱(chēng)量必須很準(zhǔn)確 5 呈色的深淺與NaOH的濃度也有關(guān)系 其濃度越大呈色越深 但其濃度 0 25M時(shí) 吸光度下降變陡 因此濃度要準(zhǔn)確 方法學(xué)評(píng)價(jià) 1 重復(fù)性差1 由于限制了 酮戊二酸的用量 使生成量與酶活性不能呈現(xiàn)良好的線(xiàn)性關(guān)系 2 2 4 二硝基苯肼在堿性條件下也能顯色 為了降低試劑空白的吸光度而不得不使用低濃度的2 4 二硝基苯肼 此種水平的苯肼僅能與反應(yīng)體系中的兩種酮酸的一半反應(yīng) 3 產(chǎn)物旁路效應(yīng) 丙酮酸在LDH的催化作用下的消耗 方法學(xué)評(píng)價(jià) 2 準(zhǔn)確性差 線(xiàn)性范圍狹窄 盡管標(biāo)本采用稀釋后測(cè)定 但偏差仍較大 3 試劑穩(wěn)定性差4 操作簡(jiǎn)單 臨床意義 肝細(xì)胞中含ALT最豐富 因此當(dāng)肝臟疾病致肝細(xì)胞受損傷時(shí) ALT即大量釋放入血液 致使血清中ALT活性增高 測(cè)定ALT是檢查肝功能的重要指標(biāo)之一 1 ALT顯著增高見(jiàn)于各種急性肝炎及藥物中毒