光學(xué)顯微鏡的原理與構(gòu)造.doc

光學(xué)顯微鏡的原理與構(gòu)造隨著科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，顯微鏡檢方法由最傳統(tǒng)的明視野、暗視野發(fā)展出了相差法、偏光方法；熒光方法也由透射光激發(fā)進(jìn)展為落射光激發(fā)，使熒光效率大為提高；微分干涉相襯方法基于偏光方法，而巧妙地利用了微分干涉棱鏡，使之能應(yīng)用于醫(yī)學(xué)與生物學(xué)的樣品，又能應(yīng)用于金相樣品的分析與檢驗(yàn)。下面簡(jiǎn)單介紹萬(wàn)能顯微鏡的基本組成部件：1. 顯微鏡主機(jī)體（stand）顯微鏡的主機(jī)體設(shè)計(jì)成金字塔形，而底座的截面呈T字形，使顯微鏡的整體相當(dāng)穩(wěn)固。顯微鏡的光學(xué)部件和機(jī)構(gòu)調(diào)節(jié)部件、光源的燈室、顯微照相裝置、電源變壓穩(wěn)壓器等，都可安裝在主機(jī)體上或主機(jī)體內(nèi)。2. 顯微鏡的底座（base）底座和主機(jī)體通常組成一個(gè)穩(wěn)固的整體。底座內(nèi)通常裝有透射光照明光路系統(tǒng)（聚光、集光和反光）部件，光源的濾光片組，粗/微調(diào)焦機(jī)構(gòu)，光源的視場(chǎng)光闌也安裝在底座上。3. 透射光光源（tranilluminator）透射光光源由燈室（lamp housing）、燈座（lamp socket）鹵素?zé)簦╤alogen lamp）、集光與聚光系統(tǒng)（lamp collector and lamp condenser）及其調(diào)整裝置組成。4. 透射光光源與反射光光源的轉(zhuǎn)換開(kāi)關(guān)（toggle switch）這是新一代AXIO系列顯微鏡特有的裝置，透射光和反射光可通用。當(dāng)具有透/反兩用的配置時(shí)，利用這一轉(zhuǎn)換開(kāi)關(guān)能方便而又迅速的使透射光和反射光互相轉(zhuǎn)換。在純透射光的配置中，這一開(kāi)關(guān)就改為電源開(kāi)關(guān)。5. 電源開(kāi)關(guān)（mains switch）與亮度調(diào)節(jié)旋鈕（brightness control）電源開(kāi)關(guān)用來(lái)接通或切斷顯微鏡所需用的交流電源。電源開(kāi)關(guān)旋鈕也可調(diào)節(jié)照明光源的亮度，使所觀察的視域可隨時(shí)獲得適當(dāng)?shù)牧炼?，可調(diào)范圍為3-12V。作顯微照相時(shí)，可根據(jù)曝光以及彩色底片色溫的要求來(lái)調(diào)節(jié)燈光的亮度。當(dāng)準(zhǔn)備關(guān)掉電源之前，應(yīng)先將亮度調(diào)節(jié)旋鈕調(diào)到最小。6. 粗、微調(diào)焦旋鈕（coaxial coarse/fine focusing controls）調(diào)焦旋鈕轉(zhuǎn)動(dòng)時(shí)帶動(dòng)燕尾導(dǎo)板上下移動(dòng)，而導(dǎo)板上則裝有物臺(tái)托架和聚光鏡托架，從而使物臺(tái)趨向或遠(yuǎn)離物鏡達(dá)到調(diào)焦的效果。7. 透射光用的濾光片選擇按鈕（push buttons for filter magazine）透射光顯微鏡檢方法所需用的一組濾光片已安裝在顯微鏡的底座內(nèi)，通過(guò)底座外的按鈕就可以根據(jù)不同的需要來(lái)選擇適用的一塊或一組濾光片。通常的濾光片配套有： (1) 藍(lán)色色溫轉(zhuǎn)換濾光片：用來(lái)把光源的色溫由3200K轉(zhuǎn)換成日光型彩色底片所需的5500K色溫； (2) 綠色濾光片：用來(lái)增強(qiáng)相差觀察方法中成像的反差，或者以黑白底片作顯微照相時(shí)，可以提高片成像的反差； (3) 淺灰色濾光片：是透光率為50%的中性減光濾光片，可把視野的亮度減弱一半； (4) 灰色濾光片：是透光率為25%的中性減光濾光片，可把視野的高度減弱75%； (5) 透光率僅為6%的中性減光濾光片，可把視野的亮度變得相當(dāng)暗，95%以上的光都已被吸收掉。8. 光源的視場(chǎng)光闌（luminuos field diaphragm）視場(chǎng)光闌是顯微鏡照明光路系統(tǒng)中的重要部件之一，它只能按照庫(kù)勒照明系統(tǒng)的要求來(lái)進(jìn)行調(diào)節(jié)，視場(chǎng)光闌不可以任意開(kāi)大，但要根據(jù)使用的物鏡倍數(shù)來(lái)調(diào)節(jié)適當(dāng)?shù)拇笮?。視?chǎng)光闌的主要功用有： (1) 控制雜散光在成像光路系統(tǒng)中的影響，特別是免除雜散光對(duì)照相系統(tǒng)的干擾，使顯微照相的底片不至于蒙上一層灰霧；(2) 控制照明光束的大小，使所觀察的視域能受到均勻的照明； (3) 在熒光顯微鏡檢方法中，可以把激發(fā)光限制在所需激發(fā)樣品的視域范圍內(nèi)，以防止視域外的樣品過(guò)早受到激發(fā)。9. 聚光鏡系統(tǒng)（condenser system）聚光鏡系統(tǒng)是照明光路系統(tǒng)中的重要部件之一，它也只能按照庫(kù)勒照明系統(tǒng)的調(diào)整要求來(lái)進(jìn)行調(diào)節(jié)。聚光鏡系統(tǒng)調(diào)整的好壞，可以直接影響顯微鏡視域中照明的均勻性，也可影響顯微鏡的分辨力，還可以直接控制顯微照相底片上的反差。聚光鏡系統(tǒng)通常由以下幾個(gè)部件組成：(1) 聚光鏡本體（condenser）可以是簡(jiǎn)單的阿貝聚光鏡，也可以是消球差-消色差的優(yōu)質(zhì)聚光鏡，另外還有一種是消除了內(nèi)應(yīng)力的偏光聚光鏡。聚光鏡的重要參數(shù)之一是數(shù)值孔徑（NA），通常為0.32；這樣的數(shù)值孔徑太小，只能與以下的物鏡配合使用，因此需配用前端透鏡來(lái)提高數(shù)值孔徑，以便與不同倍數(shù)的物鏡靈活配合使用； (2) 前端透鏡（front lens）前端透鏡本身的數(shù)值孔徑通常為0.63、0.90、1.30或1.40，它要附裝在聚光鏡本體上，可以方便地?cái)[進(jìn)或擺出光路。最常用的前端透鏡數(shù)值孔徑為0.90，當(dāng)它擺入光路時(shí)，可以和10及以上的物鏡配用，擺出光路時(shí)可以和10以下的物鏡如6.3、5及2.5等物鏡配用； (3) 聚光鏡的孔徑光闌（aperture diaphragm）孔徑光闌實(shí)際上是一個(gè)可變光圈，它是顯微鏡照明光路系統(tǒng)中的又一個(gè)重要部件，在透射光明視野法、微分干涉相襯法以及偏光法所使用的聚光鏡中，都裝有孔徑光闌。它可以影響顯微鏡在作觀察時(shí)的分辨力；直接控制顯微照相底片上的反差；可用來(lái)調(diào)節(jié)聚光鏡的數(shù)值孔徑，配合所用物鏡的數(shù)值孔徑，以取得最佳的分辨本領(lǐng)，或最大的分辨本領(lǐng)；還可以使光源的發(fā)光體成像于孔徑光闌所在的平面上，從而滿足庫(kù)勒照明系統(tǒng)的前提條件。在實(shí)際操作中，調(diào)節(jié)聚光鏡孔徑光闌可以改變顯微鏡中所觀察到的視野亮度，這是由于歷史上對(duì)聚光鏡孔徑光闌的誤解所造成的錯(cuò)誤用法。這里要特別強(qiáng)調(diào)：不應(yīng)該用聚光鏡的孔徑光闌來(lái)調(diào)節(jié)視野中的亮度、更不應(yīng)該用調(diào)節(jié)聚光鏡位置高低的方法來(lái)調(diào)節(jié)視野中的亮度！以往的錯(cuò)誤用法希望能在實(shí)際操作中糾正過(guò)來(lái)。 (4) 轉(zhuǎn)盤(pán)（turret）在多用途聚光鏡系統(tǒng)中，為方便才把明視野的孔徑光闌、暗視野的中央光擋、相差法所需用的各種不同直徑的環(huán)狀光圈、微分干涉相襯法用的DIC棱鏡及其孔經(jīng)光闌等部件裝在轉(zhuǎn)盤(pán)上再嵌入到聚光鏡本體的座子內(nèi)，使用時(shí)轉(zhuǎn)動(dòng)轉(zhuǎn)盤(pán)就可以選用不同顯微鏡檢法所適用的聚光鏡，方便而又快捷。聚光鏡系統(tǒng)有兩個(gè)調(diào)節(jié)裝置：a. 聚光鏡的調(diào)中螺絲（centering screws）調(diào)中螺絲通常為1對(duì)，位于聚光鏡托架前方的左右測(cè)。和環(huán)形燕尾槽中的調(diào)中螺絲成三足鼎立之勢(shì)，可以聚光鏡前后、左右調(diào)整，使聚光鏡的光軸與照明光路、成像光路合軸；b. 聚光鏡托架的上下調(diào)節(jié)裝置（vertical adjustment of condenser carrier）： 利用這個(gè)調(diào)節(jié)裝置，可使聚光鏡的位置作上下調(diào)動(dòng)，使視場(chǎng)光闌經(jīng)過(guò)聚光鏡在樣品視野中的成像調(diào)到最為清晰，光闌像的位置也可利用托架上的調(diào)中螺絲來(lái)進(jìn)行調(diào)中，從而滿足庫(kù)勒照明系統(tǒng)調(diào)整的要求。10. 機(jī)械移動(dòng)式載物臺(tái)（specimen stage）載物臺(tái)可以承載樣品，裝有可在水平方向上作前后、左右移動(dòng)的調(diào)節(jié)裝置，有的還可以在水平方向上作大約100度的旋轉(zhuǎn)，以便使樣品能更好地與顯微照相的取景框相適配。11. 物鏡轉(zhuǎn)換器（nosepiece）物鏡轉(zhuǎn)換器安裝在滑插式燕尾槽座上，已作了準(zhǔn)確的對(duì)中?？裳杆俑鼡Q物鏡。常用的有6個(gè)、5個(gè)及4個(gè)孔位的物鏡轉(zhuǎn)換器。12. 物鏡（objectives）物鏡是顯微鏡的核心光學(xué)部件，顯微鏡的放大倍數(shù)、分辨本領(lǐng)、色差與像差的校正狀況、工作距離等，都有直接由物鏡來(lái)決定。衡量物鏡質(zhì)量的基本參數(shù)主要有：a. 色差消正的程度（或級(jí)別）；b. 像場(chǎng)平坦的程度；c. 所使用的玻璃材料。數(shù)值孔徑（NA）是物鏡最重要的參數(shù)，數(shù)值孔徑越大，分辨率越高。目前物鏡的數(shù)值孔徑最大只有1.30。按照物鏡色差和像差校正的程度，物鏡可以分為以下類別： (1) 消色差物鏡（achomats）通常對(duì)紅光與藍(lán)光兩種色光作了色差校正，但視域中像場(chǎng)的平坦程度并未作過(guò)完善的校正，因此只能作一般的觀察應(yīng)用。在偏光顯微鏡中，由于需要消除物鏡內(nèi)各個(gè)鏡片的內(nèi)應(yīng)力，反而需要利用這種鏡片數(shù)目不多的物鏡來(lái)做偏光物鏡。(2) 有限平像場(chǎng)消色差物鏡（flat-field achromats）這也是對(duì)兩種色光作了校正的消色差物鏡，但視域范圍內(nèi)像場(chǎng)的平坦程度只作了有限范圍內(nèi)的校正，通常在顯微照相取景框范圍內(nèi)像場(chǎng)是平坦的，以確保顯微照相對(duì)焦的清晰，取景框范圍以外，往往不一定能保證同樣的清晰度。適用于常規(guī)檢驗(yàn)而又需要作顯微照相的工作中。 (3) 完善平像場(chǎng)消色差物鏡（plan-achromats）這也是對(duì)兩種色光作了校正的高級(jí)消色差物鏡，主要特點(diǎn)是像場(chǎng)在整個(gè)視域中作了完善的校正，適合于作要求較高的顯微鏡檢工作，特別是作顯微照相效果更好。由于這種物鏡仍采用常用的光學(xué)玻璃，不適宜作熒光等這一類弱光的觀察和照相。 (4) 螢石玻璃消色差物鏡（neofluar）這也是對(duì)兩種色光作了色差校正的消色差物鏡，其中全部或部分鏡片則采用了可透過(guò)近紫外光（波長(zhǎng)約為365nm）的螢石玻璃（即氟化鈣晶體）來(lái)制造。因此特別適合于作熒光與相差方法的觀察與顯微照相，也可用在偏光顯微鏡中。 (5) 完善平像場(chǎng)復(fù)消色差物鏡（plan-opo-chromats）這是最高一級(jí)的消色差物鏡，對(duì)紅、綠、藍(lán)3種顏色都作了很好的色差校正，而視域中的像也作了完善的校正，數(shù)值孔徑比螢石物鏡大，可應(yīng)用于要求極高的顯微觀察與顯微照相中，但價(jià)格十分昂貴，由于所使用的鏡片數(shù)目多達(dá)12片，光能損失較大，不宜用作熒光觀察與照相。 (6) 已消除內(nèi)應(yīng)力又可以調(diào)節(jié)中心的物鏡（pol Z objectives）這是一種適用于作偏光觀察的物鏡，是從以上所介紹的幾種物鏡中挑選出來(lái)的，在裝配時(shí)特別注意消除了其中的內(nèi)應(yīng)力，以免內(nèi)應(yīng)力所引起的干涉條紋干擾了偏光樣品中真正的干涉條紋。 (7) 完善平像場(chǎng)螢石消色差多種介質(zhì)浸沒(méi)式物鏡（ plan-neofluar imm.）這是一種新型物鏡，采用螢石玻璃制造其中全部或部分鏡片，成像質(zhì)量特別明亮，反差十分好，色差接近于復(fù)消色差，因此又屬于半復(fù)消色差物鏡。數(shù)值孔徑特別大，透光能力強(qiáng)，而且分辨率十分好。最大的特點(diǎn)是可用好幾種浸沒(méi)介質(zhì)，如常用的浸沒(méi)油、甘油、蒸餾水等，既可使用權(quán)蓋玻片也可以不使用。這種物鏡制成干式物鏡時(shí)，可加上校正環(huán)，用來(lái)校正蓋玻片的厚度不均勻性，以消除蓋玻片厚度不規(guī)則造成的成像失真，對(duì)于厚度在0.12-0.22mm之間的蓋玻片都可以作相應(yīng)的校正。1986年以來(lái)，德國(guó)蔡司公司推出的新一代光學(xué)顯微鏡，其中的物鏡突破了傳統(tǒng)光學(xué)顯微鏡的概念，采用了無(wú)限遠(yuǎn)色差校正的光學(xué)系統(tǒng)（infinity color-corrected system，簡(jiǎn)稱ICS物鏡），其特點(diǎn)是：由物鏡射出的成像光束是一束平行光，可在成像光路中按需要插入任意多的光學(xué)部件而不影響成像質(zhì)量。在顯微鏡鏡體內(nèi)有一特制的鏡筒透鏡（tube lens）與物鏡相配，兩者結(jié)合起來(lái)把物鏡的色差與像差都作了十分完善的校正，而且物鏡的視域相當(dāng)寬闊，比傳統(tǒng)物鏡的視域擴(kuò)大約40% 。13. 熒光濾光片組插板的插口（slot for the fluorescence slider）這是為作熒光觀察時(shí)插入熒光濾光片組插板預(yù)留的插口。14. 勃氏鏡插板的插口（slot for Bertcand-lens slider）這是為作偏光觀察時(shí)插入勃氏鏡插板預(yù)留的插口，勃氏鏡是偏光顯微鏡中用作錐光干涉圖試驗(yàn)的重要部件。15. 補(bǔ)色器插板的插口（slot for auxiliary objects）這是當(dāng)作微分干涉相襯觀察和偏光需加入的各種補(bǔ)色器預(yù)留的插口。16. 雙目鏡筒或帶照像鏡筒的雙目鏡筒（binocular tubes or binocular phototubes）用來(lái)安放目鏡及照像裝置。為便于觀察，鏡筒制成具有一定傾斜角度（30或45），設(shè)有瞳距調(diào)節(jié)裝置，可在55至75范圍內(nèi)調(diào)節(jié)，以適合不同使用者兩眼瞳孔距離。雙目鏡筒內(nèi)裝有一些折光和分光棱鏡，能把從物鏡出來(lái)的一束成像光束等分成兩部分，分別由兩個(gè)目鏡作觀察。帶照像鏡筒的雙目筒一般在右測(cè)裝有