葉綠素熒光分析方法.doc

葉綠素熒光分析方法葉綠素熒光分析具有觀測手續(xù)簡便,獲得結(jié)果迅速,反應(yīng)靈敏,可以定量,對植物無破壞、少干擾的特點。它既可以用于葉綠體、葉片,也可以遙感用于群體、群落。它既是室內(nèi)光合基礎(chǔ)研究的先進工具,也是室外自然條件下診斷植物體內(nèi)光合機構(gòu)運轉(zhuǎn)狀況、分析植物對逆境響應(yīng)機理的重要方法。現(xiàn)在人們可以通過葉綠素熒光分析估計量子效率、光合能力,利用熒光參數(shù)計算光合電子傳遞速率、胞間CO2濃度,并且試圖利用熒光參數(shù)快速篩選遺傳變異的植物。有人甚至預言,將來熒光分析可能會代替氣體交換測定。20世紀80年代以來,調(diào)制熒光儀,特別是便攜式熒光儀的商品化,使熒光分析在光合作用研究中得到這樣廣泛的應(yīng)用,以至如果不懂熒光分析技術(shù),便很難看懂近年的光合作用研究文獻。1.基本原理光合機構(gòu)吸收的光能有三個可能的去向：一是用于推動光化學反應(yīng),引起反應(yīng)中心的電荷分離及后來的電子傳遞和光合磷酸化,形成用于固定、還原二氧化碳的同化力(ATP和NADPH)；二是轉(zhuǎn)變成熱散失；三是以熒光的形式發(fā)射出來。由于這三者之間存在此消彼長的相互競爭關(guān)系,所以可以通過熒光的變化探測光合作用的變化(圖4-1)。實際上,以熒光形式發(fā)射出來的光能在數(shù)量上是很少的,還不到吸收的總光能的3%。在很弱的光下,光合機構(gòu)吸收的光能大約97%被用于光化學反應(yīng),2.5%被轉(zhuǎn)變成熱散失,0.5%被變成紅色(在體內(nèi),葉綠京的熒光發(fā)射峰在685nm左右)的熒光發(fā)射出來；在很強的光下,當全部PSII反應(yīng)中心關(guān)閉時,吸收的光能95%97%被變成熱,而2.5%5.0%被變成熒光發(fā)射l。在體內(nèi),由于吸收的光能多被用于光合作用,葉綠素a熒光的量子產(chǎn)額(即量子效率)僅僅為0.030.06。但是,在體外,由于吸收的光能不能圖4-1葉綠素分子的光激發(fā)被用于光合作用,這一產(chǎn)額增加到0.250.302。在室溫條件下,絕大部分熒光來自PS II天線1,3,而不是反應(yīng)中心的葉綠素a分子4,5。這是因為反應(yīng)中心的葉綠素分子僅占葉綠素總量的幾百分之一。葉綠素熒光發(fā)射的高峰在685nm(天線色素)和695nm(反應(yīng)中心)。在體內(nèi),決定熒光產(chǎn)額的主要因素是電子的第一個穩(wěn)定的醌受體QA的氧化還原狀態(tài)。實際上,在暗適應(yīng)的健康葉片和良好的葉綠體,所有的QA都處于還原態(tài)時的最大熒光產(chǎn)額與所有的QA都處于氧化態(tài)時的最小熒光產(chǎn)額之比大致為566。然而,這個比值可以發(fā)生很大變化,取決于照光狀態(tài)和一些處理。多種因素影響熒光強度：激發(fā)光強,反應(yīng)中心對激發(fā)能的捕獲和轉(zhuǎn)化速率,激發(fā)能以熱的形式耗散的程度和兩個光系統(tǒng)間能量的分配等。當PS II的光化學反應(yīng)被阻止時,最大熒光產(chǎn)額的減少是反應(yīng)中心和天線熱耗散增加的反映。由于可以測定完整葉片的熒光,葉綠素a熒光誘導動力學可以成為原位檢測PS II重要步驟的極好的探針5。1.1 葉綠素熒光誘導動力學當一片經(jīng)過充分暗適應(yīng)的葉片從黑暗中轉(zhuǎn)入光下后,葉片的熒光產(chǎn)額會隨時間發(fā)生規(guī)律性的變化,即kautsky效應(yīng)7,記錄下來的典型熒光誘導動力學曲線上幾個特征性的點分別被命名為O、J、D、P、S、M和T8.9(圖4-2)。在照光的第一秒鐘內(nèi),熒光水平從O上升到P,這一段被稱為快相;在接下來的幾分鐘內(nèi),熒光水平從P下降到T,這一段被稱為慢相。快相與PS II的原初過程有關(guān),慢相則主要與類囊體膜上和間質(zhì)中的一些反應(yīng)過程包括碳代謝之間的相互作用有關(guān)。圖4-2 葉綠素熒光誘導動力學曲線熒光水平從O到I的上升已經(jīng)被歸因于不能將電子傳遞到PQ庫的失活的PS II中心10,這些中心具有有功能的水氧化系統(tǒng),但是對凈電子傳遞沒有明顯的貢獻。在飽和光下,當反應(yīng)中心的電荷分離速率超過從QA到QB的電子傳遞速率時,I水平大大提高11。從D到P的熒光增加是由于Fd-NADP氧化還原酶以前電子傳遞鏈中電子受體的還原4。熒光水平從FO到FP(當光強不足以使全部PS II反應(yīng)中心關(guān)閉時)的上升受多種因素的影響:PS II的協(xié)作性;PS II的異質(zhì)性;PQ庫的大小及其重新氧化的速率;PS II以外的電子傳遞速率,包括碳同化;向P680+供給電子的速率。熒光水平到達Fm表明QA已經(jīng)完全還原12。結(jié)合在D1蛋白上QB部位的DCMU能夠阻斷QA向PQ的電子傳遞,所以在這種抑制劑存在時比沒有它時從F。到Fm的熒光水平上升快得多。從F。上升到Fm所需要的時間的一半(T1/2)是估計PQ庫大小的一個簡單的指標。與陽生葉相比,陰生葉具有大的葉綠素天線和小的PQ庫,因此表現(xiàn)出一個短的T1/213。葉齡從幼變老,P、M、T的水平降低,幼葉和老葉無M峰。M峰的出現(xiàn)意味著光合誘導期的結(jié)束,快速碳同化的開始。當光合作用受到突然干擾(高光強、高CO2、磷缺乏等)時熒光誘導動力學曲線會出現(xiàn)波動。這時,用葉圓片氧電極同時記錄下來的光合氧釋放和熒光兩條動力學曲線大體上呈鏡像對稱,但是有一點相位差。這種波動現(xiàn)象可能反映了條件急劇變化后同化力的產(chǎn)生與使用之間的不平衡以及為達到平衡而發(fā)生的快速調(diào)節(jié)過程。但是,在遭受環(huán)境脅迫的葉片看不到這樣的波動14,可能是由于脅迫削弱了光合機構(gòu)的同化力生產(chǎn)和調(diào)節(jié)能力的緣故。1.2 低溫熒光(77K)人們通常在植物正常生長的生理溫度(文獻中常稱之為室溫)下測定葉綠素熒光。但是,有時為了某種研究的需要,也在液氮(即77K,-196)溫度下進行觀測。在這樣的低溫下,任何與溫度有關(guān)的酶反應(yīng)和電子傳遞能力對熒光水平的影響都被避免,因此只有原初光化學反應(yīng)的變化被反映出來10,12。77K熒光是測定PS II光化學效率(Fv/Fm)的一個重要工具,多種維管束植物健康而未遭受環(huán)境脅迫的葉片的Fv/Fm值為0.8320.00415。77K熒光也常被用于研究兩個光系統(tǒng)之間的能量分配,因為在這樣的低溫下,PS II和PS I分別在695nm和735nm處(高等植物)有各自的熒光發(fā)射峰6。PS I在735nm處的熒光增加往往是PS II向PS I增加激發(fā)能分配的結(jié)果(見第15章)。與室溫熒光不同,在77K下,天線和核心復合體不同組分之間激發(fā)能的快速平衡是不可能的。因此,在關(guān)于天線和反應(yīng)中心組織結(jié)構(gòu)的研究中,77K熒光光譜分析具有重要的用途。1.3 調(diào)制熒光在用于葉綠素熒光測定和猝滅分析儀器上的一個革命性進展,就是使用調(diào)制光于測定系統(tǒng)中16。在這樣的系統(tǒng)中,用于測定熒光的光源被調(diào)制,也就是使用以很高頻率不斷開關(guān)的光源。并且,在這樣的系統(tǒng)中,使用的檢測器通過選擇性放大僅僅檢測被這種調(diào)制光激發(fā)的熒光。因此,利用這樣的系統(tǒng),不僅可以大大提高信號/噪聲的比例,而且還可以在背景光,特別是在田間很強的太陽光存在的情況下測定相對的熒光產(chǎn)額。Schreiber(1986)17及其同事(1986)18研制的PAM熒光儀(德國Walz公司制造)就是這樣的調(diào)制式熒光測定系統(tǒng),用它可以測定Fo、Fo、Fm、Fm、Fs,計算Fv/Fm、(Fm-Fs)/Fm、NPQ、qp和qN等。1.4 熒光猝滅熒光猝滅就是熒光產(chǎn)額降低。一切使熒光產(chǎn)額低于其最大值的過程,都被稱為熒光猝滅過程。對于不同熒光猝滅組分的分辨,能夠提供關(guān)于光合機構(gòu)功能狀態(tài)的重要資料。熒光猝滅可分兩類:光化學猝滅,即由光化學反應(yīng)引起的熒光產(chǎn)額的降低,它有賴于氧化態(tài)QA的存在。非光化學猝滅,即由非光化學過程例如熱耗散過程引起的熒光產(chǎn)額的降低。它是植物體內(nèi)光合量子效率調(diào)節(jié)的一個重要方面19。非光化學猝滅涉及三個不同的機理20:qE依賴類囊體膜內(nèi)外的質(zhì)子濃度差,暗弛豫的半時間t1/21min,快相。QT依賴狀態(tài)1向狀態(tài)2的轉(zhuǎn)換,PS II的捕光復合體磷酸化,脫離PS II,從類囊體的基粒區(qū)遷移到間質(zhì)片層區(qū),從而減少激發(fā)能向PS II的分配,增加激發(fā)能向PS I的分配,t1/2=8min,中間相。它比qE和qI小得多,強光下qE和qI增加,而qT受抑制。QI與光合作用的光抑制有關(guān),它常表現(xiàn)為可變熒光與最大熒光比值的降低,t1/2=40min,慢相。關(guān)于這后一種非光化學猝滅,有三種假說。假說一：這種非光化學熒光猝滅起源于PS II的反應(yīng)中心,部分PS II中心發(fā)生變化,雖然還能捕捉激發(fā)能,但不能進行光化學反應(yīng),而把能量變成熱。假說二：這種非光化學熒光猝滅起源于PS II的天線色素,它通過非輻射能量耗散消耗激發(fā)能,與葉黃素循環(huán)過程中生成的玉米黃素有關(guān)。假說三:這種非光化學熒光猝滅與D1蛋白(曾用名QB蛋白)的失活和降解有關(guān)。2 熒光參數(shù)關(guān)于各種熒光參數(shù)的命名和定義,在不同時期和不同作者的文章中很不一致。對于Fo、Fi、Fp、Fs、Fm、Fm、Fo、Fv和Fv,這里采用的基本上是van kooten和Snel(1990)19統(tǒng)一的命名。2.1 基礎(chǔ)參數(shù)Fo有多種名稱,最小(minimal)、基底(ground)、暗(dark)、初始(initial)和不變(un-changed,constant)熒光強度等。它是已經(jīng)暗適應(yīng)的光合機構(gòu)全部PS II中心都開放時的熒光強度,qp=1,qN=0。絕大部分學者都認為,Fo熒光來自天線葉綠素(Chl)a12。Fi熒光誘導動力學曲線O-I-D-F-T中I水平的熒光強度。Fp熒光誘導動力學曲線O-I-D-P-T中P水平的熒光強度。Fs熒光誘導動力學曲線O-I-D-P-T中T水平的熒光強度。Fm黑暗中最大(maximum)熒光,它是已經(jīng)暗適應(yīng)的光合機構(gòu)全部PS II中心都關(guān)閉時的熒光強度,qp=0。這時所有的非光化學過程都最小,qN=0,這是標準的(classical)最大熒光。Fm光下最大熒光,在光適應(yīng)狀態(tài)下全部PS II中心都關(guān)閉時的熒光強度,qp=0,qNO。Fm受非光化學猝滅的影響,而不受光化學猝滅的影響4。Fo光下最小熒光,在光適應(yīng)狀態(tài)下全部PSII中心都開放時的熒光強度,qp=1,qN0。為了使照光后所有的PSII中心都迅速開放,一般在照光后和測定前應(yīng)用一束遠紅光(波長大于680nm,幾秒鐘)。Fv黑暗中最大可變(variable)熒光強度,Fv=Fm-Fo。Fv光下最大可變熒光強度, Fv=Fm-Fo。2.2 表明PSII光化學效率的參數(shù)Fv/Fm沒有遭受環(huán)境脅迫并經(jīng)過充分暗適應(yīng)的植物葉片PSII最大的或潛在的量子效率指標,它是比較恒定的,一般在0.800.85之間。有時,Fv/Fm也被稱為開放的PSII反應(yīng)中心的能量捕捉效率1。Fv/Fo是Fv/Fm的另一種表達方式12,Fv/Fo=(Fv/Fm)/(1-Fv/Fm)。盡管Fv/Fo不是一個直接的效率指標,但是它對效率的變化很敏感。因為一些處理引起的Fv/Fo變化的幅度比Fv/Fm變化的幅度大得多,所以Fv/Fo在一些情況下是表達資料的好形式。此外,Fm/Fo也是Fv/Fm的另一種表達方式,因為Fm/Fo=(Fv+Fo)/Fo=Fv/Fo+1。當Fv/Fm為0.860.90時,Fm/Fo則相應(yīng)地為7106。(Fm-Fs)/Fm作用光存在時PSII的實際的量子效率,即PSII反應(yīng)中心電荷分離的實際的量子效率6。這里,Fs是穩(wěn)態(tài)熒光水平,Fm是在作用光存在時一個飽和光脈沖激發(fā)的熒光水平。計算這個參數(shù)不需要準確測定Fo,因此它不受Fo變化的影響21。PSII實際的電子傳遞的量子效率這個參數(shù)PSII=(Fm-Fs)/Fm不僅與碳同化有關(guān),也與光呼吸及依賴O2的電子流有關(guān)22。由于它是PSII光化學反應(yīng)的量子效率,所以可以利用它計算非循環(huán)電子傳遞速率(J)以及體內(nèi)的總光合電子傳遞能力22,23:J=PSIIPFDa0.5這里,PFDa是被吸收的光通量密度(molm-2s-1),0.5代表光能在兩個光系統(tǒng)間的分配系數(shù)。如果假設(shè)入射到葉片表面的光能平均有84%被葉片吸收,并且平均分配給兩個光系統(tǒng),則上式可以寫成6:J=PSIIPFD0.42。Fv/Fm開放的PSII反應(yīng)中心的激發(fā)能捕獲效率24。由它可以計算某PFD下量子效率的相對限制或光合功能的相對限制L(PFD)22:qp和Fv/Fm的降低。只有當qp=1和Fv/Fm=0.83時,L(PFD)=0,即不存在限制。DemEnig-Adams等(1996)提出25,使用Fv/Fm來估計光合機構(gòu)吸收的光能被用于光化學反應(yīng)和天線熱耗散的相對份額,兩者分別為:前者P=Fv/Fmqp,后者D=1-Fv/Fm。熱耗散的速率為:(1-Fv/Fm)PFD。有證據(jù)表明,在自然生境中,陸生植物Fv/Fm的日變化一般是由PS II天線復合體熱耗散水平的變化引起的。這和Fv/Fm的變化與NPQ的變化成比例的結(jié)果相一致25。我們在一個葉綠素缺乏的大麥突變體觀察到,突變體光系統(tǒng)II光化學效率(Fv/Fm)比其野生型高,并提出其可能的原因是光系統(tǒng)II向光系統(tǒng)I傳遞的激發(fā)能少26,27。2.3 熒光猝滅參數(shù)qp=(Fm-Fs)/(Fm-Fo),光化學猝滅系數(shù)21。這里,(Fm-Fs)代表光化學猝滅的熒光。qp是表示總PSII反應(yīng)中心中開放的反應(yīng)中心所占比例的指標,而1-qp則是關(guān)閉的反應(yīng)中心所占比例,反映QA的還原程度,有時被稱為PSII的激發(fā)壓(excitation pressure)28。因為氧化態(tài)的QA是PSII電子傳遞的原初醌受體,它決定PSII的激發(fā)能捕獲速率,所以光化學猝滅也被稱為Q猝滅。qp和Fv/Fm、PSII之間有如下關(guān)系23:Fv/Fm=PSII/qp。qN=1-(Fm-Fo)/(Fm-Fo)=1-Fv/Fv。實際上,qN是一個定量非光化學猝滅的舊術(shù)語,它的計算以測定Fo和Fo為前提,而Fo和Fo的測定不準確會造成計算結(jié)果的偏差。NPQ=(Fm-Fm)/Fm=Fm/Fm-1。這里(Fm-Fm)代表非光化學猝滅的熒光6,22,23,29。NPQ的變化反映熱耗散的變化。這個計算不需要測定Fo和Fo,但是必須測定一個充分暗適應(yīng)葉片的參比值Fm,最好是經(jīng)過一個夜晚暗適應(yīng)的黎明時刻的Fm值,這時光化學效率最大,而熱耗散最小。3 測定與分析3.1 光源熒光測定和猝滅分析需要幾種不同的光源:(1)檢測光綠光,光強PPFD小于10molm-2s-1,用于測Fo。(2)作用光通常用白光,用于推動光合作用的光化學反應(yīng),光強可因?qū)嶒災(zāi)康牟煌兓?3)飽和脈沖光通常用自光,光強PPFD大于3000molm-2s-1,確保QA全部還原,用于測Fm和Fm。(4)弱遠紅光(或暗)以便PSI推動QA氧化,測Fo前使用。3.2 基本步驟在植物對各種環(huán)境脅迫響應(yīng)的分子機理研究中,為了獲得未遭受任何環(huán)境脅迫的對照葉片的基本熒光參數(shù),首先需要讓對照葉片經(jīng)過一個充分的暗適應(yīng)過程。最好是經(jīng)過一個黑暗的夜晚。首先,給一個經(jīng)過充分暗適應(yīng)的葉片照射檢測光,經(jīng)過一小段時間(12min)熒光水平穩(wěn)定后得到熒光參數(shù)Fo。接著,給一個飽和脈沖光,一個脈沖后關(guān)閉,得到熒光參數(shù)Fm,于是得到熒光參數(shù)Fv/Fm(Fv=Fm-Fo),即潛在的PS II的光化學效率。其次,打開可以引起葉片光合作用的作用光,一般PPFD為幾百molm-2s-1,可因植物生長條件或?qū)嶒災(zāi)康牟煌兓?幾分鐘到幾十分鐘后葉片光合作用達到穩(wěn)態(tài),得到熒光參數(shù)Fs(圖4-3)。這時再給飽和脈沖光一個脈沖后關(guān)閉,得到熒光參數(shù)Fm,于是可以計算作用光存在時PS II的實際的量子效率(Fm-Fs)/Fm和熒光的非光化學猝滅系數(shù)NPQ即(Fm-Fm)/Fm。再次,關(guān)閉作用光,立即打開遠紅光,幾秒鐘后關(guān)閉,這時得到熒光參數(shù)Fo,于是可以計算熒光的光化學猝滅系數(shù)qp,即(Fm-Fs)/(Fm-Fo)。如果想?yún)^(qū)分非光化學猝滅的三個不同的組分,可以按Quick和Stitt(1989)20的方法進行測定和計算。我們使用這項技術(shù)發(fā)現(xiàn),在小麥葉片發(fā)育期間這三個組分的相對貢獻發(fā)生規(guī)律性的變化:在剛剛完全展開的旗葉和開始衰老的旗葉qN是類似的。但是在晴天中午,前者中間組分明顯降低,而后者的中間組分保持較高水平,并且前者快組分明顯高于慢組分,而后者快組分則明顯低于慢組分。這些結(jié)果說明,保護光合機