人用重組DNA制品質(zhì)量控制技術指導原則.doc

人用重組DNA制品質(zhì)量控制技術指導原則一、引言1二、總則1三、質(zhì)量控制要求1四、臨床前安全性評價6 一、引言 由于分子遺傳學、核酸化學及重組DNA（rDNA）技術的迅速發(fā)展，現(xiàn)已能夠確定和獲得許多天然活性蛋白的編碼基因，將其插入表達載體或引入某種宿主細胞后，能有效地表達該基因產(chǎn)物，再經(jīng)分離、純化和檢定，可得到用于預防和治療某些人類疾病的制品，諸如現(xiàn)有的乙型肝炎疫苗、胰島素、生長激素、干擾素等。 用不同于常規(guī)方法的rDNA技術生產(chǎn)的制品，是近年來出現(xiàn)的新產(chǎn)品，評價其安全性和有效性亦不同于常規(guī)方法。這一領域中的知識和技術還在不斷發(fā)展，為了有利于這類制品在我國的研究和發(fā)展，并為這類制品的審評提供依據(jù)，有必要制定一個原則性指導文件，以保證在人群中試驗或應用時安全有效。 本“人用重組DNA制品質(zhì)量控制技術指導原則”（以下簡稱指導原則）不可能面面俱到，可能有許多專門技術問題會出現(xiàn)，對于這類問題或某一特定制品，則應視具體問題具體研究決定。本指導原則亦將隨科學技術發(fā)展和經(jīng)驗積累而逐步完善。 二、總則 （一）本指導原則適用于rDNA技術生產(chǎn)并在人體內(nèi)應用的蛋白質(zhì)、肽類制品。 （二）凡屬與一般生物制品有關的質(zhì)量控制，均按現(xiàn)行版中國藥典有關規(guī)定執(zhí)行。有關生產(chǎn)設施的要求應參照國家藥品監(jiān)督管理局藥品生產(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范執(zhí)行。 三、質(zhì)量控制要求 （一）原材料的控制 1表達載體和宿主細胞 應提供有關表達載體詳細資料，包括基因的來源、克隆和鑒定，表達載體的構建、結構和遺傳特性。應說明載體組成各部分的來源和功能，如復制子和啟動子來源，或抗生素抗性標志物。提供至少包括構建中所用位點的酶切圖譜。應提供宿主細胞的資料，包括細胞株（系）名稱、來源、傳代歷史、檢定結果及基本生物學特性等。應詳細說明載體引入宿主細胞的方法及載體在宿主細胞內(nèi)的狀態(tài)（是否整合到染色體內(nèi)）及拷貝數(shù)。應提供宿主和載體結合后的遺傳穩(wěn)定性資料。 2克隆基因的序列 應提供插入基因和表達載體兩側(cè)端控制區(qū)的核苷酸序列。所有與表達有關的序列均應詳細敘述。 3表達 應詳細敘述在生產(chǎn)過程中，啟動和控制克隆基因在宿主細胞中的表達所采用的方法及表達水平。 4原輔料 原輔料應按照國家藥品監(jiān)督管理局有關規(guī)定執(zhí)行。動物源性原料的使用應提供來源及質(zhì)控檢測資料；發(fā)酵用培養(yǎng)基不能添加餑邗防囁咕亍 （二）生產(chǎn)的控制 1主細胞庫（MASTERCELLBANK） rDNA制品的生產(chǎn)應采用種子批（SEEDLOT）系統(tǒng)。從已建立的主細胞庫中，再進一步建立生產(chǎn)細胞庫（WCB）。 含表達載體的宿主細胞應經(jīng)過克隆而建立主細胞庫。在此過程中，在同一實驗室工作區(qū)內(nèi)，不得同時操作兩種不同細胞（菌種）；一個工作人員亦不得同時操作兩種不同細胞或菌種。 應詳細記述種子材料的來源、方式、保存及預計使用壽命。應提供在保存和復蘇條件下宿主載體表達系統(tǒng)的穩(wěn)定性證據(jù)。采用新的種子批時，應重新作全面檢定。真核細胞用于生產(chǎn)時，細胞的鑒別標志，如特異性同功酶或免疫學或遺傳學特征，對鑒別所建立的種子是有用的。有關所用傳代細胞的致癌性應有詳細報告。如采用微生物培養(yǎng)物為種子，則應敘述其特異表型特征。 一般情況下，在原始種子階段應確證克隆基因的DNA序列。但在某些情況下，例如傳代細胞基因組中插入多拷貝基因。在此階段不適合對克隆基因作DNA序列分析。在此情況下，可采用總細胞DNA的雜交印染分析，或作mRNA的序列分析。對最終產(chǎn)品的特征鑒定應特別注意。 種子批不應含有外源致癌因子，不應含有感染性外源因子，如細菌、支原體、真菌及病毒。 有些細胞株含有某些內(nèi)源病毒，例如逆轉(zhuǎn)錄病毒，且不易除去。但當已確知在原始細胞庫或載體部分中污染此類特定內(nèi)源因子時，則應能證明在生產(chǎn)純化過程可使之滅活或清除。 2有限代次生產(chǎn) 用于培養(yǎng)和誘導基因產(chǎn)物的材料和方法應有詳細資料。對培養(yǎng)過程及收獲時，應有敏感的檢測措施控制微生物污染。 應提供培養(yǎng)生長濃度和產(chǎn)量恒定性方面的數(shù)據(jù)，并應確立廢棄一批培養(yǎng)物的指標。根據(jù)宿主細胞載體系統(tǒng)的穩(wěn)定性資料，確定在生產(chǎn)過程中允許的最高細胞倍增數(shù)或傳代代次，并應提供最適培養(yǎng)條件的詳細資料。 在生產(chǎn)周期結束時，應監(jiān)測宿主細胞載體系統(tǒng)的特性，例如質(zhì)?？截悢?shù)、宿主細胞中表達載體存留程度、含插入基因的載體的酶切圖譜。一般情況下，用來自一個原始細胞庫的全量培養(yǎng)物進行監(jiān)測，必要時應做一次目的基因的核苷酸序列分析。 3連續(xù)培養(yǎng)生產(chǎn) 基本要求同2項。 應提供經(jīng)長期培養(yǎng)后所表達基因的分子完整性資料，以及宿主細胞的表型和基因型特征。每批培養(yǎng)的產(chǎn)量變化應在規(guī)定范圍內(nèi)。對可以進行后處理及應廢棄的培養(yǎng)物，應確定指標。從培養(yǎng)開始至收獲，應有敏感的檢查微生物污染的措施。 根據(jù)宿主載體穩(wěn)定性及表達產(chǎn)物的恒定性資料，應規(guī)定連續(xù)培養(yǎng)的時間。如屬長時間連續(xù)培養(yǎng)，應根據(jù)宿主載體穩(wěn)定性及產(chǎn)物特性的資料，在不同間隔時間作全面檢定。 4純化 對于收獲、分離和純化的方法應詳細記述，應特別注意污染病毒、核酸以及有害抗原性物質(zhì)的去除。 如采用親和層析技術，例如用單克隆抗體，應有檢測可能污染此類外源性物質(zhì)的方法，不應含有可測出的異種免疫球蛋白。 對整個純化工藝應進行全面研究，包括能夠去除宿主細胞蛋白、核酸、糖、病毒或其它雜質(zhì)以及在純化過程中加入的有害的化學物質(zhì)等。 關于純度的要求可視制品的用途和用法而確定，例如，僅使用一次或需反復多次使用；用于健康人群或用于重癥患者；對純度可有不同程度要求。 （三）最終產(chǎn)品的控制 應建立有關產(chǎn)品的鑒別、純度、穩(wěn)定性和活性等方面的試驗方法。檢測的必要性和純度要求取決于多種因素：產(chǎn)品性質(zhì)和用途、生產(chǎn)和純化工藝及生產(chǎn)工藝的經(jīng)驗。一般說來下列試驗對控制產(chǎn)品質(zhì)量是可以采用的。新的分析技術及對現(xiàn)有技術的改進正在不斷進行，適當時應使用這些新的技術。 1物理化學鑒定 （1）氨基酸組成 使用各種水解法和分析手段測定氨基酸的組成，并與目的蛋白基因序列推導的氨基酸組成或天然異構體比較。如需要時應考慮分子量的大小。多數(shù)情況下，氨基酸組成分析對肽段和小蛋白可提供有價值的結構資料，但對大蛋白一般意義較小。在多數(shù)情況下，氨基酸定量分析數(shù)據(jù)可用于確定蛋白含量。 （2）氨基酸末端序列 氨基酸末端分析用于鑒別N-端和C-端氨基酸的性質(zhì)和同質(zhì)性。若發(fā)現(xiàn)目的產(chǎn)品的末端氨基酸發(fā)生改變時，應使用適當?shù)姆治鍪侄闻卸ㄗ儺愺w的相應變異數(shù)量。應將這些氨基酸末端序列與來自目的產(chǎn)品基因序列推導的氨基酸末端序列進行比較。 （3）肽譜 應用合適的酶或化學試劑使所選的產(chǎn)品片段產(chǎn)生不連續(xù)多肽，應用HPLC或其他適當?shù)姆椒ǚ治鲈摱嚯钠?。應盡量應用氨基酸組成分析技術，N-末端測序或質(zhì)譜法鑒別多肽片段。對批簽發(fā)來說,經(jīng)驗證的肽譜分析經(jīng)常是確證目的產(chǎn)品結構/鑒別的適當方法。 （4）巰基和二硫鍵 如果依據(jù)目的產(chǎn)品基因序列存在半胱氨酸殘基時，應盡可能確定巰基和/或二硫鍵的數(shù)量和位置。使用方法包括肽譜分析（還原和非還原條件下）、質(zhì)譜測定法或其他適當?shù)姆椒ā?（5）碳水化合物結構 應測定糖蛋白中碳水化合物含量（中性糖、氨基糖、唾液酸）。此外盡可能分析碳水化合物的結構、寡糖形態(tài)（長鏈狀）和多肽的糖基化位點。 （6）分子量 應用分子篩層析法、SDS-PAGE（還原和/或非還原條件下）、質(zhì)譜測定法、和/或其他適當技術測定分子量。 （7）等電點 通過等電聚焦電泳或其他適當?shù)姆椒y定。 （8）消光系數(shù)（或克分子吸光度） 多數(shù)情況下，可取目的產(chǎn)品于UV/可見光波長處測定消光系數(shù)（或克分子吸光度）。消光系數(shù)的測定為使用UV/可見光或分光光度計檢測已知蛋白含量的溶液，蛋白含量應用氨基酸組成分析技術或定氮法等方法測定。 （9）電泳圖型 應用PAGE電泳、等電聚焦、SDSPAGE電泳、免疫印跡、毛細管電泳法或其他適當?shù)姆椒?獲得目的產(chǎn)品/藥物的一致性,同一性和純度的電泳圖譜和數(shù)據(jù)。 （10）液相層析圖譜 應用分子篩層析、反相液相層析、離子交換液相層析、親和層析或其他適當方法，獲得目的產(chǎn)品/藥物的一致性、同一性和純度的層析圖譜和數(shù)據(jù)。 （11）光譜分析 適當時，應用紫外或可見光吸收光譜法測定，使用圓二色譜、核磁共振（NMR）、或其他適當?shù)姆椒z測制品的高級結構。 2雜質(zhì)檢測 （1）工藝相關雜質(zhì) 工藝相關雜質(zhì)來源于生產(chǎn)工藝，可分三大類：來源于細胞基質(zhì)、培養(yǎng)基和下游工藝。 來源于細胞基質(zhì)的雜質(zhì)包括源于宿主生物體的蛋白/多肽；核酸（宿主細胞/載體/總DNA）；多糖及病毒。對于宿主細胞蛋白，一般應用能檢測出較寬范圍蛋白雜質(zhì)的靈敏的免疫檢測方法。應用不含目的基因的生物體粗提物，即不含產(chǎn)品編碼基因的生產(chǎn)用細胞，制備上述試驗使用的多克隆抗體?？赏ㄟ^對產(chǎn)品的直接分析方法（如雜交技術法）檢測宿主細胞的DNA水平，和/或通過標記實驗（實驗室規(guī)模）檢測證實通過純化工藝能去除核酸。對于有意導入的病毒，應驗證生產(chǎn)工藝中去除/滅活病毒的能力。 來源于培養(yǎng)基的雜質(zhì)包括誘導劑（多核苷酸,病毒）、抗生素、血清及其他培養(yǎng)基組分。 來源于下游工藝產(chǎn)生的雜質(zhì)包括酶、化學/生化處理試劑（如溴化氰、胍、氧化劑和還原劑）、無機鹽（如重金屬、砷、非有色金屬離子）、溶劑、載體/配體（如單克隆抗體），及其他可濾過的物質(zhì)。 （2）產(chǎn)品相關雜質(zhì) 以下為最常見的目的產(chǎn)品的分子變異體，并列出了相應的檢測方法： 化學修飾類型：應考慮脫酰胺、異構化、錯配S-S連接和氧化形式的分離和鑒別。對這些變異體的分離和鑒別，可應用層析法和/或電泳法（如HPLC、毛細管電泳、質(zhì)譜法、圓二色譜）。 降解物和聚合體：聚合體包括二聚體和多聚體：可用分子篩層析法（如SE-HPLC）進行定量；降解物：應建立降解物的判定標準，并對穩(wěn)定性試驗產(chǎn)生的降解產(chǎn)物進行監(jiān)測。 3生物學測定 （1）鑒別試驗 應用免疫印跡法，或者在可能情況下，應用參考品將rDNA制品與天然產(chǎn)品通過生物學比較試驗，確定其與天然產(chǎn)品是一致的。 （2）效價測定 采用國際或國家參考品，或經(jīng)過國家檢定機構認可的參考品，以體內(nèi)或體外法測定制品的生物學活性，并標明其活性單位。 （3）特異比活性測定 在測定生物學活性的基礎上，對有些制品還應用適當方法測定主藥蛋白含量，測定其特異比活性，以活性單位重量表示。 （4）熱原質(zhì)試驗 應采用家兔法或鱟試驗法（LAL）作熱原質(zhì)檢測，控制標準可參照天然制品的要求。 （5）無菌試驗 參照現(xiàn)行版中國藥典有關規(guī)定進行，應證實最終制品無細菌污染。 （6）抗原性物質(zhì)檢查 必要時，如制品屬大劑量反復使用者，應測定最終制品中可能存在的抗原性物質(zhì)，如宿主細胞、亞細胞組分及培養(yǎng)基成份等?；颊叻磸徒邮艽髣┝康倪@類制品時，應密切監(jiān)測由這些抗原可能產(chǎn)生的抗體或變態(tài)反應。 （7）異常毒性試驗 可參照現(xiàn)行版中國藥典有關規(guī)定進行。 4其他 根據(jù)產(chǎn)品劑型，應有外觀（如固體、液體、色澤、澄明度等方面的描述）、水分、PH值、裝量等方面的規(guī)定，可參照現(xiàn)行版中國藥典相關規(guī)定執(zhí)行。 四、臨床前安全性評價 臨床前安全性試驗的目的主要是確定新制品是否會在人體引起未能預料的不良反應。但是，用于一般化學藥物的傳統(tǒng)安全性或毒性試驗對rDNA產(chǎn)品不一定適用，用傳統(tǒng)毒性試驗來評價rDNA產(chǎn)品往往有困難，并受多種因素的影響。例如，某些蛋白質(zhì)，如干擾素，具有高度種屬特異性，這種人的蛋白質(zhì)對人的藥理學活性遠高于對動物的活性，而且人的蛋白質(zhì)氨基酸序列，常常與來自其它種系的蛋白質(zhì)不同，例如糖基就不一樣。因而由基因工程技術所制備的蛋白質(zhì)或肽類往往會在人體以外的其它宿主中產(chǎn)生免疫應答，其生物學效應有所改變，并可能因形成免疫復合物而導致有毒性反應，而這樣產(chǎn)生的毒性反應與人體安全性顯然無關。 另外，