苦丁茶多酚的提取及抗氧化活性研究.doc

苦丁茶多酚的提取及抗氧化活性研究劉佳，焦士蓉*，唐遠(yuǎn)謀，唐鵬程，馮慧（西華大學(xué)生物工程學(xué)院，成都，610039）摘要：對(duì)苦丁茶中多酚的提取及抗氧化活性進(jìn)行研究。通過(guò)單因素和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)可知，在乙醇濃度50%、固液比為1：24、提取時(shí)間為62s、微波功率為291W時(shí)可獲得最高的提取率，為115.40mg/g?？喽〔瓒喾訉?duì)DPPH自由基、OH由基、O2自由基的半清除濃度以及對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化的半抑制濃度分別為29.24mg/L、34.14mg/L、872.3mg/L、11.48mg/L。關(guān)鍵詞：苦丁茶；多酚；提取；響應(yīng)面分析法；抗氧化Study on the extraction of polyphenols from Kuding Tea and antioxidant activitiesLIU Jia, JIAO Shi-rong*,TANG Yuan-mou,TANG Peng-cheng,FENG Hui(School of Bioengineering of Xihua University,chengdu,610039)Abstract: Kuding Tea polyphenols extraction optimization and its antioxidant activities were studied in this paper. The best processing parameters for extraction were attained by single factors and RSM, when the ethanol concentration was 52% , solid-liquid ratio was 1:24, at 291W for 62s the yield of polyphenols was 114.82mg/g.The effective concentration for scarenging 50% DPPH free radical,hydroxyl radical,O2-radical were 29.24mg/l,34.14mg/l and 872.3mg/l,respectively. The effective concentration of inhibitory 50% lipid peroxidation was 11.48mg /l.Keywords: Kuding Tea; polyphenols; extraction; response surface analysis; antioxidan.“苦丁茶”是我國(guó)一大類代茶植物或代茶產(chǎn)品的統(tǒng)稱。冬青屬苦丁茶主要產(chǎn)于我國(guó)南部及西南部地區(qū)，是民間傳統(tǒng)的藥用植物。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，苦丁茶有防治心腦血管系統(tǒng)疾病、降低血壓、降脂、抗氧化等藥理保健作用1，其粗提物均有不同程度的抑菌作用2。由苦丁茶冬青葉片制成的苦丁茶是民間常用中草藥，是傳統(tǒng)中成藥“甘和茶”的主要原料之一3，其所含的各種成分的藥理作用及保健功能日益引起人們的關(guān)注4。 本文采用響應(yīng)面法，以苦丁茶多酚含量作為響應(yīng)值，對(duì)苦丁茶多酚的提取進(jìn)行了探討，旨在得到最優(yōu)的提取工藝，并通過(guò)幾個(gè)方面研究苦丁茶多酚的抗氧化性能，為苦丁茶保健成分的開發(fā)提供了依據(jù)。1 材料與方法1.1 材料與儀器作者簡(jiǎn)介劉佳(1987-)，女，四川廣元人，碩士研究生，研究方向：食品營(yíng)養(yǎng)與安全，Email：*通訊作者：焦士蓉(1968-)，女，博士，副教授，安徽安慶人，碩士生導(dǎo)師，研究方向：食品生物技術(shù)，Email： 原料：苦丁茶粉碎過(guò)80目篩；福林-酚試劑（北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司）；DPPH自由基（Sigma公司）；2-硫代巴比妥酸（上?？曝S化學(xué)試劑有限公司）；其他常見試劑均為分析純，成都科龍化工試劑廠。儀器： TB-214型電子天平 (美國(guó)丹佛儀器設(shè)備廠)；HH-S型數(shù)顯恒溫水浴鍋 (金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠)；UV-2600型紫外可見分光光度計(jì) (上海尤尼柯儀器有限公司)；MP17C-KE美的家用微波爐 (佛山市順德區(qū)北滘鎮(zhèn)三洪奇工業(yè)區(qū))。1.2 試驗(yàn)方法1.2.1 多酚含量測(cè)定 采用福林-酚比色法5，以沒(méi)食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，標(biāo)準(zhǔn)曲線y=0.0081x0.0286，R2=0.9999，計(jì)算公式為p=(cvn) /(w103)。1.2.2 抗氧化活性的測(cè)定 對(duì)DPPH自由基的清除按照文獻(xiàn)6的方法并做適當(dāng)修正：稱取2,2-二苯代苦味?；?,2-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH）標(biāo)準(zhǔn)品20mg，無(wú)水乙醇定容至500mL，得濃度為0.04mg/mL溶液。取此溶液3mL，加入樣品液1 mL，室溫反應(yīng)30min，517nm處測(cè)定吸光度值，空白組以1 mL無(wú)水乙醇代替樣品液，并按下式計(jì)算清除率：DPPH清除率（%）=（1-A試樣/A空白）100% 對(duì)OH自由基的清除按照金鳴7等人的比色法，以下式計(jì)算清除率H(%)： 對(duì)O2自由基的清除參照文獻(xiàn)8的實(shí)驗(yàn)方法，清除率按照下式計(jì)算S(%)： 對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制參考文獻(xiàn)9的方法進(jìn)行對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化抑制率的測(cè)定，抑制率I（%）計(jì)算公式為：2 結(jié)果與分析2.1 提取溶劑的篩選稱取苦丁茶粉樣品2克，采用水及分析純的乙醇、丙酮、乙酸乙酯溶液作為溶劑，在提取時(shí)間為80s、固液比為1:20、微波功率為291W的條件下進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖1：圖1 溶劑對(duì)苦丁茶多酚提取的影響Fig.1:The effect of solvents on the extraction of polyphenols from Kuding Tea由圖1可知：提取溶劑為丙酮時(shí)，苦丁茶多酚提取率最高，乙醇次之；由于丙酮的毒性以及溶劑價(jià)格較高的因素，選取乙醇作為提取溶劑。2.2 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析2.2.1 乙醇濃度對(duì)苦丁茶多酚提取的影響按照2.1的提取方法，改變乙醇濃度進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖2： 圖2 乙醇濃度對(duì)苦丁茶多酚提取的影響Fig.2:The effect of ethanol concentration on the extraction of polyphenols from Kuding Tea由圖2可知，當(dāng)乙醇濃度為50%時(shí)，苦丁茶多酚的提取率最高，故乙醇濃度選取50%。2.2.2 料液比對(duì)苦丁茶多酚提取的影響乙醇濃度為50%，其他條件同2.2.1，改變料液比，結(jié)果如圖3：圖3 固液比對(duì)苦丁茶多酚提取的影響Fig.3:The effect of solid-liquid ratio on the extraction of polyphenols from Kuding Tea由圖3可知：當(dāng)料液比為1:20時(shí)苦丁茶多酚提取率最高，故選取料液比為1:20。 2.2.3 提取時(shí)間對(duì)苦丁茶多酚提取的影響料液比為1:20，其他條件同2.2.2，改變提取時(shí)間，結(jié)果如圖4：圖4 提取時(shí)間對(duì)苦丁茶多酚提取的影響Fig. 4:The effect of microwave time on the extraction of polyphenols from Kuding Tea由圖4可知，當(dāng)提取時(shí)間為60s時(shí)，苦丁茶多酚提取量最大，選取提取時(shí)間60s。2.2.4 微波功率對(duì)苦丁茶多酚提取的影響選取提取時(shí)間為60s，其他條件同2.2.3，改變微波功率，結(jié)果如圖5：圖5 微波功率對(duì)苦丁茶多酚提取的影響Fig.5:The effect of microwave power on the extraction of polyphenols from Kuding Tea由圖5可知，微波功率為291W時(shí)，苦丁茶多酚提取最高，故選取提取功率為291W。2.3 響應(yīng)曲面法結(jié)果與分析選取乙醇濃度、料液比、提取時(shí)間3個(gè)因素做Box-Behnken設(shè)計(jì)，并且以苦丁茶多酚含量作為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)及結(jié)果見下表。表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)因素水平及編碼Table 1 Box-Behnken design experiments factor level and codes變量代碼編碼水平未編碼編碼10+1乙醇濃度/(%)X1A405060固液比/(W:V)X2B152025提取時(shí)間/(s)X3C506070注：A=(X1-50)/10；B=(X2-20)/5；C=(X3-60)/10表2 Box-Behnken設(shè)計(jì)Table 2 Box-Behnken design實(shí)驗(yàn)編號(hào)ABC含量(mg/g)111095.00211099.36311098.554110109.155101104.366101104.85710195.658101100.209011110.4510011110.041101196.2412011114.6313000112.0214000113.8315000113.80利用Design Expert軟件對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行分析，得到多酚含量（Y）對(duì)乙醇濃度（A）、固液比（B）、提取時(shí)間（C）的二次多項(xiàng)回歸方程：Y=113.222.50A3.92B2.87C1.56AB1.02AC4.70BC9.64A23.06B22.31C2實(shí)驗(yàn)所選用模型P值為0.0019，極顯著（P0.05），決定系數(shù)R2 =0.9741，說(shuō)明響應(yīng)值的變化有97.41%來(lái)源于所選變量，該方程的擬合情況好。響應(yīng)面圖形是響應(yīng)值對(duì)各試驗(yàn)因子X(jué)1、X2、X3 所構(gòu)成的三維空間的曲面圖，從響應(yīng)面分析圖上形象地看出最佳參數(shù)及各參數(shù)之間的相互作用。當(dāng)特征值均為正值時(shí)，響應(yīng)面分析圖為山谷形曲面，有極小值存在；當(dāng)特征值為負(fù)值時(shí)，為山丘曲面，有極大值存在；當(dāng)特征值有正有負(fù)時(shí)，為馬鞍形曲面，無(wú)極值存在，下面是根據(jù)回歸方程作出不同因子的響應(yīng)面分析圖：圖6濃度與料液比對(duì)含量的響應(yīng)面圖Fig.6 Ethanol concentration and solid-liquid ratio on the content rate response surface maps圖7料液比與時(shí)間對(duì)含量的響應(yīng)面圖Fig.7 Solid-liquid ratio and time on the content rate response surface maps圖8濃度與時(shí)間對(duì)含量的響應(yīng)面圖Fig.8 Ethanol concentration and time on the content rate response surface maps等高線為響應(yīng)面圖在底面的投影，由上三圖知，其等高線均為橢圓，說(shuō)明三者彼此間交互效果顯著。由圖6可知乙醇濃度對(duì)苦丁茶多酚提取率影響比較大，表現(xiàn)為曲線較陡，料液比對(duì)苦丁茶多酚提取影響不是很大，表現(xiàn)為曲線較為平緩。當(dāng)乙醇濃度在0水平，即50%時(shí)，多酚提取含量最大，說(shuō)明過(guò)高過(guò)或過(guò)低的乙醇濃度均不適合苦丁茶多酚的提取。由圖7可知，料液比對(duì)苦丁茶多酚提取率影響比較小，而提取時(shí)間對(duì)苦丁茶多酚提取影響較大，且較短的時(shí)間更有利于提取。圖8進(jìn)一步說(shuō)明乙醇濃度對(duì)苦丁茶多酚提取率影響比較大，曲線較陡。2.4 驗(yàn)證試驗(yàn)通過(guò)實(shí)驗(yàn)輔助軟件Design Expert優(yōu)化提取條件得到理論的五組多酚含量在114.80mg/g，表明最佳實(shí)驗(yàn)參數(shù)的范圍為：乙醇濃度在51%53%；固液比在1:231:25；提取時(shí)間在60s64s。經(jīng)以上分析，再綜合實(shí)驗(yàn)的好操作性，選取乙醇濃度為50%、料液比為1:24、提取時(shí)間為62s，進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)。根據(jù)回歸方程，計(jì)算其預(yù)測(cè)值為114.4832mg/g。進(jìn)行3詞平行實(shí)驗(yàn)，得到平均結(jié)果為115.40mg/g，相對(duì)誤差為0.8%，證明響應(yīng)面優(yōu)化苦丁茶多酚的提取工藝是可行的。2.5 抗氧化活性的測(cè)定2.5.1 對(duì)DPPH自由基的清除結(jié)果及分析用不同濃度的多酚提取液，進(jìn)行DPPH自由基清除實(shí)驗(yàn)，結(jié)果如圖9： 圖9苦丁茶多酚對(duì)DPPH自由基清除作用Fig.9 Different concentrations of polyphenol extracts on DPPH radical scavenging effect由回歸方程得，苦丁茶多酚對(duì)DPPH自由基的半清除濃度為EC50=29.24mg/L。2.5.2 對(duì)OH自由基的清除結(jié)果及分析不同濃度的多酚提取液，進(jìn)行OH自由基清除實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖10：圖10苦丁茶多酚對(duì)OH自由基的清除作用Fig.10 Different concentrations of polyphenol extracts on OH radical scavenging effect由回歸方程得，苦丁茶多酚對(duì)OH自由基的半清除濃度為HC50=34.14mg/L。2.5.3 對(duì)O2自由基的清除結(jié)果及分析不同濃度的多酚提取液，進(jìn)行超氧陰離子自由基的清除實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖11：圖11苦丁茶多酚對(duì)O2自由基的清除作用Fig.11Different concentrations of polyphenol extracts on O2 radical scavenging effect由回歸方程計(jì)算得，苦丁茶多酚對(duì)O2自由基的半清除濃度為SC50=872.3mg/L。2.5.4對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制結(jié)果及分析不同濃度的多酚提取液，進(jìn)行脂質(zhì)過(guò)氧化抑制實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖12：圖12 苦丁茶多酚對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制作用Fig.12 Different concentrations of polyphenol extracts on lipid peroxidation inhibiting effect根據(jù)回歸方程計(jì)算得，苦丁茶多酚對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化的半抑制濃度為：IC50=11.48mg/L。3 結(jié)論3.1通過(guò)單因子試驗(yàn)，確定了苦丁茶多酚提取的最佳試驗(yàn)條件：溶劑為乙醇、乙醇濃度為50%、固液比為1:20、提取時(shí)間為60s、微波功率為291W。3.2通過(guò)Box-Behnken響應(yīng)曲面法試驗(yàn)，確定了苦丁茶多酚提取的最佳試驗(yàn)條件：乙醇濃度為62%、固液比為1：24、提取時(shí)間為62s。以該優(yōu)化條件在微波功率291W時(shí)提取苦丁茶多酚含量達(dá)到115.40mg/g。3.3進(jìn)行抗氧化實(shí)驗(yàn)可知其對(duì)DPPH自由基、OH自由基、O2自由基的清除能力以及對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制能力都隨苦丁茶多酚濃度呈線性增加，其對(duì)DPPH自由基、對(duì)OH自由基、對(duì)O2自由基的半清除濃度分別為： 29.24mg/L、 34.14mg/L、 872.3mg/L，對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化的半抑制濃度為11.48mg/L。參考文獻(xiàn)：1 劉宗岸.冬青屬苦丁茶的保健功效及利J.熱帶農(nóng)業(yè)科技,2009,32(2):26-28.2 Lv Ping,Huang Qiang. Study on In vitro Bacteriostasis of the Different Extract from Ilex Kudingcha CJTsengJ.Agricultural Science & Technlogy,2009,10(6):125-127.3 王新,