脫氫酶的測(cè)定.doc

活性污泥脫氫酶活性的測(cè)定1 目的和原理 有機(jī)物在生物處理構(gòu)筑物中的分解，是在酶的參與下實(shí)現(xiàn)的，在這些酶中脫氫酶占有重要的地位，因?yàn)橛袡C(jī)物在生物體內(nèi)的氧化往往是通過(guò)脫氫來(lái)進(jìn)行的?；钚晕勰嘀忻摎涿傅幕钚耘c水中營(yíng)養(yǎng)物濃度成正比，在處理污水過(guò)程中，活性污泥脫氨酶活性的降低，直接說(shuō)明了污水中可利用物質(zhì)營(yíng)養(yǎng)濃度的降低。此外，由于酶是一類蛋白質(zhì)，對(duì)毒物的作用非常敏感，當(dāng)污水中有毒物存在時(shí)，會(huì)使酶失活，造成污泥活性下降。在生產(chǎn)實(shí)踐中，我們常常在設(shè)置對(duì)照組，消除營(yíng)養(yǎng)物濃度變化影響因素的條件下，通過(guò)測(cè)定活性污泥在不同工業(yè)廢水中脫氫酶活性的變化情況來(lái)評(píng)價(jià)工業(yè)廢水成分的毒性，評(píng)價(jià)對(duì)不同工業(yè)廢水的生物可降解性。 脫氫酶是一類氧化還原酶，它的作用是催化氫從被氧化的物體（基質(zhì)AH）中轉(zhuǎn)移到另一個(gè)物體（受氫體B）上：為了定量地測(cè)定脫氫酶的活性，常通過(guò)指示劑的還原變色速度，來(lái)確定脫氫過(guò)程的強(qiáng)度。常用的指示劑有2,3,5三苯基四氮唑氯化物（TTC）或亞甲藍(lán)，它們?cè)趶难趸癄顟B(tài)接受脫氫酶活化的氫而被還原時(shí)具有穩(wěn)定的顏色，我們即可通過(guò)比色的方法，測(cè)量反應(yīng)后顏色深度，來(lái)推測(cè)脫氫酶的活性。例如： TTC（無(wú)色） TF（紅色）2 材料與器皿 （1）72型分光光度計(jì)、超級(jí)恒溫器、離心機(jī)（4000轉(zhuǎn)分）、15毫升離心管、移液管、黑布罩 （2）試劑： TrisHCl緩沖液（0.05M）：稱取三羥甲基氨基甲烷6.037克，加1.0MHCl 20毫升，蒸餾水定容至1L，pH為8.4。（備注M指mol/L） 氯化三苯基四氮唑（TTC）（0.4）：稱取0.4克TTC溶于100毫升蒸餾水中，即成0.4的TTC溶液（每周新配）。 亞硫酸鈉（0.36）：稱0.3657克亞硫酸鈉溶于100毫升蒸餾水中。 丙酮、甲醛（分析純）。 10%硫化鈉：稱取10克硫化鈉（分析純），定容至100mL棕色容量瓶中. 0.1molL葡葡萄糖溶液：稱取198179葡萄糖(分析純)溶于100mL蒸餾水。3 方法與步驟（1）標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 配制1mg/毫升TTC溶液：稱取50.0mgTTC，置于50毫升容量瓶中，以蒸餾水定容至刻度 配制不同濃度TTC液：從1mg/毫升TTC液中分別吸取1、2、3、4、5、6、7毫升放入每個(gè)容積為50毫升的一組容量瓶中，以蒸餾水定容至50毫升，各瓶中TTC濃度分別為20、40、60、80、100、120、140g/毫升。 每只帶塞離心管內(nèi)加入Tris-HCl緩沖液2毫升2毫升蒸餾水1毫升TTC液（從低到高濃度依次加入）；對(duì)照管加入2毫升Tris-HCl緩沖液+3毫升蒸餾水，不加入TTC，所得每只離心管TTC含量分別為20、40、60、80、100、120、140g。 每管各加入1mL的10%硫化鈉溶液，混合置于暗處20min，使TTC全部還原，生成紅色的TF。 在各管加入5毫升丙酮（或正丁醇和甲醇），抽提TF。 放入37恒溫振蕩萃取10min。 在4000轉(zhuǎn)/分下，離心10分鐘。 在721型分光光度計(jì)上，于485nm波長(zhǎng)下測(cè)光密度。 測(cè)繪標(biāo)準(zhǔn)曲線。 將標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定時(shí)的數(shù)值填入表58中。表58 標(biāo)準(zhǔn)曲線OD實(shí)測(cè)值TTC（g）OD值123420406080100120140備注：根據(jù)上表數(shù)據(jù)以TTC為橫座標(biāo)，OD值為縱座標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。（2）活性污泥脫氫酶活性的測(cè)定 活性污泥懸浮液的制備： 取活性污泥混合液50毫升玻璃珠振蕩破碎后，在在4000轉(zhuǎn)/分下，離心5分鐘棄去上清液，蒸餾水補(bǔ)足，充分?jǐn)嚢柘礈旌?，再次離心棄去上清液；如此反復(fù)洗滌三次后再以蒸餾水稀釋至原來(lái)體積備用。 在三組（每組三支）帶有塞的離心管內(nèi)分別加入以下材料與試劑（如表57所示）。 樣品試管搖勻后，立即放入37恒溫水浴振蕩儀內(nèi)，培養(yǎng)2h。 取出加入0.5mL甲醛終止反應(yīng)。 在對(duì)照管與樣品管中各加入丙酮5毫升，充分搖勻，放入37恒溫振蕩萃取10min。 在4000轉(zhuǎn)/分下，離心10分鐘。 取上清夜在485納米波長(zhǎng)下比色，光密度OD讀數(shù)應(yīng)在0.8以下，如色度過(guò)濃應(yīng)以丙酮稀釋后再比色。 標(biāo)準(zhǔn)曲線上查TF的產(chǎn)生值，并算得脫氫酶的活性。表57 脫氫酶活性測(cè)定中各組試劑加量組別活性污泥懸浮液（毫升）Tris-HCl緩沖液（毫升）Na2SO3液（毫升）0.1葡萄糖（毫升）0.4%TTC液（毫升）蒸餾水（毫升）21.50.50.50.521.50.50.50.521.50.51.04 結(jié)果與分析（1）活性污泥脫氫酶活性的測(cè)定 將樣品組的OD值（平均值）減去對(duì)照組OD值后，在標(biāo)準(zhǔn)曲線上查TF的產(chǎn)生值。 算得樣品組（加基質(zhì)與不加基