病毒的純化與保存

病毒的純化和保存 病毒純化目的 了解 為了了解病毒的結(jié)構(gòu) 傳染與免疫 遺傳與變異等性質(zhì) 常常需要高純度的病毒 病毒純化原理 熟悉 利用物理或化學的方法盡可能地去除宿主細胞中的組分 將病毒從其宿主細胞內(nèi)提純出來 在純化過程中保持病毒的生物活性和感染性 病毒純化的一般原則 熟悉 1 釋放病毒到胞外1 1容易釋放病毒 培養(yǎng)液 尿囊液 1 2不容易釋放病毒 細胞破碎 2 去除細胞碎塊低速離心 以2000 6000r min離心30 40分鐘 可除去90 以上的細胞碎片和雜質(zhì)3 病毒懸液濃縮 細胞破碎方法 熟悉 超聲破碎 密集的小氣泡迅速炸裂 破壞細胞高壓勻漿 機械切割力高速珠磨 玻璃小珠 石英砂 氧化鋁等研磨劑酶溶法 溶菌酶 蛋白酶 葡聚糖酶化學滲透 滲透壓改變使細胞破裂反復凍融 形成冰晶 使細胞膨脹破裂 病毒純化方法聚乙二醇 PEG 濃縮法 PEG是環(huán)氧乙烷和水縮合而成的水溶性非離子聚合物 無毒 無刺激性 平均分子量不同 性質(zhì)也有差異 分子量200 600者常溫下是無色無臭粘稠液體 分子量在600以上者就逐漸變?yōu)榘牍腆w狀 蠟狀固體 隨著分子量的增大 其吸濕能力相應(yīng)降低 不同分子量PEG性質(zhì)比較 聚乙二醇 PEG 濃縮法 掌握 分子量2000 6000的PEG用于病毒濃縮PEG可使病毒顆粒形成多聚體 較低離心力即可沉淀 1 直接加入法病毒懸液量少時候使用此法 病毒懸液中加入8 10 的PEG 聚乙二醇 PEG 濃縮法 掌握 2 液體濃縮法 聚乙二醇 PEG 濃縮法 掌握 3 固體濃縮法將PEG固體覆蓋于裝有病毒懸液的透析袋上 進行濃縮 透析袋孔徑大小 超過濾法 熟悉 原理 利用超濾膜將水 鹽及小分子濾過 將大分子或病毒等顆粒截留 超濾膜孔徑要比病毒顆粒小只能去除比病毒小的細胞碎塊 吸附法 熟悉 原理 病毒顆粒表面離子與吸附劑有親和性 病毒吸附之后 使用適當?shù)臈l件將病毒洗脫下來 吸附劑必須具備的特點 較大的表面積和吸附能力 較高的吸附選擇性 便于洗脫 性質(zhì)穩(wěn)定 凝膠吸附法 磷酸鈣凝膠 常用的凝膠 由0 5mol LCaCl2和0 5mol LNa2HPO4溶液混合制備凝膠狀沉淀物 用0 001mol L磷酸鹽緩沖液懸浮 置于4 4 5天 使之充分沉淀后應(yīng)用 凝膠吸附法 氫氧化鋅凝膠 是由7mol L氨水與0 1mol L醋酸鋅溶液滴加混合 pH8 5 制備 在制備后數(shù)小時內(nèi)較穩(wěn)定 方法 將水泡性口炎病毒懸液與氫氧化鋅凝膠混合 使它們形成復合體后沉淀 然后用0 08mol LEDTA pH8 5 解離回收病毒 凝膠吸附法 焦磷酸鎂凝膠 是由0 1mol L焦磷酸鈉和0 1mol LMgCl2 以2 10 體積 比例在室溫中緩慢滴加混合而獲得的較穩(wěn)定的焦磷酸鎂凝膠 將牛痘病毒懸液同此凝膠混合 使病毒吸附于凝膠 然后用0 1mol L鹽水洗2次 最后用0 3mol L枸櫞酸鈉溶液解離病毒 將病毒較好地回收于水相中 紅細胞吸附法 熟悉 用于某些與紅細胞吸附的病毒的濃縮選擇適宜的動物紅細胞 雞紅細胞基本步驟 1 1 3 的紅細胞與病毒懸液混合 2吸附1h以上 2 1000r min離心10分鐘 沉淀吸附病毒的紅細胞 棄上清 生理鹽水洗滌2次 3 用1 50原體積的磷酸緩沖液重懸紅細胞沉淀 在37保溫2 3h 4 1000r min離心10分鐘 上清即是濃縮的病毒懸液 葡聚糖柱層析法 熟悉 葡聚糖凝膠是指由葡聚糖與其它交聯(lián)劑交聯(lián)而成的凝膠 最常見的是Sephadex系列 主要型號是G 10 G 200 后面的數(shù)字是凝膠的吸水率 單位是mL g干膠 乘以10 如SephadexG 50 表示吸水率是5mL g干膠 葡聚糖柱層析法 熟悉 Sephadex的親水性很好 在水中極易膨脹 不同型號的Sephadex的吸水率不同 它們的孔穴大小和分離范圍也不同 數(shù)字越大的 排阻極限越大 分離范圍也越大 G 25分離范圍1000 5000適用于脫鹽 肽與其它小分子的分離 G 200分離范圍5000 600000適用于蛋白分離純化 分子量測定 平衡常數(shù)測定 葡聚糖柱層析法 將初步濃縮的材料 通過葡聚糖G150或G200柱層析 然后用0 02 0 15mol L磷酸鹽緩沖液 pH7 6 洗脫 分部收集 測定280nm波長處的OD值 滴定各部分的效價 將含病毒的各部分相混合 再濃縮 透析之后 即可得到比較純的病毒 Nagano 1989年 用Sephacryls 1000柱層析純化了雞傳染性支氣管炎病毒 葡聚糖柱層析法 差速離心法 掌握 原理 不同大小和比重的粒子有不同的沉降速度適合分離沉降速度差別較大的粒子適用于從組織培養(yǎng)液 雞胚尿囊液或經(jīng)過紅細胞吸附 釋放的病毒懸液中提純病毒 優(yōu)點 能迅速處理大量樣品 作為病毒提純精制的第一步 常用方法 熟悉 以低速 2000 3000r min 及中速 10000r min 離心20 30分鐘去除較大的宿主細胞碎片 污染的細菌及其它較大的雜質(zhì) 再選擇較高速度離心1 2h使病毒沉淀 差速離心法 密度梯度離心 原理 將樣品加在惰性密度梯度介質(zhì)上進行超速離心 在一定的離心力下把樣品顆粒分配到密度梯度介質(zhì)中相等密度層中 吸出目的顆粒所在的介質(zhì)層 從而達到分離純化的目的 常用的介質(zhì)為氯化銫CsCl 蔗糖 10 40 蔗糖密度梯度制備 首先配置好不同百分比 w v 的蔗糖溶液 然后在離心管中先加入濃度最小 10 的溶液 然后用吸管加入濃度稍大的溶液 注意 加時吸管要插入離心管的底部 緩慢加入 務(wù)求界面分明 然后按上法依次分層加入其余各濃度的蔗糖溶液 即可配成蔗糖梯度液 將事先用更低密度蔗糖溶液 小于10 懸浮的樣品輕輕加入10 蔗糖溶液的表面 進行密度梯度離心即可 梯度混合儀 等密度梯度離心 掌握 原理 與密度梯度法相同 但不制備梯度介質(zhì) 而是在樣品中加入CsCl 離心過程中CsCl隨離心力而下沉 形成連續(xù)密度梯度 樣品中顆粒隨其密度大小而下沉或上浮到相等密度梯層中 每毫升病毒懸液加1g的CsCl 混勻 40000g離心24 36h 病毒蛋白的分離SDS PAGE PAGE 聚丙烯酰胺凝膠電泳Poly AcrylamideGelElectrophoresis以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種常用電泳技術(shù) PAGE 聚丙烯酰胺凝膠電泳 聚丙烯酰胺凝膠由單體丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺聚合而成 聚合過程由自由基催化完成 催化聚合的常用方法 化學聚合法 化學聚合以過硫酸銨 APS 為催化劑 以四甲基乙二胺 TEMED 為加速劑 在聚合過程中 TEMED催化過硫酸銨產(chǎn)生自由基 后者引發(fā)丙烯酰胺單體聚合 同時甲叉雙丙烯酰胺與丙烯酰胺鏈間產(chǎn)生甲叉鍵交聯(lián) 從而形成三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu) 連續(xù)與不連續(xù)PAGE PAGE按照緩沖液的pH值和凝膠孔徑的差異及有無濃縮效應(yīng)分為連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)兩大類 連續(xù)系統(tǒng)電泳體系中緩沖液pH值及凝膠濃度相同 帶電顆粒在電場作用下 主要靠電荷和分子篩效應(yīng) 不連續(xù)PAGE 不連續(xù)聚丙烯酰胺凝膠電泳是指使用不同孔徑和不同緩沖系統(tǒng)的電泳 它由濃縮膠和分離膠兩部分所組成 由于濃縮膠的堆積 濃縮 作用 可使樣品在濃縮膠和分離膠的界面上先濃縮成一窄帶 然后在一定濃度的凝膠上進行分離 樣品顆粒在電場中泳動不僅有電荷效應(yīng) 分子篩效應(yīng) 還具有濃縮效應(yīng) 因而其分離條帶清晰度及分辨率均較連續(xù)電泳系統(tǒng)佳 SDS PAGE SDS 十二烷基磺酸鈉 重點 SDS是陰離子去垢劑 使蛋白質(zhì)變性解聚 并與蛋白質(zhì)結(jié)合成帶強負電荷的復合物 掩蓋了蛋白質(zhì)之間原有電荷的差異 使各種蛋白質(zhì)的電荷 質(zhì)量比值都相同 因而在聚丙烯酰胺凝膠中電泳時遷移率主要取決于蛋白質(zhì)分子大小 SDS PAGE 也稱變性PAGE通常采用不連續(xù)垂直型系統(tǒng)濃縮膠 分離膠 濃縮膠 分離膠 首次應(yīng)用SDS PAGE的論文 了解 LaemmliUK 1970 CleavageofstructuralproteinsduringtheassemblyoftheheadofbacteriophageT4 Nature227 680 685 SDS PAGE實驗步驟 熟悉 1 清洗 烘干 組裝電泳器材 SDS PAGE實驗步驟2 1 瓊脂封底 SDS PAGE實驗步驟3 配制分離膠 SDS PAGE實驗步驟4 灌注分離膠 灌注完后 加水覆蓋隔絕空氣 同時可使界面平整 一般20 30分鐘凝固 SDS PAGE實驗步驟5 配制 灌注濃縮膠 插上梳子 SDS PAGE實驗步驟5 往電泳槽加電泳緩沖液 上樣 2 上樣緩沖液 樣品溶解液LoadingBuffer SDS 琉基乙醇 甘油 溴酚藍 Tris HCl緩沖溶液 蛋白樣品與上樣緩沖液1 1混合 沸水浴3分鐘 離心 上樣其中一個上樣孔 蛋白分子量標準 電泳緩沖液 電極緩沖液 包含SDS一般配制成10 或5 SDS PAGE實驗步驟6 連接電源 電泳開始 SDS PAGE實驗步驟7 電泳結(jié)束 剝膠 染色 脫色 染色液 考馬斯亮藍 銀染法用硝酸銀脫色液 甲醇 異丙醇 醋酸 按下式計算相對遷移率 每個蛋白標準的分子量對數(shù)對它的相對遷移率作圖得標準曲線 量出未知蛋白的遷移率即可測出其分子量 這樣的標難曲線只對同一塊凝膠上的樣品的分子量測定才具有可靠性 8 蛋白相對分子質(zhì)量測定 重點 當?shù)鞍踪|(zhì)的分子量在15 000 200 000之間時 樣品的遷移率與其分子量的對數(shù)呈線性關(guān)系 符合如下方程式 LgMW b mR K其中 MW為蛋白質(zhì)的分子量 mR為相對遷移率 b為斜率 K為截距 當條件一定時 b與K均為常數(shù)因此通過已知分子量的蛋白與未知蛋白的比較 就可以得出未知蛋白的分子量 SDS PAGE實驗步驟8 蛋白相對分子質(zhì)量測定 注意的問題 蛋白質(zhì)電泳常用的SDS PAGE 單一亞基組成的蛋白質(zhì)非變性PAGE 多個不同亞基組成的蛋白質(zhì) 未聚合的聚丙烯酰胺具有神經(jīng)毒性 操作時要戴手套 WesternBlot蛋白質(zhì)鑒定 SouthernBlot DNANorthernBlot RNAWesternBlot 單向電泳后的蛋白質(zhì)印跡EasternBlot 雙向電泳后的蛋白質(zhì)印跡 EdwinMellorSouthern WesternBlot蛋白質(zhì)鑒定 原理 重點掌握 將SDS PAGE上的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到硝酸纖維素膜上 讓第一抗體與膜上的目的蛋白質(zhì)的抗原決定簇結(jié)合 然后用經(jīng)過特定酶標記的第二抗體結(jié)合第一抗體 加入酶的顯色底物即可檢測的目的蛋白條帶存在與否 WesternBlot步驟 熟悉 1 SDS PAGE電泳結(jié)束后 不染色 進行轉(zhuǎn)膜 把SDS PAGE凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到NC膜或PVDF膜上 注意凝膠和膜的放置方向 WesternBlot步驟 2 膜的染色 麗春紅 氨基黑 判斷凝膠上的蛋白是否已經(jīng)轉(zhuǎn)移到膜上 記錄蛋白分子量標準 樣品的位置 WesternBlot步驟 3 磷酸緩沖液漂洗 進行膜的脫色4 膜的封閉封閉是用高濃度的無關(guān)蛋白質(zhì)封閉膜上未被占據(jù)的表面 使抗體僅僅只能跟特異的蛋白質(zhì)結(jié)合而不是和膜結(jié)合 常用的封閉液有牛血清白蛋白BSA 脫脂奶粉等 一般用脫脂奶粉 將膜浸沒于封閉液中緩慢搖蕩一小時 WesternBlot步驟 5 結(jié)合一抗 與目的蛋白結(jié)合 將膜轉(zhuǎn)移到含一抗的封閉液中 室溫下輕搖孵育一小時 緩沖液洗滌三次6 一抗與二抗結(jié)合二抗是一抗的抗體如果一抗是通過免疫兔子制備 即選擇抗兔的二抗 如羊抗兔 鼠抗兔等 緩沖液洗滌三次 WesternBlot步驟 7 顯色 1 生物素 親合素系統(tǒng)生物素 biotin 標記二抗 生物素容易與親和素 avidin 結(jié)合 而親和素事先已進行酶標記 如過氧化物酶 則形成生物素 親和素 過氧化物酶復合物加入底物 即可顯色 WesternBlot步驟 7 顯色 2 辣根過氧化物酶 HorseradishPeroxidase HRP HRP經(jīng)過碘酸鈉氧化而標記到二抗 顯色底物 二氨基聯(lián)苯胺 DAB 氯萘酚和氨乙基咔唑等 病毒的保存 掌握 1 低溫及超低溫保存法低溫 20 60 超低溫 70 以下 冰箱液氮罐 150 196 溫度越低 保存時間越長 常用保護劑 脫脂牛奶 5 蔗糖 血清用保護劑配制病毒懸液或與病毒懸液混合 病毒的保存 2 冷凍干燥保存原理 微生物懸液冷凍后 在真空中使水分由固體直接升華為氣體 在低溫 干燥和缺氧環(huán)境下 微生物的生長和代謝暫時停止 因此保存期較長 便于運輸 病毒的保存 2 冷凍干燥保存保護劑 脫脂牛奶或血清保護劑作用原理 在冷凍干燥的脫水過程中穩(wěn)定病毒結(jié)構(gòu) 防止病毒受冷凍或干燥而造成損傷 2 冷凍干燥保存步驟 1 準備安瓿管 高壓滅菌后備用 2 冷凍干燥保存步驟 2 制備保護劑 脫脂牛奶取市售新鮮 清潔 無抗生素污染的牛奶20