《肽的人工合成》PPT課件.ppt

第六章肽的人工合成 前言 20世紀初 fischer創(chuàng)立蛋白質(zhì)的多肽結(jié)構(gòu)學說1932年 Bergmann采用芐氧羰酰基作為氨基保護基同時期Curtius創(chuàng)立酰氯法 疊氮法活化羧基的肽鍵生成法50年代初 Wieland等發(fā)展了活化酯法和混合酸酐法1953年 Vigneaud首次化學合成了多肽激素催產(chǎn)素1963年 Schwyzer合成24aa的促腎上腺皮質(zhì)激素 ACTH 1965年 我國合成51aa的牛胰島素1979年 矢島治明液相法合成牛胰RNaseA 124aa 80年代 Merrifield提出固相合成法 多肽合成儀不斷發(fā)展 第一節(jié)肽化學合成原理和液相合成 基本步驟 1 氨基和 羧基以及側(cè)鏈的保護2 羧基的活化和肽鍵的形成3 脫除保護基和純化Z2Z1Z2Z1XNHCHCOOH H2NCHCOOY H2OXNHCHCO NHCHCOOYZ3Z2Z1脫保護XNHCHCOOH H2NCHCO NHCHCOOYZ3Z2Z1縮合XNHCHCO NHCHCO NHCHCOOY保護基全脫除三肽 一氨基酸保護基 為了使肽鍵生成反應能夠定向進行 需要對氨基酸的各種官能團進行保護 一 氨基保護基 常用 烷氧羰基 ?；屯榛?二 羧基保護基 保護基種類相對較少 羧基保護基種類 鹽 鉀鹽 鈉鹽 三乙胺鹽 三丁胺鹽等鹽是對羧基的臨時性保護 酯 甲酯和乙酯 芐酯 叔丁酯 最常用 三 側(cè)鏈的保護 20種aa中有13種側(cè)鏈需要保護Lys NH2和側(cè)鏈羧基 選擇與 氨基和羧基不同的保護基Cys SH 甲基芐基 對氧芐基等 三氟乙酸鉈 TFA脫除 羥基aa Ser Thr Tyr 芐基 叔丁基酰胺基保護 2 4 6 三甲氧芐基等 可用TFA脫除 二肽鍵生成法 基本思路 使 羧基活化為RCOX形式 加強羰基碳原子的正電性 便于 氨基進行親和攻擊而成肽 一 活化酯法 方法 采用巰基 烷基 酚基和N 羥胺類物質(zhì) 最常用 N N 二環(huán)乙基碳二亞胺 DCC 與N 保護aa作用 使 羧基活化為酯的形式 然后進行成肽反應 優(yōu)點 中間產(chǎn)物可以分離 結(jié)晶 保存 便于去除副產(chǎn)物氨基組分的末端羧基可以不保護對酰胺基活化特別有效 二 縮合劑法 重要的縮合劑 DCC DIC 二異丙基DCC 等DCC接肽反應機理 三 疊氮法 是最古老的經(jīng)典肽鍵生成法 1902年 該法最少引起消旋OOOR C OCH3H2NNH2R C NHNH2R NO2R C N3 ?；被狨ｋ??；被岑B氮 OH2N R R C NH R 堿 HN3堿 四 混合酸酐法 50年代提出 簡單 反應快 純度好 尤其適合小肽合成R1R1Z NH CH COOH叔胺 Et3N Z NH CH COO Et3 NHR1OORO COClZ NH CH C O C ORH2N R2成肽 存在副反應 三脫保護基及純化 一 TFA法 方法 將產(chǎn)物置于三氟乙酸 TFA 中處理 以脫除保護基優(yōu)點 用于脫除一些不耐酸的保護基 溫和 副反應少 尤其適合于固相合成法 曾用于胰高血糖素合成 缺點 TFA用量較大 需保護的氨基酸種類較多等 二 HF法 方法 以無水氟化氫 HF 在0 20 C處理30 60min優(yōu)點 可脫除其他方法難以脫除的保護基 比TFA法有效缺點 HF腐蝕性強 脫除時副反應較多 三 含硅試劑法 有機磺酸法等 四二硫鍵的生成 是蛋白質(zhì)合成中最困難的工作經(jīng)典方法 空氣氧化法 碘氧化法 收率低 副反應嚴重目前 三氟乙酸鉈 CF3COO 3Tl 法 可先裂解Cys的各種保護基 然后金屬鉈作為弱氧化劑催化二硫鍵的生成 效率是碘氧化法的2倍 亞砜介導法 sulfoxid directed Cys亞砜和CysR 在酸處理下 生成的SH作用于亞砜的S原子 在亞砜位置處生成二硫鍵 用不同的Cys亞砜和酸處理 可在需要的位置定點生成二硫鍵 五合成肽的純化和純度鑒定 純化 凝膠過濾 離子交換層析 反向HPLC等鑒定 薄層層析 等電點聚焦 分析HPLC 質(zhì)譜法等 六肽的液相法合成策略與示例 小肽合成 逐步延長法 stepwiseelongation 從C 端開始逐一合成 使肽鏈向N末端延長的方法大肽合成 片段縮合法 fragmentcondensation 先分段合成小肽再縮合成大肽段 縮合時常用不易消旋的疊氮法片段縮合法策略 劃分肽段 長度一般不超過10個aa殘基盡可能以不易消旋的Gly Pro等為肽的C 端aa和保護基性質(zhì)對肽段純化難異的影響構(gòu)象因素影響 選擇接肽順序 小片段分頭縮和 大片段 肽 有時很難或不能進行 小片段逐一縮合 反應步驟多但產(chǎn)率高 較大片段逐一縮合 常用 示例 牛胰RNaseA 124aa 的合成 將RNaseA分成長短不一30個片段 分別以逐步延長法合成從肽的C 端開始 用疊氮法小片段依次接肽 得到保護的RNaseA N 端為Z 芐氧?；?C 端 OBzl 芐氧基 Cys 對甲氧芐基 Mbzl 和Met亞砜的還原 得到還原型保護的RNaseA1mol L三氟甲磺酸 TFA脫保護 巰基乙醇 二硫蘇糖醇 過SephadexG 25層析柱 得到去保護基的RNaseA在谷胱苷肽存在下空氣氧化形成二硫鍵 SephadexG 25 得到合成的RNaseA粗品 活力18 9 經(jīng)過親和層析 產(chǎn)物活力81 3 CM 纖維素層析 得到離子交換層析純產(chǎn)物95 乙醇處理 得到牛胰RNaseA結(jié)晶 酶活力100 第二節(jié)固相肽合成 一 合成原理 1963年 Merrifield將aa的C 端固定在不溶性樹脂上 然后在其上依次進行氨基酸縮合 延長肽鏈 克服了液相合成法中每一步產(chǎn)物純化的困難 奠定了自動化肽合成的基礎 為此 Merrifield于1984年獲得Nobel化學獎固相法合成較之液相法簡單 快速 不需每步純化中間物固相法適合10 30aa的小肽 不流失但固相法合成肽的純度差 大肽或高純 大量小肽合成采用液相法 一 Boc固相法 經(jīng)典Merrifield法 因氨基保護基采用可用TFA脫除的Boc而得名 側(cè)鏈用芐醇類保護 樹脂為氯甲基化或羥甲基化聚苯乙烯 對乙酰氨基芐酯樹脂 方法 Boc NH CHR1 COO Cl CH2 樹脂 C 末端aa與樹脂結(jié)合 Boc NH CHR1 COO CH2 樹脂 用TFA法脫除N BocCF3COO NH3 CHR1 COO CH2 樹脂 三乙胺中和 洗滌NH2 CHR1 COO CH2 樹脂 在DCC存在下與Boc aa耦聯(lián) 洗滌Boc NH CHR2 CO NH CHR1 COO CH2 樹脂 脫保護 重復接肽Boc NH CHRn CO NH CHR1 COO CH2 樹脂 全部保護基脫除 HF法等目的肽 二 Fmoc固相合成法 Fmoc固相合成法的步驟與Boc固相合成法類似不同之處 氨基保護基為 可用堿 20 呱啶 脫除的芴甲氧羰基 Fmoc 側(cè)鏈保護基為 可以用TFA脫除的叔丁基樹脂 采用90 TFA可切斷的烷氧芐醇型或1 TFA可切斷的二烷氧芐醇型優(yōu)點 避免最終的強酸處理二 自動肽合成儀 1966年 Merrifield等報道了最初的自動肽合成儀一般以Boc或Fmoc固相合成法為基礎 將肽合成自動化監(jiān)測 Fmoc有明顯的紫外吸收 第三節(jié)酶促肽合成和半合成 一 基本原理 利用蛋白水解酶催化肽鍵的形成優(yōu)點 反應條件溫和 不引起aa消旋 不要求aa側(cè)鏈保護 副產(chǎn)物少 后處理較簡單1 酶促合成多肽的酶類 主要有四類 Ser蛋白水解酶 HS 蛋白水解酶 羧肽酶 金屬蛋白酶類2 對aa成分的選擇 為使反應向肽鍵生成方向進行 二酶合成反應的幾個系統(tǒng) 為了使反應定向進行 將參與反應的氨基組分的羧基端和羧基組分的氨基端保護為提高合成反應效率 防止二次水解 創(chuàng)建一些特定的反應系統(tǒng) 如 1 沉淀系統(tǒng) 降低產(chǎn)物溶解度 使其沉淀 防止水解如 Z Phe COOH Z Leu NH2 Z Phe Leu NH2在凝乳酶 200 mol L 催化下 PH7反應20hr 收率為70 80 隨反應進行溶液逐步變褐色 黏稠化 最終完全固化2 二相系統(tǒng) 將緩沖液與有機溶劑攪拌成乳濁液 二相系統(tǒng) 水相一般占2 5 底物和酶在水的懸滴中反應 但生成的產(chǎn)物為脂溶性的 隨著反應地進行 產(chǎn)物自動轉(zhuǎn)移至有機相中 不再與酶接觸 如 Z Glu COOH Ala ODPM Z Glu Ala ODPM 二苯甲酯 三酶促半合成 對于無保護的大肽段的之間的定向銜接 無法用化學法完成 但用蛋白水解酶的特異性可能取得成功如 以枯草桿菌蛋白酶為催化劑 把化學合成的RNAaseA小片段S 肽與天然水解大片段S 蛋白轉(zhuǎn)化成半合成RNAaseA取得成功酶促半合成胰島素 豬胰島素羧肽酶A去Ala胰島素胰蛋白酶切除B鏈Ala30在B30處接上叔丁氧基 Thr 酶促半合成人胰島素 產(chǎn)率90 小結(jié) 肽合