課題2　土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)

課題2土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離和計(jì)數(shù) 專題2微生物的培養(yǎng)和應(yīng)用 思考1 農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中 尿素被利用的特點(diǎn) 思考2 土壤中的細(xì)菌能利用尿素的原因及反應(yīng)式 思考3 學(xué)習(xí)本課題要達(dá)到哪兩個(gè)目的 一 課題背景 1 尿素的利用 2 細(xì)菌利用尿素的原因 3 本課題的目的 二 研究思路 思考6 什么是選擇培養(yǎng)基 美國(guó)黃石國(guó)家公園的一個(gè)熱泉 思考6 什么是選擇培養(yǎng)基 從物理性質(zhì)看此培養(yǎng)基屬于哪類 在此培養(yǎng)基中哪些作為碳源 氮源 這種培養(yǎng)基如何對(duì)分解尿素的細(xì)菌進(jìn)行選擇 篩選菌株 1 自然界篩選菌株 例子 原因 啟示 2 實(shí)驗(yàn)室篩選菌株 原理 方法 利用選擇培養(yǎng)基分離 選擇培養(yǎng)基的概念 分解尿素的細(xì)菌的選擇培養(yǎng)基的分析 A 屬于固體培養(yǎng)基 瓊脂是凝固劑 B 碳源 葡萄糖 唯一氮源 尿素C 培養(yǎng)基名稱 以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基 常見(jiàn)的一些選擇培養(yǎng)基 思考9 常見(jiàn)的微生物生長(zhǎng)計(jì)數(shù)的方法有哪兩種 常見(jiàn)的測(cè)定微生物數(shù)量的方法 顯微鏡直接計(jì)數(shù)法 先將待測(cè)樣品制成懸液 然后取一定量的懸液放在顯微鏡下進(jìn)行計(jì)數(shù) 根據(jù)在顯微鏡下觀察到的微生物數(shù)目來(lái)計(jì)算出單位體積內(nèi)的微生物總數(shù) 此法計(jì)得的是活菌體和死菌體的總和 故又稱為總菌計(jì)數(shù)法 顯微鏡直接計(jì)數(shù)是測(cè)定微生物的方法公式 觀察到的紅細(xì)胞平均數(shù) 觀察到的細(xì)菌平均數(shù) 紅細(xì)胞含量 細(xì)菌含量?jī)?yōu)點(diǎn) 設(shè)備簡(jiǎn)單 能觀察微生物的形態(tài)特征 缺點(diǎn) 難以計(jì)數(shù)微小的細(xì)菌 此法計(jì)得的是活菌體和死菌體的總和 故又稱為總菌計(jì)數(shù)法 一般用于純培養(yǎng)懸浮液中各種單細(xì)胞菌體的計(jì)數(shù) 間接計(jì)數(shù)法 最常用稀釋涂布平板計(jì)數(shù)法應(yīng)用 統(tǒng)計(jì)樣品中活菌的數(shù)目 原理 當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時(shí) 培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)的一個(gè)菌落 來(lái)源于樣品稀釋液中的一個(gè)活菌 通過(guò)統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù) 就能推測(cè)出樣品中大約含有多少活菌 從平板上的菌落數(shù)推測(cè)出每克樣品中的菌落數(shù)的計(jì)算方法是 平均菌落數(shù) 涂布的稀釋液體積 稀釋倍數(shù) 思考11 完成表格 比較兩種計(jì)數(shù)法的異同 思考14 請(qǐng)嘗試歸納總結(jié)出兩種計(jì)數(shù)法的注意事項(xiàng) 統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目 1 方法 2 稀釋涂布平板法 間接計(jì)數(shù)法 統(tǒng)計(jì)的是活菌數(shù) 原理 計(jì)算公式 注意事項(xiàng) 為了使結(jié)果接近真實(shí)值 要設(shè)置重復(fù)實(shí)驗(yàn) 求菌落的平均值 至少3個(gè)平板 成功的關(guān)鍵是恰當(dāng)?shù)南♂尪?3 顯微鏡直接計(jì)數(shù)法 統(tǒng)計(jì)的是總菌數(shù) 特點(diǎn) 4 兩種計(jì)數(shù)法的比較 顯微鏡 血細(xì)胞計(jì)數(shù)板 培養(yǎng)基 菌體本身 菌落數(shù) 方便 簡(jiǎn)單 計(jì)數(shù)的是活菌 死菌 活菌都在內(nèi) 復(fù)雜 有誤差 M C V 統(tǒng)計(jì)的是活菌體和死菌體的總和 故又稱為總菌計(jì)數(shù)法 難以計(jì)數(shù)微小的細(xì)菌 統(tǒng)計(jì)方法類似于 培養(yǎng)液中酵母菌種群數(shù)量的變化 思考15 設(shè)置對(duì)照組的目的是什么 思考16 分析書(shū)上案例 回答相關(guān)問(wèn)題 設(shè)置對(duì)照的主要目的是排除實(shí)驗(yàn)組中非測(cè)試因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響 提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度 對(duì)照實(shí)驗(yàn)的相關(guān)知識(shí) 常用設(shè)置對(duì)照的方法 空白對(duì)照 不給對(duì)照組任何處理因素 條件對(duì)照 給對(duì)照組施以部分實(shí)驗(yàn)因素 但不是所要研究的處理因素 自身對(duì)照 對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組都在同一研究對(duì)象上進(jìn)行 相互對(duì)照 不單設(shè)對(duì)照組 而是幾個(gè)實(shí)驗(yàn)組相互對(duì)照 對(duì)照實(shí)驗(yàn) 是指除了被測(cè)試的條件外 其他條件都相同的實(shí)驗(yàn) 實(shí)例 在做分解尿素的細(xì)菌的篩選與統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目的實(shí)驗(yàn)時(shí) A同學(xué)從對(duì)應(yīng)的106倍稀釋的培養(yǎng)基中篩選出大約150個(gè)菌落 但是其他同學(xué)在同樣的稀釋度下只選擇出大約50個(gè)菌落 分析其原因 原因 土樣不同 培養(yǎng)基污染或操作失誤 或者是混入了其他的含氮物質(zhì) 思考16 分析書(shū)上案例 回答相關(guān)問(wèn)題 思考 請(qǐng)嘗試分析A同學(xué)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果與其他組不同的原因 思考 請(qǐng)你通過(guò)設(shè)置對(duì)照 幫助A同學(xué)排除上述因素的影響 另一種方案 空白對(duì)照 將A同學(xué)配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下進(jìn)行培養(yǎng) 作為空白對(duì)照 以證明培養(yǎng)基是否受到污染 實(shí)驗(yàn)方案有兩種 一種方案 相互對(duì)照 可以由其他同學(xué)用與A同學(xué)一樣的土樣進(jìn)行實(shí)驗(yàn) 增加實(shí)驗(yàn)組數(shù) 如果結(jié)果與A同學(xué)一致 則證明A無(wú)誤 如果結(jié)果不同 則證明A同學(xué)存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問(wèn)題 小結(jié) 通過(guò)這個(gè)事例可以看出 實(shí)驗(yàn)結(jié)果要有說(shuō)服力 對(duì)照的設(shè)置是必不可少的 設(shè)置對(duì)照 1 目的 2 本實(shí)驗(yàn)的對(duì)照組設(shè)置 用與A同學(xué)相同的土壤進(jìn)行至少3次的重復(fù)實(shí)驗(yàn) 用與A同學(xué)相同的培養(yǎng)基不接種作為空白對(duì)照進(jìn)行實(shí)驗(yàn) 思考17 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的內(nèi)容包括哪些 思考18 結(jié)合書(shū)上圖2 7 你能說(shuō)出該實(shí)驗(yàn)的流程嗎 思考19 你能歸納總結(jié)出該實(shí)驗(yàn)操作的哪些注意事項(xiàng) 操作流程 二 實(shí)驗(yàn)的具體操作 土壤取樣從肥沃 濕潤(rùn)的土壤中取樣 先鏟去表層土3cm左右 再取樣 將樣品裝入事先準(zhǔn)備好的信封中 取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的的信封在使用前都要滅菌 制備培養(yǎng)基 制備以尿素為唯一氮源的選擇培養(yǎng)基 應(yīng)在火焰旁稱取土壤10g 在稀釋土壤溶液的過(guò)程中 每一步都要在火焰旁進(jìn)行 分離不同的微生物采用不同的稀釋度原因 不同微生物在土壤中含量不同目的 保證獲得菌落數(shù)在30 300之間 適于計(jì)數(shù)的平板 三 樣品的稀釋 為什么分離不同的微生物要采用不同的稀釋度 測(cè)定土壤中細(xì)菌的總量和測(cè)定土壤中能分解尿素的細(xì)菌的數(shù)量 選用的稀釋范圍相同嗎 原因 土壤中各類微生物的數(shù)量 單位 株 kg 是不同的 例如在干旱土壤中的上層樣本中 好氧及兼性厭氧細(xì)菌數(shù)約為2185萬(wàn) 放線菌數(shù)約為477萬(wàn) 霉菌數(shù)約為23 1萬(wàn) 結(jié)論 為獲得不同類型的微生物 就需要按不同的稀釋度進(jìn)行分離 同時(shí)還應(yīng)當(dāng)有針對(duì)性地提供選擇培養(yǎng)的條件 取樣涂布 實(shí)驗(yàn)時(shí)要對(duì)培養(yǎng)皿作好標(biāo)記 注明培養(yǎng)基類型 培養(yǎng)時(shí)間 稀釋度 培養(yǎng)物等 如果得到了2個(gè)或2個(gè)以上菌落數(shù)目在30 300的平板 則說(shuō)明稀釋操作比較成功 并能夠進(jìn)行菌落的計(jì)數(shù) 如果同一稀釋倍數(shù)的三個(gè)重復(fù)的菌落數(shù)相差較大 表明試驗(yàn)不精確 需要重新實(shí)驗(yàn) 微生物的培養(yǎng)與觀察 在菌落計(jì)數(shù)時(shí) 每隔24h統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目 選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)的記錄作為結(jié)果 以防止因培養(yǎng)時(shí)間不足而導(dǎo)致遺漏菌落的數(shù)目 培養(yǎng)不同微生物往往需要不同培養(yǎng)溫度 細(xì)菌 30 37 培養(yǎng)1 2d放線菌 25 28 培養(yǎng)5 7d霉菌 25 28 的溫度下培養(yǎng)3 4d 計(jì)數(shù) 微生物的培養(yǎng)與觀察 菌落的特征 思考17 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的內(nèi)容包括哪些 思考18 結(jié)合書(shū)上圖2 7 你能說(shuō)出該實(shí)驗(yàn)的流程嗎 思考19 你能歸納總結(jié)出該實(shí)驗(yàn)操作的哪些注意事項(xiàng) 三 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 1 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的內(nèi)容 2 實(shí)驗(yàn)流程 3 具體操作過(guò)程 四 操作提示 無(wú)菌操作 1 2 3 4 做好標(biāo)記 制定計(jì)劃 注意事項(xiàng) 1 樣品稀釋液的最佳濃度為保證每個(gè)平板有30 300個(gè)菌落 3 每一個(gè)稀釋度至少要涂布3個(gè)平板作為重復(fù)實(shí)驗(yàn) 5 菌落的特征 4 為了排除培養(yǎng)基本身的影響 應(yīng)設(shè)置相同培養(yǎng)基未接種進(jìn)行空白對(duì)照 自主學(xué)習(xí)6 閱讀教材P25 26頁(yè)剩余內(nèi)容 完成下列思考 思考20 如何判斷有無(wú)雜菌污染 思考21 如何判斷選擇培養(yǎng)基是否起到了選擇作用 思考