《酶工程》期末復(fù)習(xí)題整理.doc

第一章1.酶工程：是生物工程的重要組成部分，是隨著酶學(xué)研究迅速發(fā)展，特別是酶的推廣應(yīng)用，使酶學(xué)和工程學(xué)相互滲透、結(jié)合、發(fā)展而成的一門新的技術(shù)科學(xué)，是酶學(xué)、微生物學(xué)的基本原理與化學(xué)工程有機(jī)結(jié)合而產(chǎn)生的邊緣科學(xué)技術(shù)。2.化學(xué)酶工程：指自然酶、化學(xué)修飾酶、固定化酶及化學(xué)人工酶的研究和應(yīng)用3.生物酶工程：是酶學(xué)和以基因重組技術(shù)為主的現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)結(jié)合的產(chǎn)物， 亦稱高級酶工程。4.酶工程的組成部分？答：酶工程主要指自然酶和工程酶（經(jīng)化學(xué)修飾、基因工程、蛋白質(zhì)工程改造的酶）在國民經(jīng)濟(jì)各個領(lǐng)域中的應(yīng)用。內(nèi)容包括：酶的產(chǎn)生；酶的分離純化；酶的改造；生物反應(yīng)器。5.酶的結(jié)構(gòu)特點？答：雖然少數(shù)有催化活性的RNA分子已經(jīng)鑒定，但幾乎所有的酶都是蛋白質(zhì)，因而酶必然具有蛋白質(zhì)四級結(jié)構(gòu)形式。其中一級結(jié)構(gòu)是指具有一定氨基酸順序的多肽鏈的共價骨架；二級結(jié)構(gòu)為在一級結(jié)構(gòu)中相近的氨基酸殘基間由氫鍵的相互作用而形成的帶有螺旋、折疊、轉(zhuǎn)角、卷曲等細(xì)微結(jié)構(gòu)；三級結(jié)構(gòu)系在二級結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)上進(jìn)一步進(jìn)行分子盤區(qū)以形成包括主側(cè)鏈的專一性三維排列；四級結(jié)構(gòu)是指低聚蛋白中各折疊多肽鏈在空間的專一性三維排列。具有低聚蛋白結(jié)構(gòu)的酶（寡聚酶）必須具有正確的四級結(jié)構(gòu)才有活性。具有活性的酶都是球蛋白，即被廣泛折疊、結(jié)構(gòu)緊密的多肽鏈，其氨基酸親水基團(tuán)在外表，而疏水基團(tuán)向內(nèi)。6.酶活性中心：是酶結(jié)合底物和將底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物的區(qū)域，通常是整個酶分子中相當(dāng)小的一部分，它是由在線性多肽鏈中可能相隔很遠(yuǎn)的氨基酸殘基形成的三維實體。7.酶作用機(jī)制有哪幾種學(xué)說？答：鎖和鑰匙模型、誘導(dǎo)契合模型8.酶催化活力的影響因素？答：底物濃度、酶濃度、溫度、pH等。9.酶的分離純化的初步分離純化的步驟？答：（一）材料的選擇和細(xì)胞抽提液的制備 1.材料的選擇：目的蛋白含量要高，而且容易獲得 2.細(xì)胞破碎方法及細(xì)胞抽提液的制備。為了確?？扇苄约?xì)胞成分全部抽提出來，應(yīng)當(dāng)使用類似于生理條件下的緩沖液。動物組織和器官要盡可能除去結(jié)締組織和脂肪、切碎后放人搗碎機(jī)中。完全破碎酵母和細(xì)菌細(xì)胞。 3.膜蛋白的釋放:膜蛋白存在于細(xì)胞膜或有關(guān)細(xì)胞器的膜上。按其所在位置大體可分為外周蛋白和固有蛋白兩種類型 4.胞外酶的分離:胞外酶是在微生物發(fā)酵時分泌到發(fā)酵液中的。發(fā)酵后可通過離心或過濾將菌體從發(fā)酵液中分離棄去，所得發(fā)酵清液通常要適當(dāng)濃縮，然后再作進(jìn)一步純化。目前常用的濃縮方法是超濾法。（二）蛋白質(zhì)的濃縮和脫鹽 濃縮方法主要有：沉淀法、吸附法、干膠吸附法、滲透濃縮法、超濾濃縮法（三）沉淀法分級蛋白質(zhì) 1.鹽析法 2.有機(jī)溶劑法第二章1.固定化酶（p34）：所謂固定化酶，是指在一定空間內(nèi)呈閉鎖狀態(tài)存在的酶，能連續(xù)地進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)后的酶可以回收重復(fù)使用。固定化細(xì)胞（p53）：固定化細(xì)胞就是被限制自由移動的細(xì)胞，即細(xì)胞受到物理化學(xué)等因素約束或限制在一定的空間界限內(nèi)，但細(xì)胞仍保留催化活性并具有能被反復(fù)或連續(xù)使用的活力。偶聯(lián)率（p57）：偶聯(lián)率=(加入蛋白活力上清蛋白活力)/加入蛋白活力100相對活力（p57）：相對活力=固定化酶總活力/(加入酶的總活力上清中未偶聯(lián)酶活力) 100酶的半衰期（p58）：指在連續(xù)測定條件下，固定化酶（細(xì)胞）的活力下降為最初活力一半所經(jīng)歷的連續(xù)工作時間，以t1/2表示。（半衰期是衡量穩(wěn)定性的指標(biāo)）活力回收（p57）：指固定化后固定化酶（或細(xì)胞）的總活力占用于固定化的游離酶（細(xì)胞）總活力的比例。2.固定化酶相比游離酶的優(yōu)缺點（p34）？答：與游離酶相比，固定化酶具有以下優(yōu)點:1.極易將固定化酶與底物、產(chǎn)物分開2.可以在較長時間內(nèi)進(jìn)行反復(fù)分批反應(yīng)和裝柱連續(xù)反應(yīng)3.在大多數(shù)情況下能夠提高酶的穩(wěn)定性4.酶反應(yīng)過程能夠加以嚴(yán)格控制5.產(chǎn)物溶液中沒有酶的殘留,簡化了提純工藝6.較游離酶更適合于多酶反應(yīng)7.可以增加產(chǎn)物的收率提高產(chǎn)物的質(zhì)量8.酶的使用效率提高成本降低。 同時，固定化酶也存在一些缺點:1.固定化時,酶活力有損失2.增加了生產(chǎn)的成本，工廠初始投資大3.只能用于可溶性底物，而且較適用于小分子底物，對大分子底物不適宜4.與完整菌體相比，不適用于多酶反應(yīng)，特別是需要輔助因子的反應(yīng)5.胞內(nèi)酶必須經(jīng)過酶的分離過程。3.固定化酶的制備方法及各方法的優(yōu)缺點（p35-p42）？答：見p35-p424.固定化酶的制備原則（p34）？答：必須注意維持酶的催化活性及專一性。 為使固定化更有利于生產(chǎn)的自動化、連續(xù)化。其載體必須有一定的機(jī)械強(qiáng)度，不能因機(jī)械攪拌而破碎或脫落。 固定化酶應(yīng)有最小的空間位阻，盡可能不妨礙酶與底物的接近，以提高產(chǎn)品的產(chǎn)量 酶與載體必須結(jié)合牢固，從而使固定化酶能回收貯藏，利于反復(fù)使用。 固定化酶應(yīng)有最大的穩(wěn)定性，所選載體不與廢物、產(chǎn)物或反應(yīng)液發(fā)生化學(xué)反應(yīng)。 固定化酶成本要低，以利于工業(yè)使用 5.固定化酶的評價指標(biāo)（p57）？答：固定化酶(細(xì)胞)的活力。固定化酶(細(xì)胞)的活力即固定化酶（細(xì)胞）催化某一特定化學(xué)反應(yīng)的能力，其大小可用一定條件下它所催化的某一反應(yīng)的反應(yīng)初速率來表示偶聯(lián)效率及相對活力的測定。影響酶固有性質(zhì)諸因素的綜合效應(yīng)及固定化期間引起的酶失活，可用偶聯(lián)效率或相對活力來表示。固定化酶（細(xì)胞）的半衰期。固定化酶（細(xì)胞）的半衰期是指在連續(xù)測定條件下，固定化酶（細(xì)胞）的活力下降為最初活力一半所經(jīng)歷的連續(xù)工作時間，以t1/2表示。半衰期是衡量穩(wěn)定性的指標(biāo)。第三章1.蛋白質(zhì)的化學(xué)修飾：凡通過化學(xué)基團(tuán)的引入或除去,使酶分子共價結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而改變酶的某種特性和功能的過程。 交聯(lián)劑（p85）：交聯(lián)劑是具有兩個反應(yīng)活性部位的雙功能基團(tuán)，可以在相隔較近的兩個氨基酸殘基之間，或酶與其他分子之間發(fā)生交聯(lián)反應(yīng)。 交聯(lián)修飾：使用雙功能基團(tuán)試劑將酶蛋白分子之間、亞基之間或分子內(nèi)不同肽鏈部分間進(jìn)行共價交聯(lián)。 固定化修飾：通過酶表面的酸性或堿性殘基，將酶共價連接到惰性載體上。2.怎么控制修飾反應(yīng)的專一性（p75）？答：（1）試劑的選擇 用于修飾酶活性部位的氨基酸殘基的試劑應(yīng)具備以下一些特征：選擇性地與一個氨基酸殘基反應(yīng)；反應(yīng)在酶蛋白不變性的條件下進(jìn)行；標(biāo)記的殘基在肽中穩(wěn)定；很易通過降解分離出來，進(jìn)行鑒定；反應(yīng)的程度能用簡單的技術(shù)測定。 （2）反應(yīng)條件的選擇蛋白質(zhì)與修飾劑作用所要求的反應(yīng)條件，除允許修飾能順利進(jìn)行外，還必須滿足如下要求：一是不造成蛋白質(zhì)的不可逆變性，為了證明這一點，必須做對照試驗；二是有利于專一性修飾蛋白質(zhì)，為此，反應(yīng)條件應(yīng)盡可能在保證蛋白質(zhì)特定空間構(gòu)象不變或少變的情況下進(jìn)行。 （3）反應(yīng)的專一性 利用蛋白質(zhì)分子中某些基團(tuán)的特殊性選擇不同的反應(yīng)pH利用某些產(chǎn)物的不穩(wěn)定性親和標(biāo)記差別標(biāo)記利用蛋白質(zhì)狀態(tài)的差異。3.修飾主要包括哪些內(nèi)容（修飾哪些基團(tuán)）（p79-p83）？答：羧基的化學(xué)修飾、氨基的化學(xué)修飾、精氨酸胍基的化學(xué)修飾、巰基的化學(xué)修飾、組氨酸咪唑基的化學(xué)修飾、色氨酸吲哚基的化學(xué)修飾、酪氨酸殘基和脂肪族羥基的化學(xué)修飾、甲硫氨酸甲硫基的化學(xué)修飾第四章1.蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性（p102）：蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性指的是蛋白質(zhì)抵抗各種因素的影響、保持其生物活力的能力。 蛋白質(zhì)工程：指用基因操縱技術(shù)高度專一性地改變目標(biāo)蛋白質(zhì)。2.酶蛋白穩(wěn)定的分子原因（p102-p103）？答：（1）金屬離子、底物、輔因子和其他低分子量配體的結(jié)合作用（2）蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)-脂的作用（3）鹽橋和氫鍵（4）二硫鍵（5）對氧化作用敏感的氨基酸含量較低（6）氨基酸殘基的堅實裝配（7）疏水相互作用 3.酶蛋白不可逆失活的原因？答：（1）蛋白水解酶和自溶作用（2）聚合作用（3）極端pH（4）氧化作用（5）表面活性劑和去污劑（6）變性劑（7）重金屬離子和巰基試劑（8）熱（9）機(jī)械力（10）冷卻和脫水（11）輻射作用4.穩(wěn)定的主要方法有哪些（p110-p114）？答：（1）固定化（2）非共價修飾：反相膠束添加劑蛋白質(zhì)間非共價相連（3）化學(xué)修飾：可溶性大分子修飾酶小分子修飾酶（4）蛋白質(zhì)工程（5）酶的失活和再活化 第五章1. 反相膠束（p111）：反相膠束是由兩性化合物在占優(yōu)勢的有機(jī)相中形成的。依溶劑和表面活性劑的組成，可在與水不混溶的溶劑中得到微乳化的反相膠束。 水活度（p146）：水活度（aw）定義為系統(tǒng)中水的逸度與純水逸度之比，水的逸度在理想條件下用水的蒸氣壓代替，因此aw可以用體系中的水的蒸氣壓與同樣條件下純水蒸氣壓之比表示：aw=wxw 必需水（p146）：最適水量是保證酶的極性部位水合、表現(xiàn)活力所必需的，即“必需水”。它直接影響酶的催化活性和選擇性。 化學(xué)修飾酶：酶蛋白分子的主鏈進(jìn)行切割、剪切、以及在側(cè)鏈上進(jìn)行化學(xué)修飾，使其結(jié)構(gòu)、性質(zhì)改變后的酶 印記酶：p1522.非水相的催化與水相催化相比的優(yōu)點（p125）？答：（1）增強(qiáng)難溶于水的反應(yīng)物的溶解度（2）在有機(jī)介質(zhì)中改變反應(yīng)平衡（3）酶制劑易于回收再利用（4）在有機(jī)溶劑中可增強(qiáng)酶的穩(wěn)定性（5）在有機(jī)溶劑中可改變酶的選擇性（6）不會或很少發(fā)生微生物污染。3.非水介質(zhì)有哪些（p126-p129）？答：（1）水-有機(jī)溶劑單相系統(tǒng)（2）水-有機(jī)溶劑兩相系統(tǒng)（3）含有表面活性劑的乳液或微乳液系統(tǒng)（4）微水有機(jī)溶劑單相系統(tǒng)（5）無溶劑或少溶劑反應(yīng)系統(tǒng)（6）超臨界流體系統(tǒng)（7）離子液體（8）氣相反應(yīng)介質(zhì)4.非水介質(zhì)中的選擇催化有何特點（p133-p135）？答：（1）底物特異性。酶在有機(jī)溶劑中對底物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和立體結(jié)構(gòu)均有嚴(yán)格的選擇性（2）對映體選擇性：酶識別外消旋化合物中某種構(gòu)象對映體的能力（3）位置選擇性。有機(jī)溶劑中的酶催化還具有位置選擇性，即酶能夠選擇性地催化底物中某個區(qū)域的基團(tuán)發(fā)生反應(yīng)（4）化學(xué)鍵選擇性。5.有機(jī)溶劑的影響體現(xiàn)在哪些方面（p141-p143）？答：（1）有機(jī)溶劑對酶的結(jié)合水的影響（2）有機(jī)溶劑對酶的影響：有機(jī)溶劑對酶的動態(tài)的影響、溶劑對酶結(jié)構(gòu)的影響、溶劑對酶活性中心的影響、酶活力和溶劑屬性的定量關(guān)系模型（3）溶劑對底物和產(chǎn)物的影響（4）溶劑對酶活性和選擇性的調(diào)節(jié)和控制第六章1.表面分子印記（p196）：在大孔硅膠表面，應(yīng)用通常的分子印記法可產(chǎn)生具有分子識別能力的微孔聚合薄層。類似這樣在某些載體表面產(chǎn)生分子印記空腔或進(jìn)行表面修飾產(chǎn)生印記結(jié)合部位的過程稱為表面分子印記。 生物印記（p198）：是分子印記的一種形式，它是指以天然的生物材料（如蛋白質(zhì)和糖類物質(zhì)）為骨架，在其上進(jìn)行分子印記而產(chǎn)生對印記分子具有特異性識別空腔的過程。 模擬酶（p178）：一般說來，它的研究就是吸收酶中那些起主導(dǎo)作用的因素，利用有機(jī)化學(xué)、生物化學(xué)等方法設(shè)計和合成一些較天然酶簡單的非蛋白質(zhì)分子或蛋白質(zhì)分子，以這些分子作為模型來模擬酶對其作用底物的結(jié)合和催化過程。也就是說，人工模擬酶是在分子水平上模擬酶活性部位的形狀、大小及其微環(huán)境等結(jié)構(gòu)特征，以及酶的作用機(jī)理和立體化學(xué)等特征的一門科學(xué)。 肽酶（p189）：肽酶就是模擬天然酶活性部位而人工合成的具有催化活性的多肽。 半合成酶（p190）：它是以天然蛋白質(zhì)或酶為母體，用化學(xué)或生物學(xué)方法引進(jìn)適當(dāng)?shù)幕钚圆课换虼呋鶊F(tuán)，或改變其結(jié)構(gòu)從而形成一種新的“人工酶”。 分子印記（p193）：如果以一種分子充當(dāng)模板，其周圍用聚合物交聯(lián)，當(dāng)模板分子除去后，此聚合物就留下了與此分子相匹配的空穴。如果構(gòu)建合適，這種聚合物就像“鎖”一樣對鑰匙具有選擇性識別作用，這種技術(shù)被稱為分子印記。2.模擬酶的種類（按屬性分）(P179)？答：主-客體酶模型、膠束酶模型、肽酶、半合成酶、分子印記酶模型、抗體酶以及雜化酶和進(jìn)化酶等。3.制備分子印跡聚合物包括哪些步驟（p195）？答：選定印記分子和單體，讓他們之間充分作用在印記分子周圍發(fā)生聚合反應(yīng)將印記分子從聚合物中抽提出去。于是，此聚合物就產(chǎn)生了恰似印記分子的空間，并對印記分子產(chǎn)生識別能力。第七章1.抗體酶（p210）：也叫催化抗體，它本質(zhì)上是一類具有催化活力的免疫球蛋白，在其可變區(qū)賦予了酶的屬性。2.抗體酶的制備方法有哪些（p211-p214）？答：（1）穩(wěn)定過渡態(tài)法（2）抗體與半抗原互補(bǔ)法（3）熵阱法（4）多底物類似物法（5）抗體結(jié)合部位修飾法（6）蛋白質(zhì)工程法（7）抗體庫法。3.抗體酶活性部位修飾有哪兩種方法（p214-p215）？答：（1）定點突變。定點突變即蛋白質(zhì)工程法，用此法可精確改變蛋白質(zhì)肽鏈上的任一氨基酸殘基，因此，可用來闡明某一氨基酸殘基在抗體結(jié)合和催化中的作用（2）化學(xué)修飾法。修飾抗體酶，可以改善抗體酶的性質(zhì)，如提高其活力、改變專一性等。第八章1.核酶（p226）：具有催化功能的RNA 脫氧核酶（p226）:人工合成的具有催化功能的DNA2.根據(jù)催化功能，核酶分為哪幾類(P226-P227)？答：（1）剪切型核酶。這類核酶主要催化自身或異體RNA的切割，相當(dāng)于核酸內(nèi)切酶的作用。目前發(fā)現(xiàn)的剪切型核酶包括：錘頭型核酶 發(fā)卡型核酶HDVRNaseP （2）剪接型核酶。這類核酶主要催化mRNA前體的修飾加工，切除內(nèi)含子，并完成片段的拼接，主要包括類內(nèi)含子和類內(nèi)含子。3.影響核酶活性的因素？答：（1）pH值對活性的影響（2）二價金屬陽離子對活性的影響：Mg2+，Mn2+（3）抗生素對活性的影響：大多數(shù)為抑制效應(yīng)（4）變性劑對活性的影響（5）溫度對活性的影響4.核酶、脫氧核酶體外篩選方法有哪幾種（p230-p231）？答：（1）SELEX技術(shù)。從隨機(jī)寡核苷酸文庫中篩選出與靶分子特異結(jié)合序列的組合化學(xué)技術(shù)，隨機(jī)寡核苷酸的多種空間結(jié)構(gòu)是篩選基礎(chǔ)（2）動態(tài)組合篩選法。動態(tài)組合化學(xué)法利用可逆化學(xué)法應(yīng)，使組合庫中的結(jié)構(gòu)單元進(jìn)行動態(tài)結(jié)合和交換，能夠有靶向性地為生物大分子設(shè)計、合成和篩選其特異性配體。5.核酶導(dǎo)入細(xì)胞有哪兩種方式（p237）？答：（1）外生性導(dǎo)入，即把預(yù)先合成的核酶直接引入到細(xì)胞內(nèi)（2）內(nèi)生性導(dǎo)入，這種方法是將編碼核酶的基因由載體帶入細(xì)胞內(nèi)，然后再轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生核酶。第九章1.進(jìn)化酶：利用基因工程、蛋白質(zhì)工程的原理和計算機(jī)技術(shù)，対天然酶分子進(jìn)行改造或構(gòu)建新的非天然酶。 酶分子的合理設(shè)計（p243）：是利用各種生物化學(xué)、晶體學(xué)、光譜學(xué)等方法獲得有關(guān)酶分子的結(jié)構(gòu)、特性和功能的信息，并搞清結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系，然后以此為依據(jù)，采用改變(修飾)酶分子中個別氨基酸殘基的方法對酶分子進(jìn)行改造，產(chǎn)生具有新性狀的酶分子，因而該方案稱為酶分子的合理設(shè)計，如化學(xué)修飾、定點突變等。 酶分子的非合理設(shè)計（p243）：在事先不了解酶分子三維結(jié)構(gòu)信息和催化機(jī)制，對酶的結(jié)構(gòu)與功能的相關(guān)性知之甚少的情況下，人為地創(chuàng)造特定的進(jìn)化條件，在體外模擬漫長的自然進(jìn)化過程 (隨機(jī)突變、基因重組、定向選擇或篩選)，使基因發(fā)生多種變異，最后定向選擇或篩選出所需性質(zhì)或功能的突變體酶，該策略稱為酶分子的非合理設(shè)計，如定向分子進(jìn)化 、雜合進(jìn)化等。2.定向進(jìn)化多樣化的基本方法有哪些？內(nèi)容是什么？（p245-p249）答：（1）易錯PCR：是指利用Taq DNA聚合酶不具有3 5校正功能的特點，在特定條件下對待進(jìn)化酶基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增時，以較低的頻率向目的基因中隨機(jī)引入突變的一種技術(shù)。（2）DNA改組：DNA改組又稱為有性PCR。是將一組密切相關(guān)的序列片段化，再通過重組創(chuàng)造新基因的方法。（3）族改組：將DNA改組用于