產(chǎn)微生物絮凝劑菌株的篩選及產(chǎn)絮凝劑發(fā)酵條件的研究.doc

學(xué)習(xí)資料收集于網(wǎng)絡(luò) 僅供參考 學(xué)習(xí)資料 武武漢漢生生物物工工程程學(xué)學(xué)院院 畢畢業(yè)業(yè)論論文文 設(shè)設(shè)計計 題題 目目 產(chǎn)產(chǎn)微微生生物物絮絮凝凝劑劑菌菌株株的的篩篩選選及及 產(chǎn)產(chǎn)絮絮凝凝劑劑發(fā)發(fā)酵酵條條件件的的研研究究 學(xué)學(xué) 生生 曾曾 威威 系系 別別 生生物物技技術(shù)術(shù)系系 專專業(yè)業(yè)班班級級 06 級級本本科科 3 班班 指指導(dǎo)導(dǎo)教教師師 程程 愛愛 芳芳 輔輔導(dǎo)導(dǎo)教教師師 程程 愛愛 芳芳 時時 間間 2009 年年 11 月月至至 2010 年年 5 月月 學(xué)習(xí)資料收集于網(wǎng)絡(luò) 僅供參考 學(xué)習(xí)資料 目 錄 摘 要 II 關(guān)鍵詞 II ABSTRACT III KEY WORDS III 0 引言 1 1 材料與方法 1 1 1 材料 1 1 1 1 菌種來源 1 1 1 2 培養(yǎng)基 1 1 2 方法 1 1 2 1 土壤樣品的采集及預(yù)處理 1 1 2 2 富集培養(yǎng) 2 1 2 3 菌種的分離與純化 2 1 2 4 初篩和復(fù)篩 2 1 2 5 絮凝活性的測定 2 2 結(jié)果與討論 2 2 1 菌株分離及初篩結(jié)果 2 2 2 復(fù)篩結(jié)果 3 2 3 培養(yǎng)條件的優(yōu)化 3 2 3 1 培養(yǎng)溫度對絮凝劑絮凝率的影響 3 2 3 2 培養(yǎng)基初始 pH 值對絮凝劑產(chǎn)生速率的影響 3 2 3 3 C1 產(chǎn)絮凝劑周期的測定 3 2 3 4 不同接種量對菌體產(chǎn)絮凝劑的影響 4 3 結(jié)論 4 參考文獻(xiàn) 6 致 謝 6 學(xué)習(xí)資料收集于網(wǎng)絡(luò) 僅供參考 學(xué)習(xí)資料 產(chǎn)微生物絮凝劑菌株的篩選及產(chǎn)絮凝劑發(fā)酵條件的研究 摘 要 以活性污泥作為菌種來源 采用常規(guī)微生物學(xué)方法分離到36株菌株 初篩后有9株菌株有絮凝 活性 經(jīng)復(fù)篩后有1株菌株C1絮凝活性最高 該菌株所產(chǎn)微生物絮凝劑沉降速度快 絮凝率高 顯 示了該微生物絮凝劑良好的實際應(yīng)用前景 對其生長曲線的研究表明 C1菌株的絮凝活性與菌體生 物量呈正相關(guān)性 培養(yǎng)24h即可達(dá)到最高絮凝活性 關(guān)鍵詞 微生物絮凝劑 篩選 優(yōu)化 學(xué)習(xí)資料收集于網(wǎng)絡(luò) 僅供參考 學(xué)習(xí)資料 Microbial flocculants strains in the screening and produce flocculants fermentation conditions Abstract As a source of activated sludge bacteria isolated by conventional microbiological methods to 36 strains 9 strains were isolated after screening a flocculating activity after rescreening after a strain of the highest flocculating activity of C1 Flocculants produced by the strain settlement rate flocculation rate shows the practical application of microbial flocculants good prospects The study shows that its growth curve C1 strain of flocculating activity and cell biomass was positively correlated 24h culture can achieve the highest flocculating activity Key words Microbial flocculants Screening Optimization 學(xué)習(xí)資料收集于網(wǎng)絡(luò) 僅供參考 學(xué)習(xí)資料 0 引言 目前國內(nèi)外用于提高水質(zhì)處理效率的一種既經(jīng)濟(jì)又簡便的水處理技術(shù)之一就是添加適宜的絮 凝劑 絮凝劑被廣泛應(yīng)用于廢水處理 食品加工和化工等工業(yè)過程 絮凝劑按其來源和性質(zhì)可分 為無機(jī)絮凝劑 有機(jī)高分子絮凝劑和天然生物高分子絮凝劑 前2種絮凝劑不易降解 且其可能是 神經(jīng)毒劑和致癌 致突變因子 現(xiàn)在許多領(lǐng)域已禁止或限量使用 微生物絮凝劑 microbial floeculants MBF 是利用生物技術(shù) 從微生物體或其分泌物提取 純化而獲得的新型水處理劑 具 有安全 高效 可生物降解 不污染環(huán)境 可消除二次污染等特點 具有其它絮凝劑無法比擬的優(yōu) 勢 而且也易于實現(xiàn)工業(yè)化生產(chǎn) 所以MBF取代大部分傳統(tǒng)的無機(jī)和合成有機(jī)高分子絮凝劑將成為 一種趨勢 MBF的研制正成為當(dāng)今世界絮凝劑研究的重要課題 絮凝在給水和排水中均發(fā)揮著不可缺少的重要作用 所應(yīng)用的絮凝劑主要有傳統(tǒng)的無機(jī) 有 機(jī)絮凝劑及生物絮凝劑 前者由于具有價格低廉 絮凝效果好等優(yōu)點 因而被廣泛使用 但由于其 對人類健康所形成的隱患使其應(yīng)用越來越受到限制 微生物絮凝劑是一種由微生物產(chǎn)生的具有絮凝 活性的高分子化合物 具有絮凝沉降性能好 安全 無毒 無二次污染 易于生物降解等優(yōu)點 不 僅能快速絮凝 沉淀各種水中的懸浮顆粒 金屬離子 而且在廢水脫色 高濃度有機(jī)物去除等方面 有獨特效果 是一類極具發(fā)展前景的環(huán)境友好型水處理劑 同時 由于能產(chǎn)生絮凝作用的微生物種 類多 生長快 易于采取生物工程手段實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化 因此 研究和開發(fā)微生物絮凝劑具有深遠(yuǎn)的 現(xiàn)實意義和廣闊的應(yīng)用前景 本實驗從垃圾滲濾液中篩選出一株高效微生物絮凝劑產(chǎn)生菌C2 并對其的培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化 以期提高其絮凝效率 1 1 材料與方法 1 1 材料 1 1 1 菌種來源 以取自武漢生物工程學(xué)院柳園餐廳的生活污水以及餐廳旁的活性污泥作為菌種來源 1 1 2 培養(yǎng)基 實驗中采用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 培養(yǎng)細(xì)菌用 高氏一號培養(yǎng)基 培養(yǎng)放線菌用 查氏培養(yǎng)基 培養(yǎng)霉菌用 馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基 培養(yǎng)真菌用 本實驗中 富集培養(yǎng)時選用上述培養(yǎng)基的液體 培養(yǎng)基 分離 保藏菌株時則采用相應(yīng)的固體培養(yǎng)基 2 3 發(fā)酵培養(yǎng)基 蔗糖150g 尿素1g MgSO4 7H2O 0 5g KCl 0 15g KH2PO4 0 08g ZnSO4 7H2O 0 01g MnSO4 H2O 0 02g 蒸餾水1 000mL pH值自然 1 2 方法 1 2 1 土壤樣品的采集及預(yù)處理 取自武漢生物工程學(xué)院柳園餐廳的生活污水以及餐廳旁的活性污泥用無菌水浸泡幾分鐘 過濾 到入一個250ml已滅菌的錐形瓶中 學(xué)習(xí)資料收集于網(wǎng)絡(luò) 僅供參考 學(xué)習(xí)資料 1 2 2 富集培養(yǎng) 分別在不加瓊脂的PDA培養(yǎng)基 高氏一號培養(yǎng)基 查氏培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基中加入1mL 的土壤懸液 均富集培養(yǎng)兩天 編號并注明日期 1 2 3 菌種的分離與純化 1 稀釋培養(yǎng)液 用移液管移取1mL的細(xì)菌富集培養(yǎng)液于一裝有9mL無菌水的試管中 混勻 再 用另一支移液管移取此稀釋液1mL于另一裝有9mI無菌水的試管中 依次類推將富集培養(yǎng)液逐漸稀 釋制成10 2 10 6各種梯度的培養(yǎng)液 其他的富集培養(yǎng)液以同樣的方法稀釋 4 2 平板劃線 在無菌條件下 用接種環(huán)取一環(huán)稀釋倍數(shù)為l0 3的細(xì)菌培養(yǎng)液 在其培養(yǎng)基中劃 線 平行劃三個平板 同樣的方法將稀釋倍數(shù)為10 4 10 5培養(yǎng)液平行劃三個平板 三個對照 編號 注明日期后 倒置在生化培養(yǎng)箱中于37 培養(yǎng)2天 放線菌 霉菌 真菌以同樣的方法操作 于 28 倒置培養(yǎng)5 7天 3 菌落的選擇和挑取 將透明圈比較大的菌落進(jìn)行編號 分別接種于各自的斜面培養(yǎng)基中培 養(yǎng) 5 1 2 4 初篩和復(fù)篩 將分離菌株分別接種到相應(yīng)的液體培養(yǎng)基中 在30 搖床培養(yǎng)48h后 以高嶺土懸濁液為模擬 廢水 目測分離菌株對高嶺土懸濁液的絮凝活性 初步篩選出絮凝活性較好的菌株 將初篩菌株分 別接種于裝有150mL培養(yǎng)基的250mL三角瓶中 30 150r min振蕩培養(yǎng) 于24h 48h 72h取樣 測定培養(yǎng)液在不離心和3000r rain離心30min兩種情況下 菌株發(fā)酵液對高嶺土懸濁液的絮凝活性 進(jìn)行復(fù)篩 6 7 1 2 5 絮凝活性的測定 絮凝活性用絮凝率來表征 在100mL比色管中加入0 4g高嶺土 2mL1 0 的CaCl2及2mL純化培 養(yǎng)的培養(yǎng)液 加蒸餾水至100mL 蓋上蓋子做10次上下自然翻轉(zhuǎn) 轉(zhuǎn)速以每次翻轉(zhuǎn)時氣泡上升完畢 為準(zhǔn) 靜置10min 取比色管中75mL處的上清液并以蒸餾水為參比溶液 于波長為550nm處測其吸 光度 絮凝率的計算公式如下 絮凝率 A B A 100 式中 A為原高嶺土懸濁液上清液550nm處的吸光度值 B為處理后的高嶺土懸濁液上清液550nm處 的吸光度值 8 11 2 結(jié)果與討論 2 1 菌株分離及初篩結(jié)果 本實驗共分離菌株36株 每種培養(yǎng)基9株 分別命名為P1 P2 P9 PDA培養(yǎng)基 N1 N2 N9 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 C1 C2 C9 查氏培養(yǎng)基 G1 G2 G9 高氏培養(yǎng)基 12 13 初篩后有絮凝活性的菌株共10株 其中牛肉膏蛋白胨培養(yǎng) 基1株 為N2 高氏一號培養(yǎng)基3株 分別為G2 G4 G5 查氏培養(yǎng)基6株 分別為 C1 C2 C3 C5 C7 C8 PDA培養(yǎng)基0株 學(xué)習(xí)資料收集于網(wǎng)絡(luò) 僅供參考 學(xué)習(xí)資料 2 2 復(fù)篩結(jié)果 復(fù)篩結(jié)果如表1所示 其中絮凝活性最高的為C1 絮凝率為0 712 其次為C2 C8 將這三株 菌株重新接種培養(yǎng) 對培養(yǎng)液的發(fā)酵活性進(jìn)行比較 結(jié)果顯示C1菌株沉降速度最快 絮凝率最高 且菌株懸液濃度較低 表明該菌株產(chǎn)微生物絮凝劑能力強(qiáng) 且培養(yǎng)液絮凝活性好 因此 以該菌株 作為后續(xù)研究對象 14 表1 不同菌株絮凝活性 菌株N2G2G4G5C1C2C3C5C7C8 絮凝率0 280 3080 1020 4720 7120 6210 320 3030 5070 541 2 3 培養(yǎng)條件的優(yōu)化 2 3 1 培養(yǎng)溫度對絮凝劑絮凝率的影響 表2 培養(yǎng)溫度對絮凝劑絮凝率的影響 培養(yǎng)溫度 23252730333537 絮凝率0 5110 5240 5880 6920 6530 5470 501 由表2可知 當(dāng)溫度為30 時 絮凝劑絮凝率最大為0 692 23 30 之間時 絮凝劑絮凝率隨 溫度升高而增大 但溫度為35 時 絮凝劑絮凝率迅速下降 這是因為溫度過低或過高時 微生物 生長過慢或過快 均不利于絮凝劑的積累 15 因此 選擇培養(yǎng)溫度為30 2 3 2 培養(yǎng)基初始 pH 值對絮凝劑產(chǎn)生速率的影響 表3 初始pH值對絮凝劑絮凝率的影響 pH 值456789 絮凝率0 4120 5290 6420 7120 6850 594 pH值對微生物的生長和代謝具有很大的影響 一方面 pH過高或過低都會引起微生物表面電 荷的改變 從而不利于細(xì)胞對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收 另一方面 pH過高或過低會使蛋白質(zhì) 核酸等生 物大分子所帶電荷發(fā)生變化 從而影響其生物活性 16 由表3可以看出 pH在6 0 8 0的范圍之間 都有較高的絮凝活性 最佳pH在7 0左右 此時絮凝率達(dá)到71 2 2 3 3 C1 產(chǎn)絮凝劑周期的測定 在250mL三角瓶內(nèi)裝50mL發(fā)酵培養(yǎng)基 初始pH值為7 在30 180 rpm 條件下?lián)u床培養(yǎng) 每12h取樣一次 測定發(fā)酵液絮凝活性 發(fā)酵液的絮凝率在12h之前均為負(fù)數(shù) 可能因為在培養(yǎng)初期 絮凝劑產(chǎn)生菌尚未產(chǎn)生絮凝劑 相反在發(fā)酵液或高嶺土中某些成分使吸光度增大 導(dǎo)致絮凝率為負(fù) 值 17 培養(yǎng)中 后期絮凝活性逐步上升 發(fā)酵72h時絮凝率達(dá)到72 之后絮凝率又逐漸下降 表4 生長周期對絮凝劑絮凝率的影響 生長周期12h24h36h48h60h72h84h96h108h 絮凝率 0 1830 1540 2630 4210 5740 720 6740 6120 582 學(xué)習(xí)資料收集于網(wǎng)絡(luò) 僅供參考 學(xué)習(xí)資料 2 3 4 不同接種量對菌體產(chǎn)絮凝劑的影響 在發(fā)酵培養(yǎng)基中分別以1 2 3 4 5 6 的接種量接入種子液 經(jīng)搖床培養(yǎng)72h 后 分別測定各組培養(yǎng)液的絮凝活性 實驗結(jié)果顯示 接種量為 3 時 絮凝率較高為70 5 之后隨著接種量的增大 絮凝率降低 因此 接種量也是影響 C1產(chǎn)絮凝劑的一個因素 由于接 種量過大 培養(yǎng)液中細(xì)菌的初始濃度高 生長初期細(xì)菌生長繁殖則會消耗大量的營養(yǎng)物質(zhì) 導(dǎo)致 絮凝劑的產(chǎn)量下降 而接種量過小 培養(yǎng)液中的細(xì)菌濃度低 使得培養(yǎng) 周期過長 18 表5 不同接種量對絮凝劑絮凝率的影響 接種量 1 2 3 4 5 6 絮凝率0 5420 6740 705 0 682 0 6570 635 3 結(jié)論 以活性污泥作為菌種來源 采用常規(guī)微生物學(xué)方法從四種培養(yǎng)基中分離到 36 株菌株 經(jīng)初篩 后有 10 株菌株有絮凝活性 經(jīng)復(fù)篩后有 3 株菌株絮凝活性較高 其中 C1 菌株絮凝活性最高 可達(dá) 71 2 該菌株所產(chǎn)微生物絮凝劑絮凝率高 且生成絮體大 沉降速度快 顯示了該微生物絮凝劑 良好的實際應(yīng)用前景 經(jīng)過單因子實驗的研究表明 1 在溫度為 30 絮凝劑絮凝率最大為 0 692 23 30 之間時 絮凝劑絮凝率隨溫度升高 而增大 但溫度為 35 時 絮凝劑絮凝率迅速下降 這是因為溫度過低或過高時 微生物生長過 慢或過快 均不利于絮凝劑的積累 因此 選擇培養(yǎng)溫度為 30 2 pH 值為 7 時 一方面 pH 過高或過低都會引起微生物表面電荷的改變 從而不利于細(xì)胞 對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收 另一方面 pH 過高或過低會使蛋白質(zhì) 核酸等生物大分子所帶電荷發(fā)生變化 從而影響其生物活性 由表 3 可以看出 pH 在 6 0 8 0 的范圍之間 都有較高的絮凝活性 最佳 pH 在 7 0 左右 此時絮凝率達(dá)到 71 2 3 最佳生長周期為72h 發(fā)酵液的絮凝率在12h之前均為負(fù)數(shù) 可能因為在培養(yǎng)初期 絮凝劑 產(chǎn)生菌尚未產(chǎn)生絮凝劑 相反在發(fā)酵液或高嶺土中某些成分使吸光度增大 導(dǎo)致絮凝率為負(fù)值 培 養(yǎng)中 后期絮凝活性逐步上升 發(fā)酵72h時絮凝率達(dá)到72 之后絮凝率又逐漸下降 4 最佳接種量為3 絮凝率較高為70 5 之后隨著接種量的增大 絮凝率降低 因此 由于接種量過大 培養(yǎng)液中細(xì)菌的初始濃度高 生長初期細(xì)菌生長繁殖則會消耗大量的營養(yǎng)物質(zhì) 導(dǎo)致絮凝劑的產(chǎn)量下降 而接種量過小 培養(yǎng)液中的細(xì)菌濃度低 使得培養(yǎng) 周期過長 雖然當(dāng)前對微生物絮凝劑菌株的研究比較多 但還是有很多地方還需要實質(zhì)性的突破 我覺 得現(xiàn)在對微生物絮凝劑菌株研究的 重點是盡快將微生物絮凝劑推廣應(yīng)用到實際中去 實現(xiàn)微生物 絮凝劑的大規(guī)模推廣 關(guān)鍵是要提高生產(chǎn)效率 降低成本 拓寬適用范圍和使用效率 今后的研 究工作可能集中在以下幾方面展開 1 繼續(xù)從各角度研究微生物的絮凝機(jī)理仍將是各國科學(xué)工作者研究的熱點 2 在微生物發(fā)酵中 誘導(dǎo)和利用自絮凝菌株實現(xiàn)微生物的高濃度培養(yǎng) 以提高目標(biāo)產(chǎn)物的 濃度 優(yōu)化運行條件 探索新工藝新方法 尋找物美價廉的微生物絮凝劑培養(yǎng)基與培養(yǎng)條件的研究 實 現(xiàn)連續(xù)發(fā)酵也是今后微生物絮凝劑應(yīng)用研究的一個方向 學(xué)習(xí)資料收集于網(wǎng)絡(luò) 僅供參考 學(xué)習(xí)資料 3 在生物發(fā)酵產(chǎn)品的后提取中 針對具體的微生物發(fā)酵液體系 選擇合適的絮凝劑進(jìn)行絮凝 預(yù)處理 從而改善其固液分離性能 以利于產(chǎn)品的進(jìn)一步提純 這將會大大降低后提取的成本 帶來可觀的經(jīng)濟(jì)效益 研究微生物絮凝劑與其它絮凝劑的配合使用 發(fā)揮互補(bǔ)作用 不但可提高絮 凝效率 而且還可降低投加量 4 從分子生物學(xué)的角度深入研究 運用基因工程和生物技術(shù)定向選育高絮凝活性 高降解能 力的工程菌將是其發(fā)展的方向之一 參考文獻(xiàn) 1 周禮 張永奎 陳曉等 一種高效微生物絮凝劑產(chǎn)生菌的篩選及培養(yǎng)基優(yōu)化 J 環(huán)境科學(xué)學(xué)報 2006 26 4 52 58 2 陶然 楊朝暉 曾光明等 微生物絮凝劑產(chǎn)生菌的篩選 鑒定及其培養(yǎng)條件的優(yōu)化研究 J 中國 生物工程雜志 2005 25 8 76 81 3 董曉斌 新型生物絮凝劑的研究與應(yīng)用 J 甘肅聯(lián)合大學(xué)學(xué)報 自然科學(xué)版 2006 20 1 52 54 4 趙鳳 張蔚萍 胡慶華 微生物絮凝劑的絮凝機(jī)理和應(yīng)用研究 J 環(huán)境與可持續(xù)發(fā)展 2009 2 6 8 5 王鍵為 李艷賓 微生物絮凝劑在廢水處理中的應(yīng)用 J 河北化工 2007 30 6 75 76 6 楊阿明 張志強(qiáng) 王學(xué)江 高效微生物絮凝劑用于污泥脫水及其動力學(xué)研究 J 中國給水排水 2007 23 90 24 28 7 陶然 楊朝暉 曾光明等 微生物