兩點(diǎn)法、終點(diǎn)法、速率法.doc

什么叫兩點(diǎn)法、終點(diǎn)法、速率法? 兩點(diǎn)法：測(cè)定酶反應(yīng)開(kāi)始后某一時(shí)間內(nèi)(t1到t2)產(chǎn)物或底物濃度的總變化量以求取酶反應(yīng)初速度的方法。終點(diǎn)法：通過(guò)測(cè)定酶反應(yīng)開(kāi)始到反應(yīng)達(dá)到平衡時(shí)產(chǎn)物或底物濃度總變化量，以求出酶活力的方法，亦稱平衡法。速率法：是指連續(xù)測(cè)定(每15秒1分鐘監(jiān)測(cè)一次)酶反應(yīng)過(guò)程中某一反應(yīng)產(chǎn)物或底物的濃度隨時(shí)間的變化來(lái)求出酶反應(yīng)的初速度的方法，即連續(xù)監(jiān)測(cè)法。一、常用生化檢測(cè)項(xiàng)目分析方法舉例1終點(diǎn)法檢測(cè)常用的有總膽紅素（氧化法或重氮法）、結(jié)合膽紅素（氧化法或重氮法）、血清總蛋白（雙縮脲法）、血清白蛋白（溴甲酚氯法）、總膽汁酸（酶法）、葡萄糖（葡萄糖氧化酶法）、尿酸（尿酸酶法）、總膽固醇（膽固醇氧化酶法）、甘油三酯（磷酸甘油氧化酶酶法）、高密度脂蛋白膽固醇（直接測(cè)定法）、鈣（偶氮砷法）、磷（紫外法）、鎂（二甲苯胺藍(lán)法）等。以上項(xiàng)目中，除鈣、磷和鎂基本上還使用單試劑方式分析因而采用一點(diǎn)終點(diǎn)法外，其它測(cè)定項(xiàng)目都可使用雙試劑故能選用兩點(diǎn)終點(diǎn)法，包括總蛋白、白蛋白測(cè)定均已有雙試劑可用。2固定時(shí)間法苦味酸法測(cè)定肌酐采用此法。（兩點(diǎn)法）3連續(xù)監(jiān)測(cè)法對(duì)于酶活性測(cè)定一般應(yīng)選用連續(xù)監(jiān)測(cè)法，如丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、乳酸脫氫酶、堿性磷酸酶、谷氨氨酰基轉(zhuǎn)移酶、淀粉酶和肌酸激酶等。一些代謝物酶法測(cè)定的項(xiàng)目如己糖激酶法測(cè)定葡萄糖、脲酶偶聯(lián)法測(cè)定尿素等，也可用連續(xù)監(jiān)測(cè)法。4透射比濁法透射比濁法可用于測(cè)定產(chǎn)生濁度反應(yīng)的項(xiàng)目，多數(shù)屬免疫比濁法，載脂蛋白、免疫球蛋白、補(bǔ)體、抗O、類風(fēng)濕因子，以及血清中的其他蛋白質(zhì)如前白蛋白、結(jié)合珠蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白等均可用此法。 二、分析參數(shù)設(shè)置分析儀的一些通用操作步驟如取樣、沖洗、吸光度檢測(cè)、數(shù)據(jù)處理等，其程序均已經(jīng)固化在存儲(chǔ)器里，用戶不能修改。各種測(cè)定項(xiàng)目的分析參數(shù)（analysisparamete）大部分也已設(shè)計(jì)好，存于磁盤(pán)中，供用戶使用；目前大多數(shù)生化分析儀為開(kāi)放式，用戶可以更改這些參數(shù)。生化分析儀一般另外留一些檢測(cè)項(xiàng)目的空白通道，由用戶自己設(shè)定分析參數(shù)。因此必須理解各參數(shù)的確切意義。一、分析參數(shù)介紹（一）必選分析參數(shù)這類參數(shù)是分析儀檢測(cè)的前提條件，沒(méi)有這些參數(shù)無(wú)法進(jìn)行檢測(cè)。1試驗(yàn)名稱 試驗(yàn)名稱（test code）是指測(cè)定項(xiàng)目的標(biāo)示符，常以項(xiàng)目的英文縮寫(xiě)來(lái)表示。2方法類型（也稱反應(yīng)模式） 方法類型（assay）有終點(diǎn)法、兩點(diǎn)法、連續(xù)監(jiān)測(cè)法等，根據(jù)被檢物質(zhì)的檢測(cè)方法原理選擇其中一種反應(yīng)類型。3反應(yīng)溫度 一般有30、37可供選擇，通常固定為37。4主波長(zhǎng) 主波長(zhǎng)（primary wavelength）是指定一個(gè)與被測(cè)物質(zhì)反應(yīng)產(chǎn)物的光吸收有關(guān)的波長(zhǎng)。5次波長(zhǎng) 次波長(zhǎng)（secondary wavelength）是在使用雙波長(zhǎng)時(shí)，要指定一個(gè)與主波長(zhǎng)、干擾物質(zhì)光吸收有關(guān)的波長(zhǎng)。6反應(yīng)方向 反應(yīng)方向（response direction）有正向反應(yīng)和負(fù)向反應(yīng)兩種，吸光度增加為正向反應(yīng)，吸光度下降為負(fù)向反應(yīng)。7樣品量 樣品量（sampling volum）一般是2l35l，以0.1l步進(jìn)，個(gè)別分析儀最少能達(dá)到1.6l?？稍O(shè)置常量、減量和增量。8 第一試劑量 第一試劑量（first regengt volum）一般是20300l，以1l步進(jìn)。9 第二試劑量 第二試劑量（second regengt volum）一般也是20300l，以1l步進(jìn)。10總反應(yīng)容量 總反應(yīng)容量（total reacting volum）在不同的分析儀有一個(gè)不同的規(guī)定范圍，一般是180350l，個(gè)別儀器能減少至120l?？偡磻?yīng)容量太少無(wú)法進(jìn)行吸光度測(cè)定。11孵育時(shí)間 孵育時(shí)間（incubate time）在終點(diǎn)法是樣品與試劑混勻開(kāi)始至反應(yīng)終點(diǎn)為止的時(shí)間，在兩點(diǎn)法是第一個(gè)吸光度選擇點(diǎn)開(kāi)始至第二個(gè)吸光度選擇點(diǎn)為止的時(shí)間。12延遲時(shí)間 延遲時(shí)間（delay time）在連續(xù)監(jiān)測(cè)法中樣品與反應(yīng)試劑（第二試劑）混勻開(kāi)始至連續(xù)監(jiān)測(cè)期第一個(gè)吸光度選擇點(diǎn)之間的時(shí)間。13連續(xù)監(jiān)測(cè)時(shí)間 連續(xù)監(jiān)測(cè)時(shí)間（continuous monitoring time）在延遲時(shí)間之后即開(kāi)始，一般為60120s，不少于4個(gè)吸光度檢測(cè)點(diǎn)（3個(gè)吸光度變化值）。14校準(zhǔn)液個(gè)數(shù)及濃度 校準(zhǔn)曲線線性好并通過(guò)坐標(biāo)零點(diǎn)的，可采用一個(gè)校準(zhǔn)液（calibrator）；線性好但不通過(guò)坐標(biāo)零點(diǎn)，應(yīng)使用兩個(gè)校準(zhǔn)液；對(duì)于校準(zhǔn)曲線呈非線性者，必須使用兩個(gè)以上校準(zhǔn)液。每一個(gè)校準(zhǔn)液都要有一個(gè)合適的濃度。15校準(zhǔn)K值或理論K值 通過(guò)校準(zhǔn)得到的K值為校準(zhǔn)K值（calibrate coefficient）或由計(jì)算得出的K值為理論K值。16線性范圍 即方法的線性范圍（linearity range），超過(guò)此范圍應(yīng)增加樣品量或減少樣品量重測(cè)。與試劑/樣品比值有關(guān)。17小數(shù)點(diǎn)位數(shù) 檢測(cè)結(jié)果的小數(shù)點(diǎn)位數(shù)（decimal point digit）。（二）備選分析參數(shù)這類分析參數(shù)與檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性有關(guān)，一般來(lái)說(shuō)不設(shè)置這類分析參數(shù)，分析儀也能檢測(cè)出結(jié)果，但若樣品中待測(cè)物濃度太高等，檢測(cè)結(jié)果可能不準(zhǔn)確。1樣品預(yù)稀釋 設(shè)置樣品量、稀釋劑量和稀釋后樣品量三個(gè)數(shù)值，便可在分析前自動(dòng)對(duì)樣品進(jìn)行高倍稀釋。2底物耗盡值 底物耗盡值（substrate exhaust limit）在負(fù)反應(yīng)的酶活性測(cè)定中，可設(shè)置此參數(shù)，以規(guī)定一個(gè)吸光度下降限。若低于此限時(shí)底物已太少，不足以維持零級(jí)反應(yīng)而導(dǎo)致檢測(cè)結(jié)果不準(zhǔn)確。 3前區(qū)檢查 免疫比濁法中應(yīng)用，以判斷是否有抗原過(guò)剩。將終點(diǎn)法最后兩個(gè)吸光度值的差別（A）設(shè)置一個(gè)限值，如果后一點(diǎn)的吸光度比前一點(diǎn)低，表示已有抗原過(guò)剩，應(yīng)稀釋樣品后重測(cè)。4試劑空白吸光度范圍 超過(guò)此設(shè)定范圍表示試劑已變質(zhì)，應(yīng)更換合格試劑。5試劑空白速率 連續(xù)監(jiān)測(cè)法中使用，是試劑本身在監(jiān)測(cè)過(guò)程中沒(méi)有化學(xué)反應(yīng)時(shí)的變化速率。6方法學(xué)補(bǔ)償系數(shù) 用于校準(zhǔn)不同分析方法間測(cè)定結(jié)果的一致性，有斜率和截距兩個(gè)參數(shù)。7參考值范圍 對(duì)超過(guò)此范圍的測(cè)定結(jié)果，儀器會(huì)打印出提示。（三）某些參數(shù)的特殊意義 1最小樣品量 最小樣品量是指分析儀進(jìn)樣針能在規(guī)定的誤差范圍內(nèi)吸取的最小樣品量。一般分析儀的最小樣品量是2l，目前也有小至1.6l的。在樣品含高濃度代謝產(chǎn)物或高活性酶濃度的情況下往往需采用分析儀的最小樣品量作為減量參數(shù)，從而使分析儀檢測(cè)范圍（與線性范圍不同）的上限得以擴(kuò)大。2最大試劑量 方法靈敏度很高而線性上限低的檢測(cè)項(xiàng)目，如血清白蛋白的溴甲酚氯法測(cè)定，以往手工法操作時(shí)樣品量10l，試劑量4ml，這樣試劑量/樣品量比例（R/S）為200，線性上限則為60g/L。此法移植到分析儀上后，R/S卻很難達(dá)到200，致使線性上限變低。因此對(duì)這類檢測(cè)項(xiàng)目最大試劑量非常重要。 3彈性速率 在酶活性測(cè)定中，當(dāng)酶活性太高，在連續(xù)監(jiān)測(cè)期中已不呈線性反應(yīng)時(shí)，有些儀器具有彈性速率（flexrate）功能，能自動(dòng)選擇反應(yīng)曲線上連續(xù)監(jiān)測(cè)期中仍呈線性的吸光度數(shù)據(jù)計(jì)算結(jié)果，使酶活性測(cè)定的線性范圍得以擴(kuò)大。如AST可從1000U/L擴(kuò)展至4000U/L，從而減少稀釋及重測(cè)次數(shù)、降低成本。4試劑空白速率 當(dāng)樣品中存在膽紅素時(shí)，膽紅素對(duì)堿性苦味酸速率法或兩點(diǎn)法測(cè)定肌酐有負(fù)干擾。因?yàn)槟懠t素在肌酐檢測(cè)的波長(zhǎng)505nm有較高光吸收，而且膽紅素在堿性環(huán)境中可被氧化轉(zhuǎn)變，因而在肌酐反應(yīng)過(guò)程中膽紅素的光吸收呈下降趨勢(shì)。若在加入第一試劑后一段時(shí)間內(nèi)設(shè)置試劑空白速率，因?yàn)榇硕沃锌辔端嵘形磁c肌酐反應(yīng)，而膽紅素在第一試劑的堿性環(huán)境中已同樣被氧化轉(zhuǎn)變，因而以第二試劑加入后的速率變化，減去試劑空白速率變化，便可消除膽紅素的負(fù)干擾，見(jiàn)圖7-8。二、單波長(zhǎng)和雙波長(zhǎng)方式（一）概念采用一個(gè)波長(zhǎng)檢測(cè)物質(zhì)的光吸收強(qiáng)度的方式稱為單波長(zhǎng)(mono-wavelength)方式。當(dāng)反應(yīng)液中含有一種組分，或在混合反應(yīng)液中待測(cè)組分的吸收峰與其它共存物質(zhì)的吸收波長(zhǎng)無(wú)重疊時(shí)，可以選用。在吸光度檢測(cè)中，使用一個(gè)主波長(zhǎng)和一個(gè)次波長(zhǎng)的稱雙波長(zhǎng)方式。當(dāng)反應(yīng)液中存在干擾物的較大吸收、從而影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性時(shí)，采用雙波長(zhǎng)方式更好。（二）雙波長(zhǎng)的作用雙波長(zhǎng)(di-wavelength)測(cè)定優(yōu)點(diǎn)是消除噪音干擾;減少雜散光影響;減少樣品本身光吸收的干擾。從光源，到比色杯、單色器、檢測(cè)器的整個(gè)光路系統(tǒng)中，均存在著隨時(shí)間發(fā)生變化的不穩(wěn)定的檢測(cè)信號(hào)，即噪音，而雙波長(zhǎng)檢測(cè)是同時(shí)進(jìn)行的，兩種波長(zhǎng)檢測(cè)產(chǎn)生的噪音基本上相同，因而能消除噪音干擾。當(dāng)樣品中存在非化學(xué)反應(yīng)的干擾物如甘油三酯、血紅蛋白、膽紅素等時(shí)，會(huì)產(chǎn)生非特異性的光吸收，而干擾測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性。采用雙波長(zhǎng)方式測(cè)定可以部分消除這類干擾，提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。 （三）次波長(zhǎng)的確定方法當(dāng)被測(cè)物的主波長(zhǎng)確定之后，再選擇次波長(zhǎng)。如根據(jù)甘油三酯等干擾物吸收光譜特征，選擇次波長(zhǎng)，使干擾物在主、次波長(zhǎng)處有盡可能相同的光吸收值，而被測(cè)物在主、次波長(zhǎng)處的光吸收值應(yīng)有較大的差異。一般來(lái)說(shuō)，次波長(zhǎng)應(yīng)大于主波長(zhǎng)100nm。以主波長(zhǎng)與次波長(zhǎng)吸光度差來(lái)計(jì)算結(jié)果。（四）雙波長(zhǎng)的具體應(yīng)用對(duì)于某些反應(yīng)速度快且無(wú)法設(shè)置為兩點(diǎn)終點(diǎn)法的分析項(xiàng)目，尤其是單試劑分析中，可以利用雙波長(zhǎng)的方式來(lái)部分消除樣品本身的光吸收干擾。目前用單試劑法測(cè)定的項(xiàng)目應(yīng)用雙波長(zhǎng)的為血清總蛋白（雙縮脲法）主波長(zhǎng)500nm，次波長(zhǎng)576nm；血清白蛋白（溴甲酚氯法）主、次波長(zhǎng)分別為600和700nm；鈣（偶氮砷法）主、次波長(zhǎng)分別為 660、770nm；磷（紫外比色法）主、次波長(zhǎng)為340、405nm，鎂（二甲苯胺藍(lán)法）主、次波長(zhǎng)為505和 600nm。三、單試劑和雙試劑方式反應(yīng)過(guò)程中只加一次試劑稱單試劑方式，加兩次試劑便為雙試劑方式。目前的生化分析儀大多可用雙試劑方式分析，其優(yōu)點(diǎn)是：可提高試劑的穩(wěn)定性，多數(shù)雙試劑混合成單一工作試劑時(shí)，其穩(wěn)定時(shí)間縮短；能設(shè)置兩點(diǎn)終點(diǎn)法，來(lái)消除來(lái)自樣品本身的光吸收干擾；在某些項(xiàng)目檢測(cè)時(shí)能消除非特異性化學(xué)反應(yīng)的干擾。如血清ALT測(cè)定，血清中的內(nèi)源性丙酮酸及其它酮酸也可與試劑中的指示酶（乳酸脫氫酶）起反應(yīng)，使結(jié)果偏高。若先加入缺乏-酮戊二酸的第一試劑，使其它酮酸與指示酶反應(yīng)之后再加入含有-酮戊二酸的第二試劑，啟動(dòng)真正的ALT酶促反應(yīng)生成丙酮酸，而丙酮酸與乳酸脫氫酶的反應(yīng)消耗的NAD能真正反映ALT的活性，從而消除以上副反應(yīng)的影響。四、測(cè)定過(guò)程的自動(dòng)監(jiān)測(cè)各種自動(dòng)生化分析儀或多或少都具有對(duì)測(cè)定過(guò)程進(jìn)行各種監(jiān)測(cè)的功能，以便在沒(méi)有人監(jiān)督化學(xué)反應(yīng)的情況下提高檢測(cè)的準(zhǔn)確性。高檔分析儀的監(jiān)測(cè)功能更強(qiáng)。1試劑空白監(jiān)測(cè) 每種試劑都有一定的空白吸光度范圍，試劑空白吸光度的改變往往提示著該試劑的變質(zhì)：如利用Trinder反應(yīng)為原理的檢測(cè)試劑會(huì)因酚被氧化為醌而變?yōu)榧t色；堿性磷酸酶、谷氨酰轉(zhuǎn)移酶、淀粉酶等檢測(cè)試劑會(huì)因基質(zhì)分解出硝基酚或硝基苯胺而變黃；有些試劑久置后變渾濁。這些情況均可使空白吸光度升高。丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶等負(fù)反應(yīng)檢測(cè)項(xiàng)目，其試劑在放置過(guò)程中空白吸光度會(huì)因NADH自行氧化為NAD+而下降等。試劑空白的測(cè)定方法有兩種：每瓶試劑在使用前通過(guò)對(duì)試劑空白校準(zhǔn)來(lái)確定試劑空白吸光度，這種方式適用于先取樣品后加試劑的分析儀。每個(gè)樣品測(cè)定前均檢測(cè)試劑空白吸光度，適用于先加試劑后取樣品的分析儀。2試劑空白變化速率監(jiān)測(cè) 一些酶試劑在反應(yīng)溫度下不穩(wěn)定，其空白吸光度可隨著時(shí)間逐漸發(fā)生變化，這種變化的主要原因與工具酶或輔酶的純度有關(guān)，且因試劑的組成和生產(chǎn)廠家的不同而不同。這種變化會(huì)影響測(cè)定結(jié)果的準(zhǔn)確性，一般使結(jié)果偏高。如果設(shè)置此項(xiàng)監(jiān)測(cè)，分析儀在結(jié)果計(jì)算時(shí)會(huì)自動(dòng)減去試劑空白變化速率。在以監(jiān)測(cè)NAD（P）H減少為指示反應(yīng)的酶活性測(cè)定中，空白速率可監(jiān)測(cè)并消除由NADH自身氧化所造成的吸光度下降；在色素原為底物的酶活性測(cè)定中，空白速率可監(jiān)測(cè)并消除底物自身分解造成的吸光度升高。有關(guān)空白速率監(jiān)測(cè)在膽紅素對(duì)堿性苦味酸速率法測(cè)定肌酐負(fù)干擾消除中的作用，已如前述。3樣品信息監(jiān)測(cè) 由于樣品的溶血、脂濁、黃疸會(huì)對(duì)測(cè)定結(jié)果產(chǎn)生非化學(xué)反應(yīng)的干擾。根據(jù)溶血、脂濁、黃疸的光譜吸收特性，用雙波長(zhǎng)或多波長(zhǎng)檢測(cè)其性質(zhì)和程度，一般是測(cè)定樣品在600nm570nm、700nm/660nm和505nm/480nm吸光度比值的大小來(lái)分別判斷樣品溶血、脂濁和黃疸程度。然后在結(jié)果計(jì)算時(shí)自動(dòng)減去這部分干擾，這將有利于提高分析結(jié)果的可靠性。4結(jié)果可靠性監(jiān)測(cè)（1）終點(diǎn)監(jiān)測(cè)：終點(diǎn)法測(cè)定要判斷所選的測(cè)光點(diǎn)是否到達(dá)終點(diǎn)或平衡點(diǎn)。一些分析儀在所選終點(diǎn)后再選一個(gè)測(cè)光點(diǎn)，比較這兩點(diǎn)吸光度的差異來(lái)判斷反應(yīng)是否到達(dá)終點(diǎn)。 （2）線性期監(jiān)測(cè)：連續(xù)監(jiān)測(cè)法選擇時(shí)間吸光度反應(yīng)曲線上的線性期來(lái)計(jì)算酶活性或被測(cè)物濃度，因此儀器要確定此連續(xù)監(jiān)測(cè)期是否呈線性。其監(jiān)測(cè)方法為將連續(xù)監(jiān)測(cè)到的各吸光度值進(jìn)行線性回歸，計(jì)算出各點(diǎn)的方差，根據(jù)方差值的大小來(lái)判斷是否呈線性；取連續(xù)監(jiān)測(cè)期開(kāi)始若干點(diǎn)的變化速率與連續(xù)監(jiān)測(cè)期最后若干點(diǎn)的變化速率進(jìn)行比較，來(lái)判斷是否為線性期。5底物消耗的監(jiān)測(cè) 在連續(xù)監(jiān)測(cè)法測(cè)定酶活性時(shí)，如果在監(jiān)測(cè)期內(nèi)吸光度上升或下降超過(guò)其底物耗盡值，則說(shuō)明該樣品酶活性非常高，底物將被耗盡，監(jiān)測(cè)期的吸光度將偏離線性，使測(cè)定結(jié)果不可靠。此時(shí)不打印結(jié)果或打印結(jié)果同時(shí)也打印出底物耗盡提示，該樣品應(yīng)稀釋一定的倍數(shù)重新測(cè)定。此監(jiān)測(cè)對(duì)于采用負(fù)反應(yīng)分析酶活性的方法甚為重要。見(jiàn)圖7-96方法線性范圍監(jiān)測(cè) 每種待測(cè)物分析都有一個(gè)可測(cè)定的濃度或活性范圍，樣品結(jié)果若超過(guò)此范圍，分析儀將顯示測(cè)定結(jié)果超過(guò)線性范圍的提示，多數(shù)分析儀會(huì)自動(dòng)將樣品減量或增量重新測(cè)定。一、分析方法分類 （一）終點(diǎn)法被測(cè)物質(zhì)在反應(yīng)過(guò)程中完全被轉(zhuǎn)變?yōu)楫a(chǎn)物，即達(dá)到反應(yīng)終點(diǎn)，根據(jù)終點(diǎn)吸光度的大小求出被測(cè)物濃度，稱為終點(diǎn)法（end essay）。實(shí)際上被測(cè)物并沒(méi)有完全被轉(zhuǎn)變，而只是與產(chǎn)物達(dá)到一個(gè)動(dòng)態(tài)的化學(xué)平衡，因此該法稱為平衡法更為恰當(dāng)。從時(shí)間-吸光度曲線來(lái)看，到達(dá)反應(yīng)終點(diǎn)或平衡點(diǎn)時(shí)，吸光度將不再變化。分析儀通常在反應(yīng)終點(diǎn)附近連續(xù)選擇兩個(gè)吸光度值，求出其平均值計(jì)算結(jié)果，并可根據(jù)兩點(diǎn)的吸光度差來(lái)判斷反應(yīng)是否到達(dá)反應(yīng)終點(diǎn)。終點(diǎn)法參數(shù)設(shè)置簡(jiǎn)單，反應(yīng)時(shí)間一般較長(zhǎng)，精密度較好。終點(diǎn)時(shí)間的確定：根據(jù)時(shí)間-吸光度曲線來(lái)確定，如Trinder反應(yīng)測(cè)定尿酸，反應(yīng)曲線上35min時(shí)其吸光度已趨向穩(wěn)定，因而可將5min作為反應(yīng)終點(diǎn)。根據(jù)被測(cè)物反應(yīng)終點(diǎn)，結(jié)合干擾物的反應(yīng)情況來(lái)確定，如在血清白蛋白的溴甲酚綠法測(cè)定中，白蛋白與溴甲酚綠在10s內(nèi)很快完成反應(yīng)，之后球蛋白和球蛋白與溴甲酚綠發(fā)生 慢反應(yīng)，使反應(yīng)曲線上吸光度在10s后仍繼續(xù)緩慢上升，持續(xù)約達(dá)10min，因此終點(diǎn)時(shí)間應(yīng)采用1030s，而不應(yīng)選擇10min。1一點(diǎn)終點(diǎn)法 ：在反應(yīng)到達(dá)終點(diǎn)，即在時(shí)間-吸光度曲線上吸光度不再改變時(shí)選擇一個(gè)終點(diǎn)吸光度值，這種方法稱為一點(diǎn)終點(diǎn)法（one point end essay），其反應(yīng)曲線見(jiàn)圖7-3。其檢測(cè)結(jié)果的計(jì)算公式是：待測(cè)物濃度CU=（待測(cè)吸光度AU試劑空白吸光度AB）K。 K為校準(zhǔn)系數(shù)，詳見(jiàn)第五節(jié)二操作方法。2兩點(diǎn)終點(diǎn)法 ：在被測(cè)物反應(yīng)或指示反應(yīng)尚未開(kāi)始時(shí)，選擇第一個(gè)吸光度，在反應(yīng)到達(dá)終點(diǎn)或平衡時(shí)選擇第二個(gè)吸光度，此兩點(diǎn)吸光度之差用于計(jì)算結(jié)果，稱為兩點(diǎn)終點(diǎn)法（two point end essay），其反應(yīng)曲線見(jiàn)圖7-4。計(jì)算公式為CU=（待測(cè)吸光度A2待測(cè)吸光度A1）K。該法能有效地消除溶血（hemolysis）、黃疸（icterus）和脂濁（lipo-turbid）等樣品本身光吸收（見(jiàn)圖7-5）造成的干擾。在單試劑分析加入試劑的初期、或雙試劑分析中第二試劑加入之初，若指示反應(yīng)吸光度尚未明顯變化，則可在此時(shí)選擇第一個(gè)吸光度，在指示反應(yīng)終點(diǎn)時(shí)選擇第二個(gè)吸光度，從而設(shè)置成兩點(diǎn)終點(diǎn)法。但指示反應(yīng)初期吸光度無(wú)明顯變化的化學(xué)反應(yīng)較少，如單試劑方式測(cè)定總蛋白、白蛋白、鈣、磷、鎂等的終點(diǎn)法分析項(xiàng)目，及雙試劑方式測(cè)定葡萄糖、總膽固醇、甘油三酯等的終點(diǎn)法分析項(xiàng)目，因反應(yīng)初期吸光度已有明顯變化，因而均難以用上述方式設(shè)置兩點(diǎn)終點(diǎn)法。但在雙試劑分析中，如果將第一吸光度選擇在第二試劑加入前，此時(shí)指示反應(yīng)一般尚未開(kāi)始，則能容易設(shè)置兩點(diǎn)終點(diǎn)法。在此要注意必須將兩次讀吸光度時(shí)不同比色液體積進(jìn)行校正。目前全自動(dòng)分析儀均具有此自動(dòng)校正功能，不必手工進(jìn)行校正。（二）固定時(shí)間法指在時(shí)間-吸光度曲線上選擇兩個(gè)測(cè)光點(diǎn)，此兩點(diǎn)既非反應(yīng)初始吸光度亦非終點(diǎn)吸光度，這兩點(diǎn)的吸光度差值用于結(jié)果計(jì)算，稱為固定時(shí)間法（fixed-time essay），反應(yīng)曲線見(jiàn)圖7-6。其計(jì)算公式與兩點(diǎn)終點(diǎn)法相同，為CU=(A2-A1)K。有時(shí)也稱此法為兩點(diǎn)法。該分析方法有助于解決某些反應(yīng)的非特異性問(wèn)題。例如：苦味酸法測(cè)定肌酐，反應(yīng)的最初30s內(nèi)，血清中快反應(yīng)干擾物（如微生物、丙酮酸、乙酰乙酸等）能與堿性苦味酸反應(yīng)；在第二個(gè)30s時(shí)堿性苦味酸主要與肌酐反應(yīng)，且此段時(shí)間吸光度曲線的線性較好（故也可用連續(xù)監(jiān)測(cè)法測(cè)定肌酐）；在80120s及其以后，堿性苦味可與蛋白質(zhì)以及其它慢反應(yīng)干擾物反應(yīng)。這樣選用反應(yīng)的第二個(gè)30s為測(cè)定時(shí)間，既避免了快反應(yīng)物質(zhì)的干擾，也避免了慢反應(yīng)物質(zhì)的影響，使肌酐濃度與吸光度變化呈良好的線性關(guān)系，有利于提高分析的特異性和準(zhǔn)確度。（三）連續(xù)監(jiān)測(cè)法連續(xù)監(jiān)測(cè)法（continuous monitoring essay）又稱速率法（rate essay），是在測(cè)定酶活性或用酶法測(cè)定代謝產(chǎn)物時(shí)，連續(xù)選取時(shí)間-吸光度曲線中線性期的吸光度值，并以此線性期的單位吸光度變化值（A/min）計(jì)算結(jié)果，見(jiàn)圖7-7A和B。所謂線性期就是各點(diǎn)吸光度差值相等，如圖7-7C所示，圖中1及5值偏小，而234，故A1點(diǎn)至A4點(diǎn)屬線性段。此線性期對(duì)底物來(lái)說(shuō)屬零級(jí)反應(yīng)，期間的A/min即為酶促反應(yīng)的初速度，其大小與被測(cè)酶活性成正比。連續(xù)監(jiān)測(cè)法的優(yōu)點(diǎn)即是可以確定線性期并計(jì)算A/min，根據(jù)此值再準(zhǔn)確地計(jì)算酶活性，因而使自動(dòng)生化分析儀在酶活性測(cè)定方面顯著地優(yōu)于手工法。連續(xù)監(jiān)測(cè)法也可用于測(cè)定呈線性反應(yīng)的代謝物濃度，一般是某些基于酶法測(cè)定的代謝物。酶活性（U/L）A/min理論（或校準(zhǔn)）K值，代謝物濃度CU=A/min校準(zhǔn)K值。關(guān)于理論K值和校準(zhǔn)K值敘述如下：1理論K值：多用于酶活性測(cè)定中，因酶活性尚無(wú)公認(rèn)的校準(zhǔn)品可用，因而根據(jù)酶活性的國(guó)際單位定義得出酶活性的計(jì)算公式為：酶活性 (U/L)=A/min ，將此式中 以K來(lái)表示，此K值可通過(guò)對(duì)已知值即指示物質(zhì)的毫摩爾消光系數(shù)（）、反應(yīng)液總?cè)萘浚═V）、樣品容量（SV）和比色杯光徑（d）計(jì)算后得出，即為理論K值，可作為分析參數(shù)輸入到分析儀中。采用理論K值的前提應(yīng)當(dāng)是樣品和試劑的加量準(zhǔn)確、比色杯光徑準(zhǔn)確、溫度控制精確以及波長(zhǎng)準(zhǔn)確等。但事實(shí)上由于各型分析儀在注射器容積步進(jìn)電機(jī)精度、濾光片帶寬等方面的差異，可造成樣品和試劑加量以及吸光度檢測(cè)的偏差。溫度的影響有時(shí)也非常大，由于反應(yīng)盤(pán)是半暴露的，因此隨著較冷試劑的加入，反應(yīng)盤(pán)中的溫度會(huì)逐漸降低，盡管開(kāi)始測(cè)定時(shí)反應(yīng)盤(pán)溫度已升到37C，但在某一項(xiàng)目測(cè)定過(guò)程的開(kāi)始階段，溫度可能達(dá)不到37C ，甚至僅35C左右，且反應(yīng)過(guò)程中仍有可能上下波動(dòng)，這對(duì)于酶學(xué)反應(yīng)來(lái)說(shuō)影響是很大的。如采用37C時(shí)的理論K值，將會(huì)使測(cè)定結(jié)果降低，溫度的波動(dòng)還會(huì)使得結(jié)果的重復(fù)性降低。當(dāng)然，若試劑在加入反應(yīng)杯前經(jīng)試劑臂內(nèi)加熱裝置預(yù)溫，則基本不影響反應(yīng)盤(pán)溫度。由于摩爾吸光系數(shù)受比色杯光徑、波長(zhǎng)、帶寬以及加樣系統(tǒng)的準(zhǔn)確性等的影響，書(shū)本上或試劑廠家提供的理論摩爾吸光系數(shù)可能與實(shí)際所用分析儀所測(cè)的不同，因而有必要獲得實(shí)際的摩爾吸光系數(shù)，然后用來(lái)計(jì)算的K值稱為實(shí)測(cè)K值。（1）NADH（NADPH）摩爾吸光系數(shù)的測(cè)定：NADH（NADPH）沒(méi)有標(biāo)準(zhǔn)純制品，而且配成溶液后穩(wěn)定性又較差，不能直接用NADH 或NADPH標(biāo)準(zhǔn)液來(lái)校正儀器，須通過(guò)有NAD+(NADP+)參與的反應(yīng)途徑。用已糖激酶 (HK)或葡萄糖脫氫酶(GD)方法測(cè)定葡萄糖時(shí)，葡萄糖的消耗與NADH的生成呈等摩爾關(guān)系。葡萄糖有標(biāo)準(zhǔn)純制品，又有國(guó)家批準(zhǔn)文號(hào)的葡葡糖標(biāo)準(zhǔn)液。因此，根據(jù)公式A=bC，已知比色杯光徑b和葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液濃度，測(cè)得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)管的吸光度A后便可計(jì)算出NADH（NADPH）的摩爾吸光系數(shù)為 A/bC。假設(shè)，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)液濃度為1Ommo1/L(0.01mol/L)，標(biāo)準(zhǔn)液加入量為3.5L，酶試劑加入量為335L，比色杯光徑為0.7cm，在340nm測(cè)得吸光度為0.465，則實(shí)測(cè)NADH摩爾吸光系數(shù)= 6424，即在此臺(tái)分析儀上340nm波長(zhǎng)處測(cè)得NADH（NADPH）的摩爾吸光系數(shù)為6424，而理論上NADH（NADPH）的為6220。（2）色素原酶促產(chǎn)物在405nm波長(zhǎng)摩爾吸光系數(shù)的測(cè)定：有許多酶底物為人工合成的色素原底物，其本身無(wú)色，經(jīng)酶作用后釋放出有色的反應(yīng)產(chǎn)物，在405nm波長(zhǎng)具有吸收峰。最常用色素原底物及其產(chǎn)物為: ALP測(cè)定以磷酸對(duì)硝基苯酚 (4-Nitrophenyl phosphate，4-NPP)為底物，經(jīng)酶作用后釋放出黃色的對(duì)硝基苯酚(4-Nitrophenol，4-NP)，GGT測(cè)定以-L-谷氨酰對(duì)硝基苯胺(-L-Glutamyl-p-nitroanilide)或-L-谷氨酰-3-羥基-對(duì)硝基苯胺(-L-Glut