衛(wèi)生微生物檢測(cè)方法.ppt

1 本章主要內(nèi)容 第一節(jié)衛(wèi)生微生物檢測(cè)的特點(diǎn)及基本原則第二節(jié)衛(wèi)生指示微生物第三節(jié)衛(wèi)生微生物研究和檢測(cè)的方法第四節(jié)衛(wèi)生微生物研究和檢測(cè)方法發(fā)展前景 2 第一節(jié)衛(wèi)生微生物學(xué)檢測(cè)的特點(diǎn)與基本原則 檢測(cè)特點(diǎn) 檢測(cè)對(duì)象 致病 非致病 條件致病微生物標(biāo)本來(lái)源 人體 環(huán)境環(huán)境中致病微生物數(shù)量少 需要特異的檢測(cè)方法 并且多依靠衛(wèi)生指示微生物檢測(cè)原則 樣品的采集原則樣品的運(yùn)送原則實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)原則 3 一 樣品的采集原則 一 樣品必須要有代表性 采樣量 滿足檢測(cè)要求采樣部位 均勻采樣采樣時(shí)間 便于分析微生物的動(dòng)態(tài)變化采樣批號(hào) 盡量檢測(cè)每個(gè)批號(hào) 4 二 避免對(duì)樣品的污染器材滅菌 無(wú)菌操作 三 避免對(duì)樣品中微生物的殺滅和抑制避免有毒物質(zhì)的殘留和高溫影響 四 對(duì)樣品進(jìn)行詳細(xì)的標(biāo)記這是基本要求 1 所有盛樣容器必須有和樣品一致的標(biāo)記 在標(biāo)記上應(yīng)記明產(chǎn)品標(biāo)志與號(hào)碼和樣品順序號(hào)以及其他需要說(shuō)明的情況 標(biāo)記應(yīng)牢固 具防水性 字跡不會(huì)被擦掉或脫色 2 當(dāng)樣品需要托運(yùn)或由非專職抽樣人員運(yùn)送時(shí) 必須封識(shí)樣品容器 5 二 樣品的運(yùn)送原則盡快送檢一般3 4h內(nèi)送檢 減少細(xì)菌死亡和進(jìn)一步繁殖帶來(lái)的影響 如不能及時(shí)運(yùn)送 應(yīng)根據(jù)樣品性質(zhì)采取常溫冷暗 0 4 冰箱 15 以下冰箱或冷藏庫(kù)內(nèi)保存 注意保護(hù)待檢的微生物一定的溫度加保護(hù)劑或去除不利因素運(yùn)送培養(yǎng)基 運(yùn)輸緩沖液 如病毒 厭氧菌等 6 根據(jù)生物安全規(guī)定 妥善包裝待運(yùn)輸?shù)臉?biāo)本進(jìn)行完善的樣品交接必須有樣品送檢單 與實(shí)驗(yàn)室人員逐項(xiàng)核對(duì)后交接 7 三 實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)原則 1 具有相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)室硬件設(shè)施WHO對(duì)微生物危害性的分級(jí)生物安全等級(jí) biosafetylevel BSL BSL 1 P1實(shí)驗(yàn)室 檢驗(yàn)非致病微生物 BSL 2 P2實(shí)驗(yàn)室 檢驗(yàn)一般致病微生物 BSL 3 P3實(shí)驗(yàn)室 可檢驗(yàn)特殊危險(xiǎn)致病微生物 BSL 4 P4實(shí)驗(yàn)室 可檢驗(yàn)危害性最嚴(yán)重的病原體 世衛(wèi)組織感染性微生物的危險(xiǎn)度等級(jí)分類 危險(xiǎn)度等級(jí)一級(jí)無(wú)或極低的個(gè)體和群體危險(xiǎn)不太可能引起人或動(dòng)物致病的微生物危險(xiǎn)度等級(jí)二級(jí)個(gè)體危險(xiǎn)中等 群體危險(xiǎn)低病原體能引起人或動(dòng)物的疾病 但不太可能對(duì)實(shí)驗(yàn)室工作人員 社區(qū) 牲畜或環(huán)境造成嚴(yán)重危害 實(shí)驗(yàn)室暴露也許會(huì)引起嚴(yán)重感染 但是對(duì)感染有有效的預(yù)防和治療措施感染傳播的危險(xiǎn)有限 世衛(wèi)組織感染性微生物的危險(xiǎn)度等級(jí)分類 危險(xiǎn)度等級(jí)三級(jí)個(gè)體危險(xiǎn)高 群體危險(xiǎn)低病原體通常能引起人或動(dòng)物的嚴(yán)重疾病 但一般不會(huì)發(fā)生感染個(gè)體向其他個(gè)體的傳播對(duì)感染有有效的預(yù)防和治療措施危險(xiǎn)度等級(jí)四級(jí)個(gè)體和群體的危險(xiǎn)均高病原體通常能引起人或動(dòng)物的嚴(yán)重疾病 并且很容易發(fā)生個(gè)體之間的直接或間接傳播一般沒(méi)有有效的預(yù)防和治療措施 BSL 1 不太可能引起人類疾病或獸醫(yī)學(xué)意義的無(wú)疾病安全措施 參照標(biāo)準(zhǔn)微生物學(xué)安全操作 標(biāo)準(zhǔn)預(yù)防措施 預(yù)期的安全設(shè)備 不需要 所以也不需要生物安全柜實(shí)驗(yàn)室設(shè)備要求 需要開(kāi)放實(shí)驗(yàn)臺(tái)和水槽 BSL 2 對(duì)群體中出現(xiàn)的中等危險(xiǎn)和人類疾病有關(guān)系的的微生物 危險(xiǎn)性在于皮膚損傷 攝食 黏膜暴露 這一防護(hù)級(jí)別代表的微生物為 金黃色葡萄球菌 沙門(mén)菌 輪狀病毒 甲型流感病毒 麻疹病毒等 安全措施 參照一級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室操作 進(jìn)入受限生物危害警告標(biāo)志 銳器 防范措施清除污染生物安全手冊(cè)預(yù)期的安全設(shè)備 在操作產(chǎn)生噴濺或氣溶膠的感染微生物時(shí) 使用驗(yàn)收過(guò)的物理防護(hù)設(shè)備 如I級(jí)或II級(jí)生物安全柜 BSL 2 PPE 個(gè)體防護(hù)裝備 根據(jù)需要穿戴實(shí)驗(yàn)室大褂 手套和面部保護(hù)用具 實(shí)驗(yàn)室設(shè)備要求 需要開(kāi)放實(shí)驗(yàn)臺(tái) 水槽和高壓滅菌器 BSL 2 高壓滅菌器 洗眼器 BSL 2 對(duì)本地或外來(lái)的呼吸傳播微生物 氣溶膠 以及可能引起嚴(yán)重的或潛在致命感染的微生物 這一防護(hù)級(jí)別代表的微生物為 結(jié)核桿菌 炭疽桿菌 霍亂弧菌 高致病性禽流感病毒 黃熱病病毒 艾滋病病毒等 重視環(huán)境和實(shí)驗(yàn)室人員的保護(hù)屏障 BSL 3 安全措施 參照二級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室操作 進(jìn)入控制全部廢棄物均清除污染實(shí)驗(yàn)室服裝在洗熨前須清除污染免疫血清基線預(yù)期的安全設(shè)備 對(duì)于所有開(kāi)放性微生物操作使用I級(jí)或II級(jí)生物安全柜 BSL 3 PPE 個(gè)體防護(hù)裝備 根據(jù)需要穿戴實(shí)驗(yàn)室大褂 手套和呼吸器 實(shí)驗(yàn)室設(shè)備要求 二級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室要求 實(shí)驗(yàn)室與公共走廊通道在物理上分開(kāi)門(mén)自動(dòng)關(guān)閉 雙門(mén)入口排出廢氣不可再循環(huán)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)負(fù)壓 BSL 3 對(duì)于危險(xiǎn)的或外來(lái)的微生物 它們是危及生命的很高個(gè)體危險(xiǎn) 通過(guò)氣溶膠或未知傳播風(fēng)險(xiǎn)的微生物進(jìn)行傳播 而且目前尚無(wú)疫苗或治療 這一防護(hù)級(jí)別代表的微生物為 天花病毒 埃博拉病毒 危險(xiǎn)性在于呼吸暴露接觸到傳染性的氣溶膠 黏膜 或是暴露的損傷皮膚接觸到傳染唾沫 BSL 4 安全措施 參照三級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室操作 進(jìn)入前更換衣服出口處淋浴離開(kāi)實(shí)驗(yàn)室時(shí) 全部物品都要清除污染預(yù)期的安全設(shè)備 全部操作程序均在III級(jí)生物安全柜內(nèi)進(jìn)行 或者穿正壓供氣的的連體防護(hù)服 Hazmat套服 并I級(jí)和II級(jí)生物安全柜 BSL 4 實(shí)驗(yàn)室設(shè)備要求 三級(jí)生物安全實(shí)驗(yàn)室要求 獨(dú)立的建筑或明確劃分出的隔離區(qū)域?qū)Ｓ眠M(jìn)排氣 真空和清除污染系統(tǒng)安全文件明確規(guī)定的其他附加要求重點(diǎn)防止活性微生物污染環(huán)境 BSL 4 微生物危險(xiǎn)度等級(jí)與生物安全水平 操作和設(shè)備的關(guān)系 GMT 微生物學(xué)操作技術(shù)規(guī)范 微生物危險(xiǎn)度等級(jí)與生物安全水平 操作和設(shè)備的關(guān)系 23 2 具有合格的人員和標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法人員要有資質(zhì) 并經(jīng)常接受培訓(xùn)采用國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法或公認(rèn)方法 WHO EPA等 3 加強(qiáng)實(shí)驗(yàn)室質(zhì)量控制儀器 設(shè)備 試劑 定期檢定和校準(zhǔn)注意記錄和核查 如GLP實(shí)驗(yàn)室報(bào)告規(guī)范 數(shù)據(jù)規(guī)范 完整簽名蓋章 三 實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)原則 4 實(shí)驗(yàn)室應(yīng)有應(yīng)急措施應(yīng)對(duì)突發(fā)事件能力需做多種檢驗(yàn)時(shí) 微生物優(yōu)先恰當(dāng)?shù)臉悠诽幚砼c檢驗(yàn) 24 三 實(shí)驗(yàn)室檢驗(yàn)原則 25 第二節(jié)衛(wèi)生檢驗(yàn)中的指示微生物 指示微生物 indicatormicroorganism 定義 在常規(guī)衛(wèi)生監(jiān)測(cè)中 用以指示檢品衛(wèi)生狀況及安全性的 非致病 微生物 或細(xì)菌 設(shè)定指示微生物的原因微生物 包括致病和非致病的 種類繁多 不可能一一檢測(cè)環(huán)境中致病微生物往往數(shù)量少 檢測(cè)困難 需要用相對(duì)易于檢測(cè)的微生物來(lái)間接反映 26 一 指示微生物的選擇 選擇原則數(shù)量大 易于檢出 方法簡(jiǎn)單 有代表性 指示微生物的種類 反映微生物綜合污染 細(xì)菌 霉菌和酵母菌落總數(shù)反映微生物污染來(lái)源 糞便污染指示菌 大腸菌群 糞大腸菌群等 空氣污染指示菌 溶血性鏈球菌等 不得檢出的致病微生物間接反映致病微生物 如反映腸道病毒的噬菌體等消毒效果指示菌 嗜熱脂肪芽孢桿菌 壓力蒸汽滅菌 短小芽孢桿菌 電離輻射滅菌 枯草桿菌黑色變種芽孢 環(huán)氧乙烷滅菌 27 二 常用的指示微生物 一 綜合污染指標(biāo) 菌落總數(shù)定義 單位量的被檢樣品 g ml cm2 m3 內(nèi) 所含有的能在某種培養(yǎng)基上經(jīng)一定條件 一定時(shí)間培養(yǎng)后生成的菌落數(shù)量 表述 細(xì)菌菌落總數(shù) 霉菌和酵母菌菌落總數(shù) cfu g cfu ml cfu colonyformingunit 意義 綜合判定檢樣被微生物污染程度 方法 標(biāo)準(zhǔn)平板計(jì)數(shù)法 表面涂布法 28 二 來(lái)源污染指標(biāo) 糞便 空氣污染指示菌 糞便污染指示菌的選擇標(biāo)準(zhǔn)是人及溫血?jiǎng)游锬c道正常菌群的組成部分 且數(shù)量大 在糞便污染的樣品中易檢出 未被污染的樣品中無(wú)此菌存在 排出體外后 在外環(huán)境存活時(shí)間與腸道致病菌大致相似或稍長(zhǎng) 在外環(huán)境中不繁殖 如作為飲用水的指示菌 對(duì)氯 臭氧等抵抗力應(yīng)不低于腸道致病菌或略強(qiáng) 檢驗(yàn)方法簡(jiǎn)便 易于檢出和計(jì)數(shù) 29 常見(jiàn)糞便污染指示菌 1 大腸菌群 coliformgroup 概念 指一群需氧的或兼性厭氧的 在35 37 24h培養(yǎng)能分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的G 無(wú)芽孢桿菌 種類 大腸埃希菌屬 枸櫞酸桿菌屬 腸桿菌屬 克雷伯菌屬 沙雷菌屬 變形桿菌屬某些種等 衛(wèi)生學(xué)意義評(píng)價(jià)檢樣衛(wèi)生質(zhì)量 推斷有無(wú)腸道致病菌污染 總大腸菌群 totalcoliform 37 培養(yǎng)生長(zhǎng)的大腸菌群 糞大腸菌群 fecalcoliform 耐熱大腸菌群 44 45 能發(fā)酵乳糖的大腸菌群 方法 發(fā)酵法 濾膜法 紙片法 30 大腸菌群作為指示菌的一些新問(wèn)題 大腸菌群 受損 對(duì)細(xì)菌計(jì)數(shù)的影響大腸埃希菌的致病性大腸菌群中某些細(xì)菌可以在外界繁殖大腸菌群的檢測(cè)范圍有限 水中大腸菌群 200cfu 100ml小腸結(jié)腸炎耶爾森菌陽(yáng)性率6 4 水中大腸菌群 200cfu 100ml小腸結(jié)腸炎耶爾森菌陽(yáng)性率8 9 31 2大腸埃希菌 Escherichaecoli 檢出意義最大鑒定方法較復(fù)雜藥品行業(yè)使用較多近年應(yīng)用較多 作為糞便污染指示菌 大腸埃希菌檢出意義最大 其次是耐熱大腸菌群 總大腸菌群再次 32 3 腸球菌 Enterococcus 糞鏈球菌 人及動(dòng)物腸道正常菌群 在人糞數(shù)量?jī)H次于大腸菌群細(xì)菌 動(dòng)物糞便中所占比例高 對(duì)惡劣環(huán)境抵抗力較強(qiáng) 營(yíng)養(yǎng)水體繁殖力低于大腸菌群 單獨(dú)檢查不能作為糞便污染的決定性指標(biāo) 但可提供有價(jià)值的補(bǔ)充材料 判斷污染來(lái)源 方法 耐熱大腸菌群與腸球菌之比 4 1污染來(lái)源人耐熱大腸菌群與腸球菌之比 0 7污染來(lái)源動(dòng)物耐熱大腸菌群與腸球菌之比4 1 0 7混合來(lái)源 33 4產(chǎn)氣莢膜梭菌 Costirdia G 有芽孢 還原亞硫酸鹽的厭氧桿菌 外界環(huán)境抵抗力較強(qiáng) 不適合作為主要指標(biāo) 但可提供有價(jià)值的補(bǔ)充材料 特別適合水樣不能及時(shí)送檢 或在含有有毒物質(zhì) 氯 的環(huán)境中檢測(cè)是否有過(guò)糞便污染 產(chǎn)氣莢膜梭菌 大腸菌群 新近污染產(chǎn)氣莢膜梭菌 大腸菌群 陳舊污染 34 常見(jiàn)空氣污染指示菌 口腔和鼻腔的鏈球菌 無(wú)人居住的房屋空氣中沒(méi)有鏈球菌 房屋內(nèi)住人越多 鏈球菌的含量亦越高 一般用草綠色鏈球菌與溶血性鏈球菌合起來(lái)計(jì)算 35 三 不得檢出的致病菌 36 四 間接反映致病微生物存在的指示菌 腸道病毒指示微生物的條件 檢驗(yàn)方法簡(jiǎn)單操作安全在被人腸道病毒污染的環(huán)境中一定存在 數(shù)量等于或大于腸道病毒的數(shù)目對(duì)于消毒劑和外環(huán)境的抵抗力應(yīng)與腸道病毒一致或稍強(qiáng) 37 腸道病毒的指示微生物 38 第三節(jié)衛(wèi)生微生物研究和檢測(cè)的方法 一 樣品的處理 二 損傷菌的復(fù)蘇 三 選擇性增菌與分離 四 定量計(jì)數(shù)方法 五 分型鑒定的方法 六 其他分子生物學(xué)方法 39 混勻樣品 非常重要 液體 電動(dòng)混勻 手搖混勻 敲打混勻固體 攪碎混勻 研磨混勻 勻漿混勻樣品濃縮沉淀法過(guò)濾法吸附沉淀法 一 樣品的處理 40 環(huán)境樣品微生物 在采樣送檢等過(guò)程中 受各種不利因素作用 可發(fā)生亞致死性損傷 用普通培養(yǎng)方法不容易培養(yǎng) 需預(yù)先進(jìn)行復(fù)蘇 resuscitation 或修復(fù) repair 才能培養(yǎng) 無(wú)選擇壓力的培養(yǎng)環(huán)境較低的培養(yǎng)溫度 二 損傷菌的復(fù)蘇 41 檢測(cè)的困難 微生物小 少 混合 選擇方法 抑制其它微生物生長(zhǎng) 促進(jìn)目標(biāo)微生物生長(zhǎng)物理方法 厭氧條件培養(yǎng)厭氧菌 光照條件培養(yǎng)藻類等化學(xué)方法 根據(jù)微生物的營(yíng)養(yǎng)需求 加入特制的促進(jìn)或抑制生長(zhǎng)的物質(zhì) 三 對(duì)目的菌的選擇性增菌與分離 42 四 微生物定量計(jì)數(shù)法 43 一 傾注平板法10倍