丙型肝炎病毒核酸定量測定試劑盒說明書.doc

丙型肝炎病毒核酸定量測定試劑盒（PCR-熒光法）說明書精品文檔交流【產(chǎn)品名稱】通用名：丙型肝炎病毒核酸定量測定試劑盒（PCR-熒光法）英文名：PCR-Fluorescence Detection Kit for Hepatitis C Virus RNA漢語拼音：Bingxing Ganyan Bingdu Hesuan Dingliang Ceding Shijihe （PCR -Yingguang fa）【包裝規(guī)格】 32人份/盒【預(yù)期用途】本試劑盒用于丙型肝炎的輔助診斷及療程監(jiān)控?！驹砗蛻?yīng)用】本試劑盒利用一對丙型肝炎病毒（HCV）的特異性引物，一條特異性熒光探針，采用逆轉(zhuǎn)錄酶、耐熱DNA聚合酶（Taq酶）、四種單體核苷酸（dNTPs）等成分，并應(yīng)用RT-PCR技術(shù)實現(xiàn)對HCV RNA保守基因的擴增，同時通過外標(biāo)的方法實現(xiàn)對血清或血漿中的丙型肝炎病毒進行定量檢測。本試劑盒可作為丙型肝炎的輔助診斷及療程監(jiān)控。【試劑盒組成】組成成分規(guī)格樣本處理試劑 裂解液DEPC水（無Rnase和Dnase的水）核酸擴增試劑 RT-PCR主反應(yīng)液酶混合液 熒光探針對照品 陰性對照 強陽性對照（非感染性體外轉(zhuǎn)錄RNA） 107106IU/ml 臨界陽性對照（非感染性體外轉(zhuǎn)錄RNA） 104103 IU/ml校準(zhǔn)品* 定量校準(zhǔn)品1# （1.0-8.0）104IU/ml 定量校準(zhǔn)品2# （1.0-8.0）105IU/ml 定量校準(zhǔn)品3# （1.0-8.0）106IU/ml 定量校準(zhǔn)品4# （1.0-8.0）107IU/ml4ml2400ul1 1ml120ul114 ul1350ul1350ul1350ul150ul150ul150ul150ul1* 定量校準(zhǔn)品具體的參數(shù)根據(jù)批號不同而不同。詳見試劑盒內(nèi)給定值?！緝Υ鏃l件及有效期】裂解液為黃色液體，保存于4；其他試劑目測為透明液體，保存于-20，不宜反復(fù)凍融，使用前應(yīng)在室溫下完全融化，并充分振蕩混勻后稍事離心；所有試劑應(yīng)避光保存；有效期十二個月?！咀詡湮锲贰?. 自備試劑（分析純）氯仿、異丙醇（-20預(yù)冷）、75%乙醇（用不含Rnase和Dnase的水配制，-20預(yù)冷）2. 自備儀器高速臺式冷凍離心機、移液槍、一次性耗材（無酶吸頭、離心管、手套、帽子等）、專用工作服、工作鞋、辦公用品等?！具m用儀器】PE-5700，PE-7000，PE-7300，PE-7700，Icycler定量熒光PCR儀【樣本要求】1. 樣本種類：血清或血漿血清以新鮮采集分離為好，采血6小時內(nèi)必須分離、收集血清，并將血清轉(zhuǎn)移至一次性使用無RNA酶的無菌微量離心管中。血漿不能用肝素作抗凝劑。2. 樣本儲存：待測樣本在2-8保存不應(yīng)超過24hr，-20保存不應(yīng)超過三個月，-70以下可長期保存。3. 避免反復(fù)凍融（最多凍融三次）。4. 樣本運輸：在冷凍狀態(tài)下運輸。【使用方法】1. 樣本處理（樣本處理區(qū)）取n個1.5ml無RNA酶的離心管（n=樣本數(shù)+1管強陽性對照+1管臨界陽性對照+1管陰性對照），作好標(biāo)記。在上述每一管中加入待測樣本血清、強陽性對照、臨界陽性對照、陰性對照各100ul，然后再各加入300ul裂解液，盡快用吸頭反復(fù)吸打或輕微振蕩混勻（每樣本換用一個吸頭），再加入100ul氯仿，振蕩混勻5sec或顛倒混勻15次（以無肉眼可見的白色塊狀沉淀為準(zhǔn)；注意不宜過于強烈，避免產(chǎn)生乳化層影響分層）。13000rpm離心10min（注意固定離心管方向，有條件的可在4離心，下同）。取與步驟1相同數(shù)量的離心管，各加入200ul異丙醇（-20預(yù)冷），作好標(biāo)記。吸取步驟3各管中的上清轉(zhuǎn)移至相應(yīng)的管中（在盡量吸盡上清的同時注意不要吸取中間層），顛倒混勻。13000rpm離心10min（注意固定離心管方向）。輕輕倒去上清或用吸頭吸干液體，加入500ul75%乙醇，顛倒洗滌。13000rpm離心5min（注意固定離心管方向），輕輕倒去上清或用吸頭吸干液體。7500rpm離心5sec（注意固定離心管方向），用吸頭盡量吸干被甩至管底的殘余液體（一份樣本換一個吸頭，注意吸頭不要碰到有沉淀的一面），室溫干燥1-5min（干燥時間隨殘余液體的吸干程度而不同，以沉淀表面無肉眼可見水珠為準(zhǔn)；不宜過分干燥，以免RNA不溶）。各加入10ulDEPC水，輕輕混勻，溶解管壁上的RNA，稍微離心，冰上保存?zhèn)溆茫ㄕ堅?小時內(nèi)用于PCR擴增），暫時不用時保存于-20，時間不應(yīng)超過3天。2. 擴增試劑準(zhǔn)備（PCR前準(zhǔn)備期）從試劑盒中取出RT-PCR主反應(yīng)液、酶混合液和熒光探針，在室溫下融化并振蕩混勻簡短離心。每個測試反應(yīng)體系配制如下：試劑RT-PCR主反應(yīng)液酶混合液熒光探針用量（ul）290.60.4計算好各試劑使用量，加入一適當(dāng)體積離心管中，充分混勻，簡短離心，向設(shè)定的n個（n=樣本數(shù)+1管強陽性對照+1管臨界陽性對照+1管陰性對照+4個校準(zhǔn)品）PCR反應(yīng)管中分別加入30ul，轉(zhuǎn)移至樣本處理區(qū)。3. 加樣（樣本處理區(qū)）在PCR反應(yīng)管中分別加入步驟2.9.中制備的RNA溶液及定量校準(zhǔn)品（1-4）各10ul，蓋緊管蓋，簡短離心，將反應(yīng)管放入熒光PCR檢測儀中，記錄樣本擺放順序。4. RT-PCR反應(yīng)（檢測區(qū)）：步驟循環(huán)數(shù)溫度()反應(yīng)時間(min:sec)114230:0021953:003595105530721:004409556030熒光信號的收集定為FAM，數(shù)據(jù)的采集定在60?！窘Y(jié)果分析】1. 結(jié)果分析條件設(shè)定:使用 ABI PRISM 7000熒光PCR檢測儀進行結(jié)果分析時基線（baseline）取6-10或6-15個循環(huán)的熒光信號；閾值（threshold）設(shè)定原則以基線剛好超過陰性對照品擴增曲線的最高點，且Ct值=40為準(zhǔn)。定量標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)應(yīng)達0.97以上。2. 質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)2.1 本試劑盒的定量線性范圍：103測定結(jié)果108IU/ml。2.2 將校準(zhǔn)品1-4的濃度輸入，儀器自動以定量質(zhì)控參考品的拷貝數(shù)的對數(shù)值為橫坐標(biāo)，以其實際測得的Ct值為縱坐標(biāo)給出標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)應(yīng)0.970，否則實驗無效。2.3 陰性對照測定結(jié)果為0，Ct值一欄顯示為undet。2.4 強、臨界陽性對照的定量結(jié)果在試劑盒提示的規(guī)定允許范圍內(nèi)。3. 結(jié)果判斷3.1 對于103測定結(jié)果108IU/ml的樣本，提示本次測定結(jié)果在試劑盒有效定量檢測線性范圍內(nèi)?？芍苯訄蟾鏀?shù)據(jù)。3.2 對于測定結(jié)果108IU/ml的樣本，提示病毒含量高于試劑盒定量檢測線性范圍上限，所測結(jié)果僅供參考，報告上注明108IU/ml。如需精確定量，可根據(jù)所測結(jié)果，將該標(biāo)本用陰性血清稀釋至試劑盒測定范圍內(nèi)復(fù)測。3.3 對于500測定結(jié)果103IU/ml的樣本，提示病毒含量低于試劑盒定量檢測線性范圍下限，所測結(jié)果僅供參考，報告上注明103IU/ml，并謹(jǐn)慎跟蹤隨訪。3.4 測定結(jié)果為0（Ct值一欄為undet）的標(biāo)本為HCV RNA陰性標(biāo)本【檢驗方法的局限性】血漿樣本不能用肝素作抗凝劑。 不能直接作為臨床確診依據(jù)，僅供臨床醫(yī)生參考使用?！驹噭┖行阅堋繖z測限度為500IU/ml。 定量檢測范圍為1.01038.0108IU/ml。本試劑盒對HAV、HBV、HIV、HDV、TTV、CT、NG、HSV、HPV、UU、TB標(biāo)本均無非特異性擴增。經(jīng)過對臨床常見高濃度膽紅素、血紅蛋白、血脂血漿樣本的系統(tǒng)研究，此類樣本不影響本試劑盒的定量檢測結(jié)果。經(jīng)實驗驗證，血漿樣本以EDTA、檸檬酸鈉、草酸鈉或ACD液抗凝，檢驗結(jié)果不受影響?！咀⒁馐马棥?. 待測新鮮血清標(biāo)本若不及時檢測，應(yīng)保存于-20或-70。2. 試劑盒各組分使用前應(yīng)充分融化混勻，離心數(shù)秒后使用。3. PCR操作各階段應(yīng)嚴(yán)格分區(qū)操作。如：PCR前準(zhǔn)備區(qū): 準(zhǔn)備擴增所需試劑樣本處理區(qū): 處待測樣本和對照品檢測區(qū): PCR擴增檢測4. 在試劑和標(biāo)本準(zhǔn)備階段應(yīng)分別使用負壓超凈臺和生物安全柜以免污染。5. 應(yīng)穿專用工作服，戴一次性手套并經(jīng)常替換，使用一次性用品。6. PCR操作人員應(yīng)具有經(jīng)驗和受過培訓(xùn)。7. 操作過程中用到的超凈臺、移液器、離心機、等儀器設(shè)備應(yīng)經(jīng)常用10%次氯酸或70%酒精或紫外燈消毒。8. 使用本試劑盒檢測的標(biāo)本具有傳染性物質(zhì)，請按傳染病實驗室檢查規(guī)程操作。9. 本試劑盒僅用于體外輔助診斷。【生產(chǎn)單位】企業(yè)名稱：艾康生物技術(shù)（杭州）有限公司地址：浙江省杭州市天目山路398號古蕩經(jīng)濟園區(qū)郵政編碼：310023電話號碼真號碼址：.