DNA提取及常見問題分析解析.ppt

核酸提取及常見問題分析 一 DNA 主講人 張蕾09年8月12日 第二部分 DNA提取方法簡介 第三部分 DNA提取常見問題 原因分析及其對策 內(nèi)容 第一部分 前言 核酸是遺傳信息的載體 是最重要的生物信息分子 是分子生物學(xué)研究的主要對象 因此核酸的提取是分子生物學(xué)實驗技術(shù)中最重要 最基本的操作 前言 第二部分 DNA提取方法簡介 DNA提取的幾種方法 基因組DNA的提取 CTAB法SDS法其它 線粒體 葉綠體DNA的提取 差速離心結(jié)合SDS裂解法 基因組DNA CTAB法 CTAB法原理 植物DNA提取經(jīng)典方法 CTAB hexadecyltrimethylammoniumbromide 十六烷基三甲基溴化銨 是一種陽離子去污劑 可溶解細(xì)胞膜 并與核酸形成復(fù)合物 該復(fù)合物在高鹽溶液中 0 7mol LNaCl 是可溶的 通過有機(jī)溶劑抽提 去除蛋白 多糖 酚類等雜質(zhì)后加入乙醇沉淀即可使核酸分離出來 注 CTAB溶液在低于15 時會形成沉淀析出 因此在將其加入冰冷的植物材料之前必須預(yù)熱 CTAB提取緩沖液的經(jīng)典配方 Tris HCl pH8 0 提供一個緩沖環(huán)境 防止核酸被破壞 EDTA螯合Mg2 或Mn2 離子 抑制DNase活性 NaCl提供一個高鹽環(huán)境 使DNP充分溶解 存在于液相中 CTAB溶解細(xì)胞膜 并結(jié)合核酸 使核酸便于分離 巰基乙醇是抗氧化劑 有效地防止酚氧化成醌 避免褐變 使酚容易去除 基因組DNA CTAB法 CTAB提取緩沖液的改進(jìn)配方 PVP 聚乙烯吡咯烷酮 是酚的絡(luò)合物 能與多酚形成一種不溶的絡(luò)合物質(zhì) 有效去除多酚 減少DNA中酚的污染 同時它也能和多糖結(jié)合 有效去除多糖 基因組DNA CTAB法 CTAB法流程圖 植物材料 裂解液 上層溶液 液氮研磨 抽提 細(xì)胞裂解 干燥溶解 離心洗滌 酒精沉淀 DNA溶液 基因組DNA CTAB法 SDS法原理 基因組DNA SDS法 SDS是一種陰離子去垢劑 在高溫 55 65 條件下能裂解細(xì)胞 使染色體離析 蛋白變性 釋放出核酸 提高鹽 KAc或NH4Ac 濃度并降低溫度 冰浴 使蛋白質(zhì)及多糖雜質(zhì)沉淀 離心后除去沉淀 上清液中的DNA用酚 氯仿抽提 反復(fù)抽提后用乙醇沉淀水相中的DNA SDS法DNA提取緩沖液 SDS法流程圖 以動物組織為例 基因組DNA SDS法 基因組DNA 其它方法 物理方式 玻璃珠法 超聲波法 研磨法 凍融法化學(xué)方式 異硫氰酸胍法 堿裂解法生物方式 酶法 根據(jù)細(xì)胞裂解方式的不同有 基因組DNA 其它方法 吸附材料結(jié)合法 根據(jù)核酸分離純化方式的不同有 硅質(zhì)材料陰離子交換樹脂磁珠 高鹽低pH值結(jié)合核酸 低鹽高pH值洗脫 快捷高效 低鹽高pH值結(jié)合核酸 高鹽低pH值洗脫 適用于純度要求高的實驗 磁性微粒掛上不同基團(tuán)可吸附不同的目的物 從而達(dá)到分離目的 基因組DNA 其它方法 濃鹽法 有機(jī)溶劑抽提法 密度梯度離心法 利用RNP和DNP在鹽溶液中溶解度不同 將二者分離 有機(jī)溶劑作為蛋白變性劑 同時抑制核酸酶的降解作用 利用不同內(nèi)容物密度不同的原理分離各種內(nèi)容物 細(xì)胞器DNA 差速離心法 差速離心法原理 是利用物質(zhì)比重的不同分離混合物的一種方法 將待分離物質(zhì)置于均勻介質(zhì) 蔗糖 中 以一定的轉(zhuǎn)速進(jìn)行離心 比重大的物質(zhì)優(yōu)先沉降 比重小的卻處于上層 從而得以分離 線粒體和葉綠體是生物體內(nèi)半自主性細(xì)胞器 自身可編碼蛋白 它們的比重和大小一定 因而在同一離心場內(nèi)的沉降速度也一定 根據(jù)這一原理 常用不同轉(zhuǎn)速的離心法 將細(xì)胞內(nèi)各種組分分級分離出來 第二部分 DNA提取常見問題 原因分析及其對策 第三部分 DNA提取常見問題 原因分析及其對策 DNA提取的基本步驟 I 材料準(zhǔn)備II 破碎細(xì)胞或包膜 內(nèi)容物釋放III 核酸分離 純化IV 沉淀或吸附核酸 并去除雜質(zhì)V 核酸溶解在適量緩沖液或水中 材料準(zhǔn)備 最好使用新鮮材料 低溫保存的樣品材料不要反復(fù)凍融提取血液基因組DNA時 要選擇有核細(xì)胞 白細(xì)胞 組培細(xì)胞培養(yǎng)時間不能過長 否則會造成DNA降解含病毒的液體材料DNA含量較少 提取前先富集 基因組DNA的提取 細(xì)胞裂解 材料應(yīng)適量 過多會影響裂解 導(dǎo)致DNA量少 純度低針對不同材料 選擇適當(dāng)?shù)牧呀忸A(yù)處理方式 植物材料 液氮研磨動物組織 勻漿或液氮研磨組培細(xì)胞 蛋白酶K細(xì)菌 溶菌酶破壁酵母 破壁酶或玻璃珠高溫溫浴時 定時輕柔振蕩 基因組DNA的提取 核酸分離 純化 采用吸附材料吸附的方式分離DNA時 應(yīng)提供相應(yīng)的緩沖體系采用有機(jī) 酚 氯仿 抽提時應(yīng)充分混勻 但動作要輕柔離心分離兩相時 應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時間針對不同材料的特點 在提取過程中輔以相應(yīng)的去雜質(zhì)的方法 基因組DNA的提取 核酸分離 純化 蛋白質(zhì)的去除 酚 氯仿抽提使用變性劑變性 SDS 異硫氰酸胍等 高鹽洗滌蛋白酶處理 多糖的去除 高鹽法 用乙醇沉淀時 在待沉淀溶液中加入1 2體積的5MNaCl 高鹽可溶解多糖 用多糖水解酶將多糖降解 在提取緩沖液中加一定量的氯苯 1 2體積 氯苯可以與多糖的羥基作用 從而去除多糖 用PEG8000代替乙醇沉淀DNA 在500 LDNA液中加入200 l20 PEG8000 含1 2MNaCl 冰浴20min 核酸分離 純化 多酚的去除 在抽提液中加入防止酚類氧化的試劑 巰基乙醇 抗壞血酸 半胱氨酸 二硫蘇糖醇等加入易與酚類結(jié)合的試劑 如PVP PEG 聚乙二醇 它們與酚類有較強(qiáng)的親和力 可防止酚類與DNA的結(jié)合 核酸分離 純化 鹽離子的去除 70 的乙醇洗滌 核酸沉淀 溶解 當(dāng)沉淀時間有限時 用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀 沉淀會更充分沉淀時加入1 10體積的NaAc pH5 2 3M 有利于充分沉淀沉淀后應(yīng)用70 的乙醇洗滌 以除去鹽離子等晾干DNA 讓乙醇充分揮發(fā) 不要過分干燥 若長期儲存建議使用TE緩沖液溶解TE中的EDTA能螯和Mg2 或Mn2 離子 抑制DNasepH值為8 0 可防止DNA發(fā)生酸解 基因組DNA的提取 DNA中含有蛋白 多糖 多酚類雜質(zhì)DNA在溶解前 有酒精殘留 酒精抑制后續(xù)酶解反應(yīng)DNA中殘留有金屬離子 重新純化DNA 去除蛋白 多糖 多酚等雜質(zhì) 具體方法見前 重新沉淀DNA 讓酒精充分揮發(fā)增加70 乙醇洗滌的次數(shù) 2 3次 DNA提取常見問題 問題一 DNA樣品不純 抑制后續(xù)酶解和PCR反應(yīng) 原因 對策 材料不新鮮或反復(fù)凍融未很好抑制內(nèi)源核酸酶的活性提取過程操作過于劇烈 DNA被機(jī)械打斷外源核酸酶污染反復(fù)凍融 盡量取新鮮材料 低溫保存材料避免反復(fù)凍融液氮研磨或勻漿組織后 應(yīng)在解凍前加入裂解緩沖液在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料的DNA時 可增加裂解液中螯合劑的含量細(xì)胞裂解后的后續(xù)操作應(yīng)盡量輕柔所有試劑用無菌水配制 耗材經(jīng)高溫滅菌將DNA分裝保存于緩沖液中 避免反復(fù)凍融 DNA提取常見問題 問題二 DNA降解 對策 原因 實驗材料不佳或量少破壁或裂解不充分沉淀不完全洗滌時DNA丟失 盡