昆蟲(chóng)sf9細(xì)胞培養(yǎng).docx

。Sf9培養(yǎng)要點(diǎn)：溫度：27-28攝氏度pH：，sf9最適的pH6.2，隨培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)，Ph值會(huì)增加傳代時(shí)間：72h（三天左右）細(xì)胞來(lái)源：Sf9（貨號(hào)B825-01）和Sf21（貨號(hào)B821-01）細(xì)胞系是傳統(tǒng)的用于桿狀病毒表達(dá)的細(xì)胞系，源于美國(guó)農(nóng)業(yè)部昆蟲(chóng)病理實(shí)驗(yàn)室。此細(xì)胞系適用于InsectSelect系統(tǒng)。這兩株細(xì)胞衍生于IPLBSF-21細(xì)胞系，來(lái)源于秋蠅蠕蟲(chóng)（草地夜蛾）蛹的卵巢組織。（以上來(lái)自invitrogen）細(xì)胞特點(diǎn)：規(guī)則的帶有顆粒球形。貼壁緊。標(biāo)準(zhǔn)條件的定義：培養(yǎng)最低密度：0.6106/ml（健康對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞活率至少應(yīng)不低于90?；盥实陀?0細(xì)胞不是在最佳條件下培養(yǎng)不能用于實(shí)驗(yàn)）1106/mL將出現(xiàn)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)狀態(tài)傳代培養(yǎng)：傳代培養(yǎng)需將細(xì)胞調(diào)整到維持對(duì)數(shù)生長(zhǎng)狀態(tài)和最大活率。貼壁培養(yǎng): 貼壁細(xì)胞傳代需在細(xì)胞長(zhǎng)成單層（如下定義）然后1：5（細(xì)胞體積：最后培養(yǎng)基體積）稀釋維持對(duì)數(shù)生長(zhǎng)。形成單層細(xì)胞可以傳代培養(yǎng)懸浮培養(yǎng)：在細(xì)胞密度達(dá)到2.0106-2.5106細(xì)胞/mL后將密度調(diào)整至0.7106-1.0106細(xì)胞/mL進(jìn)行懸浮傳代。確保傳代細(xì)胞密度不高于4106個(gè)/mL或保持密度高于1106個(gè)/mL以達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)狀態(tài)。Sf9懸浮培養(yǎng)所需要的細(xì)胞數(shù)培養(yǎng)基：sf-900 SFM（添加2%的血清減小感染過(guò)程中蛋白水解量）培養(yǎng)瓶與培養(yǎng)體積：凍存：一旦細(xì)胞系建立且倍增規(guī)律則可以進(jìn)行凍存。細(xì)胞需達(dá)到90活率和80-90融合的要求（如：低代次）推薦凍存幾管。當(dāng)融解細(xì)胞，它將會(huì)達(dá)到最佳使用狀態(tài)。1. 用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)細(xì)胞。需要足夠的如上表所示密度的細(xì)胞凍存2-4管。細(xì)胞可是懸浮或貼壁培養(yǎng)；2. 將無(wú)菌凍存管立于冰上，做好標(biāo)記；3. 室溫400-600g離心10min。移除上清。4. 以給定的密度在凍存液中重懸細(xì)胞；5. 移取1mL細(xì)胞懸液置于無(wú)菌凍存管中；6. 置于-201h，然后移至-8024-48h；7. 儲(chǔ)存于液氮中。轉(zhuǎn)染的細(xì)胞：需要的是對(duì)數(shù)期的細(xì)胞95%發(fā)育能力，可以完成成功的轉(zhuǎn)染。載氧：對(duì)于最優(yōu)生長(zhǎng)條件和蛋白的表達(dá)，昆蟲(chóng)細(xì)胞要求被動(dòng)的通氧。積極的通氧系統(tǒng)要求溶氧飽和在10%-50%Sf900II和sf900的區(qū)別：一般推薦Sf900II來(lái)大量表達(dá)蛋白Sf900II含有表面活性劑（剪切力保護(hù)劑（保護(hù)細(xì)胞在轉(zhuǎn)瓶中培養(yǎng)時(shí)不會(huì)受到剪切力傷害）當(dāng)設(shè)計(jì)純化多聚組氨酸標(biāo)簽蛋白的計(jì)劃時(shí)，注意無(wú)血清培養(yǎng)基不能直接用于螯合樹(shù)脂，因?yàn)榕囵B(yǎng)基的成分會(huì)除去樹(shù)脂中的鎳離子。細(xì)胞培養(yǎng)的一般順序：復(fù)蘇傳代傳代穩(wěn)定凍存應(yīng)當(dāng)遵循的一般過(guò)程：復(fù)蘇貼壁培養(yǎng)懸浮懸浮擴(kuò)大培養(yǎng)（產(chǎn)生目標(biāo)蛋白）（也可不經(jīng)過(guò)貼壁培養(yǎng)，直接懸浮培養(yǎng)）貼壁時(shí)間：45min懸浮的轉(zhuǎn)速：80rpm附：離心機(jī)rcf與g的換算：無(wú)血清培養(yǎng)基可以選擇性加入一定的抑菌劑防止細(xì)菌或者真菌污染：培養(yǎng)基：GIBCO-SFM900 加青霉素鏈霉素抑制細(xì)菌生長(zhǎng)兩性霉素B抑