第十三章 細(xì)胞的衰老與凋亡.doc

第十三章 細(xì)胞的衰老與凋亡 教學(xué)目的：1 掌握細(xì)胞衰老與凋亡的概念2 探討細(xì)胞衰老及凋亡的機(jī)理教學(xué)重點(diǎn)：影響細(xì)胞凋亡的因素教學(xué)難點(diǎn)：細(xì)胞凋亡的機(jī)理講授法第一節(jié) 細(xì)胞衰老概 述 細(xì)胞衰老的研究只是整個(gè)衰老生物學(xué)（老年學(xué)，人類學(xué)）研究中的一部分。所謂衰老生物學(xué)（biology of senescence）（或稱老年學(xué)，gerontology）是研究生物衰老的現(xiàn)象、過程和規(guī)律。其任務(wù)是要揭示生物（人類）衰老的特征，探索發(fā)生衰老的原因和機(jī)理，尋找推遲衰老的方法，根本目的在于延長生物（人類）的壽命。多細(xì)胞有機(jī)體細(xì)胞，依壽命長短不同可劃分為兩類，即干細(xì)胞和功能細(xì)胞。干細(xì)胞在整個(gè)一生都保持分裂能力，直到達(dá)到最高分裂次數(shù)便衰老死亡。如表皮生發(fā)層細(xì)胞，生血干細(xì)胞等。一、 早期的細(xì)胞衰老研究100年前，魏斯曼曾提出種質(zhì)不死而體質(zhì)會(huì)衰老和死亡的學(xué)說，后來，Carrel和Ebeling認(rèn)為細(xì)胞本身不會(huì)衰老,衰老是由于環(huán)境的影響造成的。特別是20世紀(jì)40-50年代，由于L系小鼠細(xì)胞和Hela細(xì)胞系的建立，又使細(xì)胞不死性的觀點(diǎn)更加鞏固。直到60年代初，Hayflick等人的出色工作對細(xì)胞不死的觀點(diǎn)徹底動(dòng)搖了。二、Hayflick界限Hayflick通過對不同生物的胚成纖維細(xì)胞的體外培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)物種壽命和培養(yǎng)細(xì)胞壽命之間存在著確切的相互關(guān)系。Hayflick巧妙的設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，進(jìn)一步證明了決定細(xì)胞衰老的因素在細(xì)胞內(nèi)部，而不是外部環(huán)境。取老年男性個(gè)體的細(xì)胞（間期無巴氏小體）和年輕女性個(gè)體的細(xì)胞（間期有巴氏小體）進(jìn)行單獨(dú)或混合培養(yǎng)，并統(tǒng)計(jì)其倍增次數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，混合培養(yǎng)中的兩類細(xì)胞的倍增次數(shù)與各自單獨(dú)培養(yǎng)時(shí)相同，即在同一培養(yǎng)液，當(dāng)年輕細(xì)胞旺盛增殖的同時(shí)，年老細(xì)胞就停止生長了；年輕細(xì)胞的胞質(zhì)體與年老的完整細(xì)胞融合時(shí)，得到的雜種細(xì)胞不能分裂；年老細(xì)胞的胞質(zhì)體與年輕的完整細(xì)胞融合時(shí)，雜種細(xì)胞的分裂能力幾乎與年輕細(xì)胞相同。充分說明決定細(xì)胞的衰老是細(xì)胞核，而不是細(xì)胞質(zhì)。體外培養(yǎng)的細(xì)胞，不是不死的，而是有一定壽命的，它們的增殖能力不是無限的，而是有一定的界限。即Hayflick界限。從而引出了細(xì)胞最高分裂次數(shù)的問題。三、細(xì)胞在體內(nèi)條件下的衰老在機(jī)體內(nèi)，細(xì)胞的衰老和死亡是常見的現(xiàn)象，甚至在個(gè)體發(fā)育的早期也會(huì)發(fā)生；正常情況下終生保持分裂的細(xì)胞，其分裂能力也表現(xiàn)出隨著有機(jī)體年齡的增高而下降；衰老動(dòng)物體內(nèi)，細(xì)胞分裂速度顯著減慢，其原因主要是G1期明顯延長；衰老個(gè)體內(nèi)的環(huán)境因素影響了細(xì)胞的增殖和衰老；骨髓干細(xì)胞移植實(shí)驗(yàn)說明隨著年齡的增加，干細(xì)胞增殖速度也趨緩慢.四、衰老細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化（一）生活細(xì)胞的基本特征（二）衰老細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化1 細(xì)胞核的變化：核膜內(nèi)折，染色質(zhì)固縮，核仁不規(guī)則。2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的變化：年輕動(dòng)物：RER 發(fā)育好、排列有序；年老動(dòng)物：RER彌散、總量減少。3 線粒體的變化：數(shù)量隨齡減少，體積隨齡增大。由于線粒體是細(xì)胞呼吸和氧化的中心，有人稱它是決定細(xì)胞衰老的生物鐘。而有些研究者則認(rèn)為線粒體不是衰老的啟動(dòng)者，而是受害者。4 致密體（脂褐質(zhì)）的生成：是由溶酶體或線粒體轉(zhuǎn)化而來的。它是自由基誘發(fā)的脂質(zhì)過氧化作用的產(chǎn)物。5 膜系統(tǒng)的變化：目前資料表明，膜的改變確實(shí)與衰老有密切關(guān)系，年輕的功能健全的細(xì)胞膜是典型的液晶相。6 細(xì)胞骨架體系的變化：7 高爾基體和溶酶體的變化：數(shù)量隨衰老明顯增多。8 蛋白質(zhì)合成的變化：合成速率降低。五、細(xì)胞衰老的分子機(jī)制（原因及假說）從古到今，人們對衰老的機(jī)理有各種各樣的理解，提出了數(shù)不清的假說和理論，據(jù)統(tǒng)計(jì)，迄今為止曾提出過的衰老假說和理論竟多達(dá)300種以上！這數(shù)百條思路，除了完全的謬誤之外，多是從不同角度和深度反映了衰老這一復(fù)雜過程的某一側(cè)面或?qū)哟?。直?0年代以來，其分子機(jī)制的研究才有了重大進(jìn)展，比如單基因的突變導(dǎo)致壽命的顯著延長、端粒和端粒酶與細(xì)胞衰老關(guān)系的發(fā)現(xiàn)等。下面介紹60年代起開始出現(xiàn)的一系列衰老理論。（一）氧化性損傷學(xué)說（自由基理論）Harman50年代（1956）提出。認(rèn)為衰老的一條重要的途徑是因自由基脂質(zhì)的過氧化而引起細(xì)胞功能的多方面異常。（二）端粒與衰老 發(fā)現(xiàn)端粒長度確實(shí)與衰老有著密切的關(guān)系，提出細(xì)胞衰老的“有絲分裂鐘”學(xué)說（Harley,1990）。端粒由富含G、C簡單重復(fù)順序所組成，其長度隨細(xì)胞衰老過程而逐漸縮短，但端粒酶卻可維持端粒的長度。（三）rDNA與衰老 酵母染色體外rDNA 環(huán)（ERC）的積累，導(dǎo)致細(xì)胞衰老。（四）沉默信息調(diào)節(jié)蛋白復(fù)合物與衰老 Sir complex 存在于異染色質(zhì)區(qū)，其作用在于阻斷所在位點(diǎn)DNA轉(zhuǎn)錄。（五）SGS1基因、WRN基因與衰老 SGS1基因和WRN基因同源,編碼解旋酶;酵母sgs1突變體壽命明顯短于野生型（平均9.5代:24.5代）; wrn突變引發(fā)早老癥。（六）發(fā)育程序與衰老（七）線粒體DNA與衰老 Sen-DNA(80年代);mtDNA突變積累與細(xì)胞衰老有關(guān)。（八）衰老因子積累說，亦稱“蛋白質(zhì)合成差錯(cuò)成災(zāi)說”Megbegeeb（1962）orgel（1973）提出，認(rèn)為有缺陷的酶干擾復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯等水平錯(cuò)誤積累直至成災(zāi)（九）基因調(diào)節(jié)Smith假說衰老細(xì)胞+年輕細(xì)胞異質(zhì)雙核細(xì)胞（年輕細(xì)胞核DNA合成受抑制）衰老細(xì)胞+Hela細(xì)胞異核體（衰老細(xì)胞被誘導(dǎo)合成DNA）說明：1衰老細(xì)胞產(chǎn)生了DNA合成抑制劑，穿過胞質(zhì)，影響正常年輕細(xì)胞核中DNA合成。2Hela細(xì)胞則不受這種抑制劑的影響，相反，它們產(chǎn)生DNA合成起始因子，并誘導(dǎo)衰老細(xì)胞核的DNA合成。大腦的衰老中心：近年來：Franks，F(xiàn)inch等，提出在大腦存在一個(gè)“衰老控制中心”，這就是神經(jīng)內(nèi)分泌軸（下丘腦垂體內(nèi)分泌系統(tǒng)）調(diào)控機(jī)體各種生理功能。六、細(xì)胞死亡細(xì)胞死亡是細(xì)胞衰老的結(jié)果，是細(xì)胞生命現(xiàn)象的終止。包括急性死亡（細(xì)胞壞死）和程序化死亡（細(xì)胞凋亡）。細(xì)胞死亡最顯著的現(xiàn)象，是原生質(zhì)的凝固。事實(shí)上細(xì)胞死亡是一個(gè)漸進(jìn)過程，要決定一個(gè)細(xì)胞何時(shí)已死亡是較因難的。除非用固定液等人為因素瞬間使其死亡。那么，怎樣鑒定一個(gè)細(xì)胞是否死亡了呢？通常采用活體染色法來鑒定。如用中性紅染色時(shí)，生活細(xì)胞只有液泡系染成紅色，如果染料擴(kuò)散，細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核都染成紅色，則標(biāo)志這個(gè)細(xì)胞已死亡。七、關(guān)于人類的衰老和壽命問題人類壽命有無極限？極限是多少？抗衰老，求長壽，古往今來，人之常情，時(shí)至今日，更為人們所關(guān)注。研究表明：1哺乳動(dòng)物自然壽命為生長發(fā)育期的57倍，借此推論，人類完成生長發(fā)育約在2022周歲，自然壽命應(yīng)是100150歲。2哺乳動(dòng)物的自然壽命為性成熟的810倍。3海弗里克（Hayflick）：人體細(xì)胞可進(jìn)行50次左右有絲分裂，每次細(xì)胞周期為24年，這樣推論，人的壽命應(yīng)在120歲左右。1 遺傳與人類壽命：先天性，父輩主宰。父、母享有高壽，其子女往往也是高壽者。2 壽命與性別有關(guān)：人壽保險(xiǎn)公司統(tǒng)計(jì)說明，性動(dòng)物性動(dòng)物，女人男人，為什么？眾說紛紜。3 環(huán)境與人類壽命：后天因素多樣錯(cuò)綜復(fù)雜。體魄、環(huán)境、心理、社會(huì)、營養(yǎng)、疾病等。其中營養(yǎng)及體力活動(dòng)較為重要。4 職業(yè)與人類壽命： 職業(yè)作為一種重要的社會(huì)因素，對人類壽命有一定的影響。日本統(tǒng)計(jì)，從事管理工作人員，平均壽命最長，依次為國家機(jī)關(guān)工作人員、專業(yè)技術(shù)人員、商業(yè)工作人員、農(nóng)業(yè)工作人員、一般生產(chǎn)工人、體力勞動(dòng)者、礦工?？偟谜f來，近20年來，細(xì)胞衰老的研究取得了長足的進(jìn)步，但離開真正揭示細(xì)胞衰老的本質(zhì)，還要走很長的路。一旦揭開了細(xì)胞衰老的秘密，那么延緩衰老，延長壽命將成為可能，但辯證唯物主義告訴我們，真正的長生不老是不可能的。我們研究了解細(xì)胞衰老死亡規(guī)律，目的并不是為了避免死亡，而是要延緩細(xì)胞衰老的到來。我們謳歌生命，也不必詛咒死亡，有生必有死，無死亦無生，我們不贊成死亡，但長生不死是進(jìn)化和發(fā)展的敵人。但愿我們每個(gè)人都能較長時(shí)間生活在這個(gè)美好的世界，為人類的進(jìn)步與文明做更多的貢獻(xiàn)。第二節(jié) 細(xì)胞凋亡(Apoptosis)一、細(xì)胞凋亡的概念及其生物學(xué)意義概念：細(xì)胞凋亡是一個(gè)主動(dòng)的由基因決定的自動(dòng)結(jié)束生命的過程，所以也常常被稱為細(xì)胞編程死亡（programmed cell death,PCD）。凋亡細(xì)胞將被吞噬細(xì)胞吞噬。這一假說是基于Hayflick界限提出的：1961年Hayflick根據(jù)人胚胎細(xì)胞的傳代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)提出。指細(xì)胞在發(fā)育的一定階段出現(xiàn)正常的自然死亡，它與細(xì)胞的病理死亡有根本的區(qū)別。生物學(xué)意義：細(xì)胞凋亡對于多細(xì)胞生物個(gè)體發(fā)育的正常進(jìn)行，自穩(wěn)平衡的保持以及抵御外界各種因素的干擾方面都起著非常關(guān)鍵的作用。例如：蝌蚪尾的消失，骨髓和腸的細(xì)胞凋亡，脊椎動(dòng)物的神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，發(fā)育過程中手和足的成形過程。二、細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)和生物化學(xué)特征（一）細(xì)胞凋亡與壞死(necrosis)二者的主要區(qū)別是，細(xì)胞凋亡過程中，細(xì)胞質(zhì)膜反折，包裹斷裂的染色質(zhì)片段或細(xì)胞器，然后逐漸分離，形成眾多的凋亡小體（apoptotic bodies），凋亡小體則為鄰近的細(xì)胞所吞噬。整個(gè)過程中，細(xì)胞質(zhì)膜的整合性保持良好，死亡細(xì)胞的內(nèi)容物不會(huì)逸散到胞外環(huán)境中去，因而不引發(fā)炎癥反應(yīng)。相反，在細(xì)胞壞死時(shí)，細(xì)胞質(zhì)膜發(fā)生滲漏，細(xì)胞內(nèi)容物，包括膨大和破碎的細(xì)胞器以及染色質(zhì)片段，釋放到胞外，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)（二）細(xì)胞凋亡的形態(tài)學(xué)特征1 凋亡的起始：細(xì)胞表面的特化結(jié)構(gòu)如微絨毛消失，細(xì)胞間接觸的消失，但細(xì)胞膜依然完整；線粒體大體完整，但核糖體逐漸從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上脫離，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)囊腔膨脹，并逐漸與質(zhì)膜融合；染色質(zhì)固縮，形成新月形帽狀結(jié)構(gòu)等形態(tài)，沿著核膜分布。2 凋亡小體的形成：核染色質(zhì)斷裂為大小不等的片段，與某些細(xì)胞器如線粒體一起聚集，為反折的細(xì)胞質(zhì)膜所包圍。細(xì)胞表面產(chǎn)生了許多泡狀或芽狀突起，逐漸形成單個(gè)的凋亡小體。3 凋亡小體逐漸為鄰近的細(xì)胞吞噬并消化（三）細(xì)胞凋亡的生化特征1 細(xì)胞凋亡的主要特征是形成大小為180200bp特征性的DNA ladders。2 凋亡細(xì)胞組織轉(zhuǎn)谷氨酰胺酶tTGtissue Transglutaminase）積累并達(dá)到較高水平。（四）誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的因子1 物理性因子：包括射線（紫外線，? 射線等），較溫和的溫度刺激（如熱激，冷激）等。2 化學(xué)及生物因子：包括活性氧基團(tuán)和分子，DNA和蛋白質(zhì)合成的抑制劑，激素，細(xì)胞生長因子，腫瘤壞死因子?（TNF?），抗Fas/Apo-1/CD95抗體等。（五）細(xì)胞凋亡的檢測形態(tài)學(xué)觀測：染色法、透射和掃描電鏡觀察DNA電泳：DNA片段就呈現(xiàn)出梯狀條帶TUNEL測定法，即DNA斷裂的原位末端標(biāo)記法彗星電泳法（comet assay）流式細(xì)胞分析：根據(jù)凋亡細(xì)胞DNA斷裂和丟失，采用碘化丙啶使DNA產(chǎn)生激發(fā)熒光，用流式細(xì)胞儀檢出凋亡的亞二倍體細(xì)胞，同時(shí)又能觀察細(xì)胞的周期狀態(tài)。三、細(xì)胞凋亡的分子調(diào)控機(jī)理（一）Caspase家族與凋亡1 Caspase家族 Caspase活性位點(diǎn)是半胱氨酸(Cysteine)，裂解靶蛋白位點(diǎn)是天冬氨酸殘基后的肽鍵，因此稱為Cysteine aspartic acic specific protease，即Caspase。2 Caspase活化 Caspase自身以非活化的Procaspase存在，其激活依賴于其他的Caspase在它的天冬氨酸位點(diǎn)裂解活化或自身活化。3 胞外信號分子誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡途徑（凋亡信號通路）當(dāng)細(xì)胞接受凋亡信號分子(Fas,TNF等)后，凋亡細(xì)胞表面信號分子受體相互聚集并與細(xì)胞內(nèi)的銜接蛋白(Adaptor protein)結(jié)合，這些銜接蛋白又募集Procaspases聚集在受體部位，Procaspase相互活化并產(chǎn)生級聯(lián)反應(yīng)，使細(xì)胞凋亡。下游Caspases活化后，作用底物：裂解核纖層蛋白，導(dǎo)致細(xì)胞核形成凋亡小體；裂解DNase結(jié)合蛋白，使DNase釋放，降解DNA形成DNA Ladder；裂解參與細(xì)胞連接或附著的骨架和其他蛋白，使凋亡細(xì)胞皺縮、脫落，便于細(xì)胞吞噬；導(dǎo)致膜脂PS重排，便于吞噬細(xì)胞識別并吞噬。（二）Bcl-2、線粒體與細(xì)胞凋亡（待修改補(bǔ)充）Bcl-2是一種原癌基因，是ced-9在哺乳類中的同源物，能抑制細(xì)胞凋亡。Bcl-2蛋白的羧基末端有一穿膜的結(jié)構(gòu)域，可與線粒體及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜相結(jié)合。Bcl-2家族成員的基因中，常常含有三個(gè)