醫(yī)學(xué)分子生物學(xué).doc

學(xué)習(xí)資料收集于網(wǎng)絡(luò)，僅供參考醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)名詞解釋：結(jié)構(gòu)基因(structural genes)：可被轉(zhuǎn)錄形成 mRNA，并轉(zhuǎn)譯成多肽鏈，構(gòu)成各種結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)，催化各種生化反應(yīng)的酶和激素等。 ORF 開放閱讀框架（ open reading frame，ORF ）：是指DNA鏈上，由蛋白質(zhì)合成的起始密碼開始，到終止密碼為止的一個(gè)連續(xù)編碼。 C值(C-value)：一種生物體單倍體基因組DNA的總量，用以衡量基因組的大小。 C值矛盾/ C值悖論：C值和生物結(jié)構(gòu)或組成的復(fù)雜性不一致的現(xiàn)象。基因組（genome）：是指生物體全套遺傳信息，包括所有基因和基因間的區(qū)域 重疊基因是指同一段DNA片段能夠參與編碼兩種甚至兩種以上的蛋白質(zhì)分子。SNP單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism）是由基因組DNA上的單個(gè)堿基的變異引起的DNA序列多態(tài)性。是人群中個(gè)體差異最具代表性的DNA多態(tài)性，相當(dāng)一部分還直接或間接與個(gè)體的表型差異、對(duì)疾病的易感性或抵抗能力、對(duì)藥物的反應(yīng)性等相關(guān)。SNP被認(rèn)為是一種能穩(wěn)定遺傳的早期突變 蛋白質(zhì)組(proteomics):指應(yīng)用各種技術(shù)手段來(lái)研究蛋白質(zhì)組的一門新興科學(xué)，其目的是從整體的角度分析細(xì)胞內(nèi)動(dòng)態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成成份、表達(dá)水平與修飾狀態(tài)，了解蛋白質(zhì)之間的相互作用與聯(lián)系，揭示蛋白質(zhì)功能與細(xì)胞生命活動(dòng)規(guī)律.質(zhì)譜技術(shù)mass spectrometry,MS樣品分子離子化后，根據(jù)不同離子間質(zhì)核比（m/z）的差異來(lái)分離并確定分子量開放閱讀框=ORF基因工程又稱為重組DNA技術(shù)，是指將外源基因通過(guò)體外重組后導(dǎo)入受體細(xì)胞，并使其能在受體細(xì)胞內(nèi)復(fù)制和表達(dá)的技術(shù)。限制性核酸內(nèi)切酶(restriction endonuclease, RE)是一類能識(shí)別和切割雙鏈DNA特定核苷酸序列的核酸水解酶。逆轉(zhuǎn)錄酶依賴RNA的DNA聚合酶，它以RNA為模板、4種dNTP為底物，催化合成DNA，其功能主要有：1)逆轉(zhuǎn)錄作用；2)核酸酶H的水解作用；3)依賴DNA的DNA聚合酶作用。粘性末端被限制酶切割后突出的部分就是粘性末端（來(lái)自360問(wèn)答）載體vector指能攜帶外源DNA片段導(dǎo)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增或表達(dá)的工具。載體的本質(zhì)為DNA。多克隆位點(diǎn)載體上具有多個(gè)限制酶的單一切點(diǎn)（即在載體的其他部位無(wú)這些酶的相同切點(diǎn)）稱為多克隆位點(diǎn)報(bào)告基因（reporter gene）：是指處于待測(cè)基因下游并通過(guò)轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平來(lái)反映上游待測(cè)基因功能的基因，又稱報(bào)道基因。轉(zhuǎn)化以質(zhì)粒DNA或以它為載體構(gòu)建的重組子導(dǎo)入細(xì)菌的過(guò)程稱為轉(zhuǎn)化（transformation）感受態(tài)細(xì)胞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)改變、通透性增加并具有攝取外源DNA能力的細(xì)胞稱謂感受態(tài)細(xì)胞(competent cell)。堿裂解法在NaOH提供的高pH（12.012.6）條件下，用強(qiáng)陽(yáng)離子去垢劑SDS破壞細(xì)胞壁，裂解細(xì)胞，與NaOH共同使宿主細(xì)胞的蛋白質(zhì)與染色體DNA發(fā)生變性，釋放出質(zhì)粒DNA。 核酸變性變性（denaturation）:在某些理化因素的作用下，維系DNA分子二級(jí)結(jié)構(gòu)的氫鍵和堿基堆積力受到破壞，DNA由雙螺旋變成單鏈過(guò)程。核酸復(fù)性復(fù)性（renaturation）：指變性 DNA 在適當(dāng)條件下，二條互補(bǔ)鏈全部或部分恢復(fù)到天然雙螺旋結(jié)構(gòu)的現(xiàn)象，它是變性的一種逆轉(zhuǎn)過(guò)程 核酸分子雜交（molecular hybridization）:兩條DNA鏈或兩條RNA鏈或一條DNA鏈和一條RNA鏈按堿基互補(bǔ)的原則締合成異質(zhì)雙鏈的過(guò)程稱為分子雜交或核酸分子雜交。融解溫度（ melting temperature，Tm）：在熱變性過(guò)程中，紫外吸收增加值達(dá)到最大值的50%時(shí)的溫度稱為DNA的解鏈溫度或融解溫度退火（annealing）：熱變性DNA一般經(jīng)緩慢冷卻后即可復(fù)性，此過(guò)程稱之為“退火”。 核酸探針（nucleic acid probe)：是指能與特定核苷酸序列發(fā)生特異性互補(bǔ)雜交，雜交后可用特殊方法檢測(cè)的已知被標(biāo)記的核酸分子。Northern雜交Northern印跡(Northern blot)雜交是應(yīng)用DNA探針檢測(cè)特異mRNA的另一種膜上印跡技術(shù)Southern雜交 一種經(jīng)典的膜上檢測(cè)DNA的雜交技術(shù)。通常是指通過(guò)吸附或電泳方法將經(jīng)凝膠電泳分離的DNA從膠上轉(zhuǎn)移到固相載體上，再與特定的核酸探針?lè)磻?yīng)從而達(dá)到檢測(cè)或鑒定DNA的過(guò)程。熒光原位雜交（fluorescence in-situ hybridization, FISH）是一種利用非放射性的熒光信號(hào)對(duì)原位雜交樣本進(jìn)行檢測(cè)的技術(shù)。 PCR聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR） 技術(shù)：是利用針對(duì)目的DNA序列設(shè)計(jì)的一對(duì)特異引物，以目的DNA序列為模板，在耐熱的DNA聚合酶作用下，經(jīng)過(guò)多次“變性-復(fù)性-延伸反應(yīng)”的循環(huán)過(guò)程，體外擴(kuò)增目的DNA序列的技術(shù)。巢式PCR：是指使用兩對(duì)引物，外引物用于擴(kuò)增含目的DNA片段的大片段，擴(kuò)增產(chǎn)物作為內(nèi)引物的模板進(jìn)一步擴(kuò)增目的DNA片段的技術(shù)。逆轉(zhuǎn)錄PCR（反轉(zhuǎn)錄PCR，reverse transcription PCR，RT-PCR）：是指在逆轉(zhuǎn)錄酶作用下，先將模板RNA逆轉(zhuǎn)錄為互補(bǔ)DNA（cDNA），再以cDNA為模板通過(guò)PCR進(jìn)行DNA擴(kuò)增的技術(shù)。 多重PCR該技術(shù)是在一個(gè)反應(yīng)體系中加入多對(duì)引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段，由于每對(duì)引物擴(kuò)增的片段長(zhǎng)度不同，可用電泳加以鑒別TD PCR根據(jù)引物Tm值，選定一個(gè)退火溫度范圍（跨越10-20的溫度范圍，引物Tm值在這個(gè)范圍之內(nèi)）。在設(shè)置循環(huán)參數(shù)時(shí)，讓退火溫度從選定范圍的最高溫度開始，逐步降低退火溫度（每次降低1-5），最后結(jié)束在選定范圍的最低溫度。在每一個(gè)退火溫度上循環(huán)2-5次。熒光定量PCRFluorescence Quantitive Polymerase Chain Reaction，F(xiàn)Q-PCR）是通過(guò)對(duì)PCR擴(kuò)增反應(yīng)每個(gè)循環(huán)結(jié)束時(shí)產(chǎn)物熒光信號(hào)的檢測(cè)，對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析的技術(shù)。問(wèn)答題高等動(dòng)物線粒體基因組的特點(diǎn)？1、母系遺傳。子代線粒體基因組來(lái)自母親，父系的線粒體基因組在精卵結(jié)合時(shí)一般不能進(jìn)入卵細(xì)胞。因此，在子代個(gè)體發(fā)育過(guò)程中沒有父母雙方線粒體DNA的重組發(fā)生。2、線粒體DNA損傷后不易修復(fù)，突變率較高，可能與衰老及某些疾病有關(guān)。3、遺傳密碼與通用遺傳密碼存在差別，如UGA（終止密碼子）編碼Trp，AGA/AGG（Arg）為終止密碼子，AUA（Ile）為起始密碼子并編碼Met。 真核生物與原核生物基因組的區(qū)別？1）真核生物基因分布在多個(gè)染色體上，而原核生物只一個(gè)染色體。2）真核生物在基因組轉(zhuǎn)錄后的絕大部分前體RNA必須經(jīng)過(guò)剪接過(guò)程才能形成成熟的mRNA，而原核生物的基因幾乎不需要轉(zhuǎn)錄后加工。3）真核生物細(xì)胞中DNA與組蛋白和大量非組蛋白結(jié)合，并有核膜將其與細(xì)胞質(zhì)隔離，結(jié)果真核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄和翻譯在時(shí)間上和空間上都是分離的，而原核細(xì)胞的基因轉(zhuǎn)錄和翻譯是同步的。4）真核生物的基因是不連續(xù)的，中間存在不被翻譯的內(nèi)含子序列，而原核生物幾乎每一個(gè)基因都是完整的連續(xù)的DNA片段。何謂斷裂基因，簡(jiǎn)述其基本性質(zhì)？斷裂基因：基因的編碼序列在DNA上不是連續(xù)的，而是被不編碼的序列隔開。性質(zhì)：1）外顯子在基因中的排列順序和它在成熟mRNA產(chǎn)物中的排列順序是相同的，2）某種斷裂基因在所有組織中都有相同的內(nèi)含子成分，3）核基因的內(nèi)含子的可讀框通常含無(wú)義密碼子，沒有編碼功能。4）通常內(nèi)含子上發(fā)生的突變不能影響蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，其突變對(duì)生物體沒有影響；但也有例外。簡(jiǎn)述SNP研究的意義？（來(lái)自百度）SNP的應(yīng)用范圍較微衛(wèi)星標(biāo)記更加寬廣，對(duì)群體遺傳學(xué)、制藥業(yè)、法醫(yī)學(xué)、癌癥及遺傳性疾病甚至進(jìn)化的研究都產(chǎn)生不可估量的影響。人們希望通過(guò)研究SNP圖譜，更深刻的認(rèn)識(shí)癌癥、糖尿病、血管性疾病和某些精神性疾病等發(fā)病率高的多基因疾病的發(fā)病機(jī)制。1、 遺傳病致病基因連鎖定位。2、 SNP與藥物遺傳學(xué)和藥物基因組學(xué):個(gè)性化用藥何謂蛋白質(zhì)組學(xué)？請(qǐng)介紹目前蛋白質(zhì)組學(xué)研究中最常用的基本技術(shù)流程并簡(jiǎn)述其原理？1、蛋白質(zhì)組學(xué)(proteomics): 指應(yīng)用各種技術(shù)手段來(lái)研究蛋白質(zhì)組的一門新興科學(xué)，其目的是從整體的角度分析細(xì)胞內(nèi)動(dòng)態(tài)變化的蛋白質(zhì)組成成份、表達(dá)水平與修飾狀態(tài)，了解蛋白質(zhì)之間的相互作用與聯(lián)系，揭示蛋白質(zhì)功能與細(xì)胞生命活動(dòng)規(guī)律.2、基于凝膠的工作流程是目前使用的較為廣泛的、發(fā)展最為成熟的工作流程 ：雙向電泳的流程主要包括：1）樣品制備；2）第一向等電聚焦；3）第二向SDS-PAGE；4）凝膠上蛋白的檢測(cè)；5)蛋白的軟件的檢測(cè)。3、雙向凝膠電泳(two-dimensional electrophoresis，2-DE)的原理：利用蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)與分子量差異分離之。第一向：變性等電聚焦電泳，根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)進(jìn)行分離；第二向：SDS聚丙烯酰胺電泳，根據(jù)蛋白質(zhì)分子量進(jìn)行分離。簡(jiǎn)要介紹酵母雙雜交技術(shù)的原理及其用途？酵母雙雜交系統(tǒng)（Yeast two-hybrid system）的原理：1、典型的真核轉(zhuǎn)錄因子都含有二個(gè)結(jié)構(gòu)域: DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域（DNA binding domain，DNA-BD）和 轉(zhuǎn)錄激活結(jié)構(gòu)域（activation domain，AD） 。 2、二個(gè)結(jié)構(gòu)域功能上相互獨(dú)立又互相依賴，只有結(jié)合才具完整活性。 3、酵母雙雜交系統(tǒng)利用雜交基因通過(guò)激活報(bào)道基因的表達(dá)探測(cè)蛋白蛋白的相互作用。 用途(來(lái)自課本P42-43)1、 利用酵母雙雜交發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)功能2、 利用酵母雙雜交在細(xì)胞內(nèi)研究抗原和抗體的相互作用3、 利用酵母雙雜交篩選藥物的作用位點(diǎn)以及藥物對(duì)蛋白質(zhì)之間相互作用的影響4、 利用酵母雙雜交建立基因組蛋白連鎖圖簡(jiǎn)單介紹質(zhì)粒及其在分子生物學(xué)研究中的應(yīng)用？質(zhì)粒（plasmid）是指細(xì)菌染色體以外的小分子環(huán)狀雙鏈DNA，能自我復(fù)制和表達(dá)其攜帶的遺傳信息。質(zhì)?？寺≥d體的主要用途： 用于保存和擴(kuò)增 2Kb目的DNA。 構(gòu)建cDNA文庫(kù)。 目的DNA的測(cè)序。 作為核酸雜交時(shí)的探針來(lái)源。作為克隆載體的質(zhì)粒應(yīng)具備哪些特點(diǎn)？（來(lái)自360問(wèn)答）用作克隆載體的理想質(zhì)粒一般具備下述特點(diǎn)：具有松馳型復(fù)制子（如ColE1），復(fù)制子（replicon）是質(zhì)粒自我增殖所必不可少的基本條件，并可協(xié)助維持使每個(gè)細(xì)胞含有一定數(shù)量的質(zhì)粒拷貝。在復(fù)制子外存在幾個(gè)單一的酶切位點(diǎn)（或多克隆位點(diǎn)），以便目的DNA片段插入。具有插入失活的篩選標(biāo)記，理想的質(zhì)粒載體應(yīng)具有兩種抗菌素抗性標(biāo)志，如氨芐青霉素抗性基因（Ampr）和四環(huán)素抗性基因（Tetr）等，以便從平板中直接篩選陽(yáng)性重組子。分子量相對(duì)較小和較高的拷貝數(shù)。此外，質(zhì)粒的缺點(diǎn)是容量較小，一般只能接受小于15kb的外來(lái)DNA，插入片段過(guò)大會(huì)導(dǎo)致重組子擴(kuò)增速度減慢，甚至使插入片段失活。主要是對(duì)目的基因克隆，建立DNA文庫(kù)和cDNA文庫(kù)，其上有復(fù)制子即可。簡(jiǎn)述分子克隆技術(shù)的基本步驟？一、目的基因的獲取二、載體的選擇三、目的基因和載體的酶切與連接四、重組DNA導(dǎo)入受體細(xì)胞五、重組體的篩選和鑒定 簡(jiǎn)述藍(lán)白斑篩選實(shí)驗(yàn)的原理？b-半乳糖苷酶基因失活篩選（藍(lán)白斑篩選）： 使用的載體帶有大腸桿菌的DNA短區(qū)段，含有b-半乳糖苷酶基因（lacZ）的調(diào)控序列和N端146個(gè)氨基酸的編碼信息，這個(gè)編碼區(qū)中插入了一個(gè)多克隆位點(diǎn)，它并不破壞讀框，宿主細(xì)胞攜帶編碼b-半乳糖苷酶C端部分序列，雖然宿主和質(zhì)粒的片段各自都沒有酶活性，但能融為一體，形成具有活性的酶蛋白質(zhì)- b-半乳糖苷酶，這種互補(bǔ)現(xiàn)象叫a互補(bǔ)，在生色物質(zhì)X-gal和IPTG存在下形成藍(lán)色菌落，但在外源基因插入到多克隆位點(diǎn)后，破壞了質(zhì)粒載體b-半乳糖苷基因讀框，不能編碼b-半乳糖苷酶，就形成白色菌落。如何進(jìn)行基因組DNA的提取、純化和鑒定？1、 生物樣本預(yù)處理：粉碎組織、理解細(xì)胞，DNA釋放、蛋白質(zhì)沉淀降解。2、 分離：酚抽提法、甲酰胺解聚法、玻璃纏繞法、異丙醇沉淀法。3、 純化：對(duì)基因組DNA粗品通過(guò)透析、層析、電泳（PAG、AGE、PFGE）、選擇性沉淀等方法提取特定DNA片段，并通過(guò)柱層析、有機(jī)溶劑抽提等方法沉淀、洗滌、得到基因組DNA純品。4、 鑒定：濃度鑒定、純度鑒定、完整性鑒定。簡(jiǎn)述寡核苷酸探針的設(shè)計(jì)原則？設(shè)計(jì)原則：1、 探針長(zhǎng)度：一般要求在1050bp 2、 GC含量為4060 3、 探針?lè)肿又袘?yīng)避免互補(bǔ)序列 4、 避免同一堿基連續(xù)出現(xiàn)，一般不能多于4個(gè)，如GGGG-或 -CCCC- 5、借助計(jì)算機(jī)相應(yīng)軟件與已知的各種基因序列進(jìn)行同源性比較 理想的探針標(biāo)記物應(yīng)具有哪些特點(diǎn)？理想的探針標(biāo)記物應(yīng)具有以下特點(diǎn)1、 檢測(cè)物要靈敏、特異、穩(wěn)定、簡(jiǎn)便2、 標(biāo)記物與探針結(jié)合后，應(yīng)不影響雜交反應(yīng)，尤其是雜 交特異性、穩(wěn)定性和Tm值3、 標(biāo)記物對(duì)環(huán)境污染小，對(duì)人體無(wú)損傷，價(jià)格低廉4、標(biāo)記物對(duì)檢測(cè)方法無(wú)干擾。 核酸分子雜交的影響因素有哪些？1、探針的選擇；2、探針的標(biāo)記方法；3、探針的濃度；4、雜交反應(yīng)溫度；5、雜交反應(yīng)時(shí)間；6、洗膜溫度；7、雜交液。PCR的原理是什么？PCR體系需具備哪些要素？原理：1、PCR技術(shù)實(shí)際上是模擬體內(nèi)DNA半保留復(fù)制過(guò)程，在模板DNA、引物和四種dNTP存在的條件下，依賴于DNA聚合酶的酶促反應(yīng)，由變性退火延伸三個(gè)基本反應(yīng)步驟構(gòu)成。2、在下一輪循環(huán)中，DNA雙鏈再經(jīng)變性、退火、延伸三步, 模板DNA數(shù)量翻一倍(假設(shè)擴(kuò)增效率為100%)。如此反復(fù)循環(huán)，便可使DNA以指數(shù)形式進(jìn)行擴(kuò)增。每完成一個(gè)循環(huán)需24min， 23h就能將待擴(kuò)目的基因擴(kuò)增放大幾百萬(wàn)倍。到達(dá)平臺(tái)期（plateau）所需循環(huán)次數(shù)取決于樣品中模板的拷貝數(shù)。PCR反應(yīng)體系：模板（template）；引物（primer）；DNA 聚合酶（DNA polymerase）；dNTP； PCR buffer 簡(jiǎn)述PCR技術(shù)的一般方案。1、50 ul PCR反應(yīng)體系的組成:樣品DNA 0.11ug；正鏈引物（25umol/L）1.0ul；負(fù)鏈引物（25umol/L）1.0ul；dNTP （各2.5mmol/L）4.0ul；10PCR緩沖液 5.0ul；MgCl2（25mmol/L）3.0ul；Taq DNA聚合酶12.5u；蒸餾的去離子水補(bǔ)至50ul。2、對(duì)照：陽(yáng)性對(duì)照、空白對(duì)照分別以陽(yáng)性模板DNA、蒸餾的去離子水取代樣品DNA。3、PCR儀工作參數(shù)的設(shè)置：94 3060sec，553060sec，723060sec，循環(huán)30次，最后72延伸5min。4、PCR產(chǎn)物的保存：PCR產(chǎn)物于4保存。PCR引物的設(shè)計(jì)原則有哪些？1、 長(zhǎng)度1530 b，過(guò)短特異性降低，過(guò)長(zhǎng)則成本增加，產(chǎn)量也下降。2、 引物堿基盡可能隨機(jī)分布，避免出現(xiàn)嘌呤、嘧啶堆積現(xiàn)象，引物 G+C 含量宜在45 55%左右。3、引物內(nèi)部不能含有自身互補(bǔ)序列，否則會(huì)形成發(fā)夾樣二級(jí)結(jié)構(gòu)；兩個(gè)引物之間尤其在 3 末端不應(yīng)有互補(bǔ)鏈存在，不然會(huì)形成引物二聚體。4、引物的堿基順序與非擴(kuò)增區(qū)域同源性小于70%或連續(xù)互補(bǔ)堿基少于8個(gè)。要求在引物設(shè)計(jì)時(shí)采用計(jì)算機(jī)進(jìn)行輔助檢索分析。5、引物的3末端與模板DNA一定要配對(duì)。另外 3末端的末位堿基最好選T、G、C，而不選A（引物3末端堿基在錯(cuò)誤配對(duì)時(shí)不同堿基的引發(fā)效率存在很大差異）。6、只要與模板DNA結(jié)合的引物長(zhǎng)度足夠，引物的 5 末端堿基最多可以有10個(gè)堿基不與模板DNA匹配，并不影響PCR反應(yīng)進(jìn)行。TaqMan熒光定量PCR技術(shù)的原理是什么？1、PCR擴(kuò)增時(shí)，