有關物質測定hplc方法的建立.doc

有關物質測定hplc方法的建立一、開始之前必須明白：1、有關物質來源的兩種途徑：1）合成過程中的中間體和副產物；2）儲存過程中產生的降解產物；2、分析你的樣品結構，熟悉樣品的基本性質；3、樣品中可能含有的中間體；4、樣品的基本穩(wěn)定性和可能產生的降解產物；二、準備工作1、查閱文獻，看看是否同行已經做過類似的工作，有的話就簡單了，直接奔主題了。2、沒有文獻（苦?。?，那就很是麻煩了。1）分析結構，看看有無紫外吸收，有就比較簡單，選用紫外檢測器就行了，沒有的話那就麻煩，可以選用蒸發(fā)光散射檢測器等；2）分析結構，看看選用何種色譜方式進行分離（正相或者反相色譜）；3）分析結構，看看流動相該如何選擇，要不要選用一些離子對試劑。4）分析結構。5）與同類產品進行比較；三、開工（以紫外檢測為例）1、流動相的選擇（采用粗品進行選擇）1）、有文獻，按文獻進行優(yōu)化。不過我得提醒一下，文獻的方法參考是可以的，要想完全按照他的條件做出來是很難的。2）、沒有文獻。a、紫外掃描一下，看看哪里有最大吸收。將能得到的中間體、副產物、分解產物、樣品配成相同濃度，在紫外掃描分光光度計上掃描一下，選擇所有物質具有相同的最大吸收處的波長作為測定波長。要是有pda檢測器就不需要這一步了。b、還是得找一些資料，看看類似的樣品的流動相，以它為起始流動相進行選擇，如果沒有，那就找專業(yè)書吧，看看它是怎么教你選擇流動相的。2、最低檢測限3、系統適應性試驗重復進樣5次，記錄色譜圖，給出系統評價報告4、考察中間體及副產物和樣品的分離度。同時定出中間體在色譜圖中的出峰位置，為定質量標準提供依據。5、考察降解產物和樣品的分離情況。這個一般是通過破壞性試驗來考察。常用的一般是高溫、強光、氧化、強酸、強堿五個因素進行考察，通過考察，應該可以知道色譜圖中那些峰是由于什么因素產生，這個也可為定質量標準提供依據。6、根據上面的試驗，應該可以知道樣品的一些大概情況了，樣品中有哪些雜質應該比較明確了?，F在對三批樣品進行測定，通過歸一化來觀察，應該可以知道雜質的大概情況，根據這個可以定出相應采用自身對照法測定的雜質限量。一般情況下還應定出最大的單一雜質限量。如果樣品中的雜質可以很好得到純品，那么你就可以采用外標法來準確定量。7、雜質的限量必須根據你的樣品本身性質來定。關于HPLC主成分自身對照法檢查有關物質時檢測波長確定的討論審評二部 張玉琥有關物質檢查，包括對產品中殘留合成原料、中間體、副產物及可能的降解產物的檢查，是控制藥品質量的重要指標，目的是檢查藥品中所含的上述雜質是否符合安全性的要求,同時也是藥品穩(wěn)定性評價中需重點考察的項目。有關物質檢查常用的方法之一是HPLC主成分自身對照法（紫外檢測器），即將HPLC色譜圖中雜質峰面積與主成分自身對照液峰面積進行比較，以確定雜質限度是否合格。采用此方法時確定的檢測波長是否合理直接影響到方法的可行性，因此檢測波長的選擇是方法學研究的重要內容。在審評中發(fā)現一些申報單位在采用HPLC主成分自身對照法檢查有關物質時直接或間接地以主成分的最大吸收波長作為檢測波長，由于有關物質檢查的對象是雜質，若將主藥的最大吸收波長確定為檢測波長，則雜質在此波長下的吸收可能偏低，某些雜質甚至無吸收，這樣會造成對雜質含量的低估甚至漏檢，從而不能反映產品的真實質量，影響了對品種質量可控性及穩(wěn)定性的評價。在有關物質檢測波長確定方面，申報資料中比較常見的做法有：1直接將主藥的最大吸收波長選作檢測波長。2簡單地套用含量測定的色譜條件。在HPLC法進行含量測定時，為提高方法的靈敏度，降低干擾，往往選用主成分的最大吸收波長作為檢測波長。若套用含量測定的色譜條件，實際仍是以主藥的最大吸收波長作為有關物質檢測波長。3以樣品進行破壞性試驗（酸、堿、熱、光照、氧化等）后的溶液做紫外掃描，將掃描圖譜中最大吸收波長確定為有關物質的檢測波長。因破壞性試驗后溶液中存在尚未破壞的主藥、降解產物、輔料等，此溶液的紫外吸收為各成分紫外吸收的加和，并不能反映降解產物的紫外吸收特性。由于未破壞主藥所占比例較大，故破壞性試驗后溶液的最大吸收波長一般仍為主藥的最大吸收波長。采用HPLC主成分自身對照法檢查有關物質，其前提之一是需檢查的雜質與主成分在確定的檢測波長下應有相近的紫外吸收（響應值接近），選擇檢測波長時需對產品中可能存在的雜質（合成原料、中間體、副產物以及降解產物）的紫外吸收特性進行研究。已知雜質的紫外吸收特性可采用對其流動相溶液直接進行掃描的方法考察，未知雜質（如未知降解產物等）可通過二極管陣列檢測器考察其紫外吸收情況，根據各主要雜質及主成分的紫外吸收特性，選取響應值基本一致的波長作為有關物質的檢測波長。若對不同雜質難于找到均適宜的檢測波長，可考慮選擇在不同波長下分別測定，也可考慮采用加校正因子的主成分自身對照法。只有經試驗研究確認主成分的最大吸收波長符合有關物質檢查對測定波長的要求時，為方便操作，可選作有關物質的檢測波長，以與含量測定的色譜條件一致。另外，HPLC主成分自身對照法檢查有關物質比較適用于對微量雜質總量的控制，也可用于單個雜質的限度（一般不超過0.5%）控制。對于具有明確歸屬的已知雜質，建議采用雜質對照品法進行檢查。對于有毒有害雜質，更應采用雜質對照品法單獨測定，并制定嚴格的限度。關于原料藥有關物質檢查方法建立的思考作者: lcc666發(fā)布日期: 2007-1-10 查看數: 73 出自: table=96%trtd/td/trtrtd=1,1,60正文/tdtd 審評四部七室 趙慧玲【摘要】本文針對審評原料藥有關物質檢查方法中存在的問題，介紹歐洲和英國藥典關于原料藥已知雜質的研究現狀和有關物質方法建立及質量控制，以供申請人參考?！娟P鍵詞】有關物質、方法學、分離度。筆者審評原料藥有關物質檢查方法中發(fā)現，大多申請人越來越多地認識到控制原料藥有關物質的重要性，自行建立方法考察原料藥中存在的有關物質。但在研究中往往片面認為樣品通過了破壞性試驗和1自身對照法后的系統適用性試驗就符合了要求。因此，忽視對主成分中雜質產生原因的分析，忽視儀器的檢測靈敏度的分析、忽略色譜柱（柱效）的選擇、流動相及比例的選擇、檢測波長的選擇。忽視主成分和可能產生的雜質分離度的問題。原料藥有關物質方法建立應關注的問題：原料藥中的雜質來源于合成的中間體、副產物、以及降解產物，建立方法初期，僅采用破壞性試驗的方法考察降解產物的做法是片面的。由于降解產物的量較小，如果選擇的方法不好，比如，柱效低，波長選擇不合理、流動相及流動相比例不合適，即使有降解產物，也達不到有效的靈敏度和有效的分離。因此，一個好的分析方法的建立首要問題應是圍繞主成分和雜質的分離度和檢測波長進行。對于生產原料藥的企業(yè)來講，由于可以通過工藝得到中間體、副產物，在方法建立初始，首先應該將可能的中間體和副產物作為雜質對待，進行柱效、流動相及流動相比例、波長和分離度等方法學的研究。方法建立成熟后，可根據中間體和副產物的安全性和工藝得到的難易程度決定是否固定為已知雜質。如果工藝中難以得到，且比較安全，可考慮采用雜質校正因子加上相對保留時間的方法。或采用雜質相對保留時間加上自身對照方法。上述三種方法均有好的分離度和響應值（靈敏度）作保證。也是研發(fā)和審評中應當提倡的。如果原料合成中確實得不到副產物，對于有紫外吸收的樣品可以用二極管陣列檢測器，考察未精制的粗品，并對比已精制過的樣品，確定粗品中各成分的分離度和樣品中可能雜質的檢測波長。方法確立后，可采用自身對照方法或面積歸一化法控制雜質。對于后一方法，在研發(fā)和審評中應當慎重選用。如果證明上述四個方法是比較成熟的方法后，如果再加上破壞性試驗考察降解產物，其方法就更加完整和適用。介紹歐洲和英國藥典控制有關物質關注的問題歐洲和英國藥典的原料藥標準后面，大部分都附有可能產生的中間體和副產物的結構，在有關物質質量控制中有些采用已知雜質的方法；有些采用雜質校正因子加上相對保留時間的方法；雜質相對保留時間加上自身對照方法和自身對照方法或面積歸一化法。例如：核黃素磷酸鈉的有關物質檢查就是采用HPLC的已知雜質核黃素、其他雜質相對保留時間加上自身對照的方法。取本品0.1g，用水50ml溶解，并用流動相稀釋至100ml，取該溶液8ml，用流動相稀釋至50ml，作為供試品溶液。另取核黃素對照品60mg，加鹽酸試液1ml溶解，用水稀釋至250ml, 取該溶液4ml，用流動相稀釋至100ml，作為對照品溶液(a)。再另取核黃素磷酸鈉對照品0.1g，用水50ml溶解，并用流動相稀釋至100ml，取該溶液8ml，用流動相稀釋至50ml，作為對照品溶液(b)。用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（填充劑粒度：5m；柱長：0.25m；內徑：4.6mm）；以甲醇7.35g/L磷酸二氫鉀溶液（150：850）為流動相；檢測波長266nm；流速2ml/分。5單磷酸核黃素的保留時間為20分鐘；其他相對保留時間：3，4二磷酸核黃素大約0.2；3，5二磷酸核黃素大約0.3；4，5二磷酸核黃素大約0.5；3單磷酸核黃素大約0.7；4單磷酸核黃素大約0.9；核黃素大約2。取對照溶液（a）100l注入液相色譜儀，調節(jié)主峰高度為滿量程的50；再注入對照溶液（b）100l，記錄色譜峰直到核黃素的峰面積能被準確計算，且4單磷酸核黃素峰與5單磷酸核黃素峰的分離度應不小于1.5。精密量取供試品溶液、對照溶液（a）和對照溶液（b）各100l，分別注入液相色譜儀，供試品溶液的色譜圖中，如有與核黃素峰保留時間相應的色譜峰，其峰面積不得大于對照溶液（a）主峰面積（6.0），二磷酸核黃素面積的和不得大于對照溶液（a）主峰面積（6.0），且均應以干燥品計。結合國內研發(fā)核黃素磷酸鈉的狀況提幾點建議在審評核黃素磷酸鈉原料和注射劑有關物質的過程中發(fā)現，申請人常參照中國藥典收載的核黃素磷酸鈉及注射液標準項目進行。忽視了國內外標準和國內同品種質量的調研，盲目申報。一些資料中單磷酸核黃素的分離度并不好，從圖譜看起來，表面上其質量比國外標準的質量好，但實際上是單磷酸核黃素等多個組分并未得到有效分離。雖然國外將各單磷酸鹽均看成有效成分，而未作為雜質控制，但在方法學研究中，的確關注了各單磷酸鹽的分離度，這應是方法學研究的重點。如果建立的方法不能使每一個成分分離，這個方法就不是一個好的方法。從這個例子分析，審評中不能簡單認為雜質個數少了，質量就好，雜質個數多了，質量就差，一定要結合分析方法的好壞，經過綜合分析判斷后下結論。否則，容易犯主觀主義和片面主義的錯誤，將由于因分析方法的分離度較差而導致的雜質個數少的藥品誤認為質量好。其實，藥品中包含著沒有分開的成分，這個成分很可能是最不安全的成分。因此，一個藥品的有關物質方法的評價更應重視分離度方法的評價，在分離度合適的情況下，比較檢出雜質的個數才有意義，不能簡單的以檢出雜質的個數多少論質量。 對核黃素磷酸鈉，引起重視的應是分離度方法的問題，在有了好的分離度方法基礎上，再根據每一個成分的安全性和生產工藝的成本，考慮對每一個成分的合理控制，這是有關物質研究的重點。在可能的情況下，推薦使用國外藥典標準的有關物質檢查方法和限度。建議在仿制原料藥時，首先應查閱國外藥典同品種質量標準，借鑒國外的有關物質檢查方法和限度，減少建立方法學和質量研究工作的盲目性。在未有文獻可借鑒時，根據我國實際的研究水平，建立有關物質的檢查方法。其二，由于國內仿制的原料藥是可以豁免臨床研究的，不同的合成工藝對主藥的影響不同，而可能的中間體、副產物、降解產物會不同。有關物質方法的確定一定要以工藝中的理論上的各成