【畢業(yè)學位論文】（Word原稿）小麥不同外植體農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系研究作物遺傳育種碩士論文

密級： 論文編號： 中國農(nóng)業(yè)科學院 碩士學位論文 小麥不同外植體農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系研究 摘 要 目前為止，小麥幼胚是利用農(nóng)桿菌介導法成功轉(zhuǎn)化小麥的唯一外植體， 常用的基因型，不但小麥幼胚的取材受季節(jié)的嚴格限制，而且存在著基因型單一、轉(zhuǎn)化效率不穩(wěn)定等缺點。篩選對農(nóng)桿菌敏感的小麥基因型，建立或完善農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化小麥成熟胚、幼穗和幼胚的技術(shù) 體系，同時將一些與性狀改良有關(guān)的功能基因?qū)胄←?，對于小麥新品種選育和功能基因組研究具有重要意義。本研究選用來自全國各地的 91 個小麥基因型，分別以其成熟胚、幼穗和幼胚為受體材料進行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，通過 因的瞬間表達篩選對農(nóng)桿菌敏感的小麥基因型，通過對受體材料處理方式和共培養(yǎng)方式的比較等技術(shù)環(huán)節(jié)的研究，將高分子量麥谷蛋白亞基編碼基因 154X、 154Y、 標記基因 I、報告基因 入小麥。 通過農(nóng)桿菌侵染后 因瞬間表達，從 80 個小麥品種中篩選到了 97選 208、豫麥 66、揚 麥 6號等基因型，其幼胚對農(nóng)桿菌感染非常敏感， 從 83 個小麥品種中篩選到京冬 8 號、 農(nóng) 2611、京冬 11 等基因型的幼穗經(jīng)對農(nóng)桿菌感染比較敏感， 因瞬間表達率達到了 多數(shù)基因型的幼穗對農(nóng)桿菌感染不敏感。對小麥受體組織與農(nóng)桿菌的共培養(yǎng)方式進行了比較，結(jié)果表明，濾紙上共培養(yǎng)方式更有利于農(nóng)桿菌對小麥三種不同外植體的侵染，濾紙上共培養(yǎng)方式 因表達率平均比固體培養(yǎng)基共培養(yǎng)方式高 對小麥成熟胚在農(nóng)桿菌感染前采用了三種不同的 處理方法，結(jié)果表明，成熟胚縱切成兩半后直接進行農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化更有利于農(nóng)桿菌的侵染和抗性愈傷組織誘導、再生，首次利用農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化小麥成熟胚獲得了小麥轉(zhuǎn)基因植株。利用農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化小麥幼胚也獲得了轉(zhuǎn)基因植株，利用農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化小麥幼穗獲得了抗性再生植株。對轉(zhuǎn)基因植株進行了 測、測和 測，并對 轉(zhuǎn)基因植株進行了遺傳分析，對 轉(zhuǎn)基因材料和轉(zhuǎn)基因材料進行了跟蹤檢測。 關(guān)鍵字：小麥，農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化，成熟胚，幼胚，幼穗，基因型篩選，分子檢測 n of to is is of of by as it is to to of by to to 83 in 154X 54Y. by US by of 9, 611, 1 to US , , 706 to US , . to on it on as US T, 154X, by as be to It at of by as by as CR by of 1 錄 第一章 緒論 . 1 麥遺傳轉(zhuǎn)化的主要方法 . 2 因槍法介導的小麥轉(zhuǎn)化 . 2 桿菌介導的小麥轉(zhuǎn)化 . 3 它方法介導的小麥轉(zhuǎn)化 . 4 麥農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化研究現(xiàn)狀 . 5 子葉植物農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化回顧 . 5 麥農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化研究進展 . 6 響農(nóng)桿菌法轉(zhuǎn)化小麥的因素 . 7 麥植株生長條件控制 . 8 麥基因型 . 8 植體類型 . 8 桿菌菌株和載體 . 8 種預培養(yǎng)和共培養(yǎng)的條件 . 9 擇標記基因 . 10 麥農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化存在的問題 . 11 研究的意義、主要內(nèi)容及技術(shù)路線 . 12 題意義 . 12 究內(nèi)容 . 12 術(shù) 路線 . 13 第二章 小麥成熟胚農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系研究 .驗材枓 . 14 源基因、質(zhì)粒載體及其農(nóng)桿菌菌系 . 14 麥材料 . 14 劑及耗材 . 15 器設備 . 16 物 . 16 究方法 . 16 桿菌介導法轉(zhuǎn)化小麥成熟胚 . 16 麥抗性再生植株 取 . 19 粒 . 19 段的回收與純化 . 20 織化學染色檢測 . 20 性再生植株的 . 20 抗性再生植株的 . 21 基因植株的 析 . 21 果與分析 . 22 傷組織誘導結(jié)果 . 22 織化學染色結(jié)果 . 23 0代轉(zhuǎn)基因植株獲得 . 24 0代轉(zhuǎn)基因植株 . 25 1代轉(zhuǎn)基因植株檢測和遺傳分析 . 27 2代轉(zhuǎn)基因植株跟蹤檢測 . 28 基因植株 測 . 31 題討論 . 32 于成熟胚外植體的處理方法和轉(zhuǎn)化效率 . 32 于 果不一致的原因 . 32 1代植株分離比例不符合 3:1 的可能原因 . 33 于高分子量麥谷蛋白亞基基因在小麥中的表達 . 33 第三章 小麥幼胚農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系研究 .驗材枓 . 34 源基因、質(zhì)粒載體及農(nóng)桿菌菌系 . 34 麥材料 . 35 劑及耗材 . 36 器設備 . 36 物 . 36 究方法 . 36 桿菌介導法轉(zhuǎn)化小麥幼胚 . 36 性再生植株 . 38 織化學染色檢測 . 38 性再生植株的 . 38 性再生植株的 . 38 果與分析 . 39 同小麥基因型幼胚農(nóng)桿菌敏感性差異 . 39 性再生植株獲得 . 42 0代抗性再生植株 . 42 論 . 44 于農(nóng)桿菌敏感性小麥基因型篩選 . 44 于小麥與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)方式 . 44 于誘導愈傷組織培養(yǎng)基的改進 . 45 第四章 小麥幼穗農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化體系研究 . V 驗材枓 . 46 源基因、質(zhì)粒載體及其農(nóng)桿菌菌系 . 46 麥材料 . 47 劑及耗材 . 47 器設備 . 47 究方法 . 47 桿菌介導法轉(zhuǎn)化小麥幼穗 . 47 麥植株 . 48 織化學染色檢測 . 48 性再生植株的 . 48 果與分析 . 49 傷組織誘導結(jié)果 . 49 織化學染色結(jié)果 . 49 性再生植株的獲得 . 52 性再生植株 測 . 52 題討論 . 52 第五章 結(jié)論 .考文獻 . 謝 .者簡歷 . 文縮略表 英文縮寫 英文全稱 中文名稱 膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶 牛血清白蛋白 (第五組分 ) 基對 2,4,42,4聯(lián)免疫吸附測定法 種抗生素 花蓮外源凝集素 潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶 養(yǎng)基名稱 -(2-(乙磺酸 養(yǎng)基名稱 萘乙酸 新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶 合酶鏈式反應 二烷基硫酸鈉 羥甲基氨基甲烷和乙二氨四乙酸鈉鹽 （羥甲基）氨基甲烷 中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 緒論 1 第一章 緒論 組技術(shù)的創(chuàng)立使分子生物學研究由理論進入實踐，基因工程技術(shù)應運而生。在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方面，植物基因工程育種技術(shù)為植物產(chǎn)量提高和品質(zhì)改良開辟了廣闊的前景。 20 世紀80年代初 1985年 服了利用植物原生質(zhì)體、懸 浮細胞等作為外源基因受體所帶來的再生困難，直接用 植 物的組織塊進行轉(zhuǎn)化大大簡化了試驗程序。利用這一轉(zhuǎn)化技術(shù)，馬鈴薯、番茄、擬南芥等雙子葉模式植物相繼轉(zhuǎn)基因獲得成功。此后，植物轉(zhuǎn)基因技術(shù)迅速發(fā)展，先后建立了除農(nóng)桿菌介導法以外的 導法、電激穿孔法、病毒介導法、基因槍法、顯微注射法、花粉管通道法、超聲波法等。經(jīng)過多年的實踐和優(yōu)勝劣汰，多數(shù)轉(zhuǎn)化方法已被逐步放棄，形成了以農(nóng)桿菌介導法和基因槍介導法占主導地位的兩大植物轉(zhuǎn)基因體系，通過這兩種方法獲得成功的報道占轉(zhuǎn)基因總數(shù)的 90%，其中農(nóng)桿菌法獲得的轉(zhuǎn)基因植物占轉(zhuǎn)基因 植物總數(shù)的 85%左右。農(nóng)桿菌介導法主要用于雙子葉植物，基因槍介導法主要用于單子葉植物。利用農(nóng)桿菌介導法和基因槍介導法，很多植物的轉(zhuǎn)基因研究獲得了成功，涉及 35個科的 50 多個物種，共 120 多種植物。眾所周知，世界上一半以上的食物來源于禾谷類作物，而禾谷類作物的遺傳轉(zhuǎn)化研究一度進展緩慢。 1988 年 利用基因槍介導法轉(zhuǎn)化玉米懸浮細胞系，獲得了可育的轉(zhuǎn)基因植株。 1994 年 以水稻成熟胚愈傷組織和未成熟幼胚為受體，獲得了較多有嚴格分子生物學證據(jù)的轉(zhuǎn)基因水稻植株，并對農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化水稻的影響因素進行 了詳細研究，建立了比較成熟的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化水稻的技術(shù)體系，為農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化單子葉植物開辟了先河。 隨著轉(zhuǎn)基因體系的建立和成熟，科學家們業(yè)已將一些功能基因轉(zhuǎn)入了主要農(nóng)作物，培育了轉(zhuǎn)基因作物新品種，如抗蟲轉(zhuǎn)基因棉花、抗除草劑轉(zhuǎn)基因大豆、抗蟲轉(zhuǎn)基因玉米、抗除草劑轉(zhuǎn)基因油菜等。自 1986 年轉(zhuǎn)基因植物首次獲準進入田間試驗、 1994 年轉(zhuǎn)基因番茄在美國批準上市以來， 2000 年全球轉(zhuǎn)基因作物種植面積 4,420 萬公頃， 2004 年達 8,100 萬公頃， 2005年達 9,000 萬公頃，比 2004 年增加了 11%。與 2000 年相比， 2005 年不僅轉(zhuǎn)基因作物種植面積有所增加，而且種 植 的國家也趨向多元化，除美國、阿根廷、加拿大、巴西、中國等種植大國外，巴拉圭、南非、烏拉圭、澳大利亞、印度、羅馬尼亞、西班牙、墨西哥、菲律賓、哥倫比亞、保加利亞、洪都拉斯、德國、印度尼西亞、伊朗、葡萄牙、捷克等也有一定種植面積。 據(jù)統(tǒng)計， 2005 年全球轉(zhuǎn)基因作物中的 38種植在發(fā)展中國家，而且其發(fā)展趨勢呈現(xiàn)持續(xù)增長勢頭。在發(fā)展中國家，人口增長和食物短缺的矛盾日益尖銳，同時伴隨著耕地減少、生物種植和生存環(huán)境的惡化，轉(zhuǎn)基因技術(shù)是解決這些問題的最有效途徑。在發(fā)達國家，轉(zhuǎn)基 因作物的種植已經(jīng)產(chǎn)生了巨大的經(jīng)濟效益。 2005 年全球轉(zhuǎn)基因作物的交易額達到 美元，預計 2010 年達 到 100 億美元。人類對高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)、抗病抗逆生物的需要，以及對低成本高產(chǎn)出的追求，無疑將促使轉(zhuǎn)基因技術(shù)的深入研究和轉(zhuǎn)基因生物的大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化。我國科學家在世中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 緒論 2 界上率先將抗蟲基因、抗除草劑基因和抗白葉枯病基因?qū)肓怂?，目前正在進行環(huán)境釋放和生產(chǎn)試驗，有望近幾年實現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。 麥遺傳轉(zhuǎn)化的主要方法 世界上小麥種植面積約占耕地面積的 17，小麥是人類攝取熱量與蛋白質(zhì)的主要來源之一，還提供重要的維生素和礦 物質(zhì)，如維生素 B 和 E，含鎂和磷的物質(zhì)，以及纖維類物質(zhì)。傳統(tǒng)小麥育種方法育種周期長，轉(zhuǎn)基因技術(shù)的發(fā)展為小麥育種提供了一種新的遺傳改良手段，并且彌補了傳統(tǒng)育種方法的不足，不僅可以增加產(chǎn)量，還可以改良品質(zhì)，提高抗性。但是在糧食作物中，小麥屬于遺傳轉(zhuǎn)化最為困難的作物，加上轉(zhuǎn)基因研究起步較晚，基因工程育種進程明顯落后于其它作物。在諸多轉(zhuǎn)基因方法中，小麥轉(zhuǎn)基因研究主要采用了基因槍和農(nóng)桿菌介導兩種轉(zhuǎn)化方法。 因槍法介導的小麥轉(zhuǎn)化 基因槍法也稱為粒子轟擊 (近幾年來大量采用的有效方法。其原理是將載有外源 鎢（金）等顆粒加速后射入受體細胞，加速的動力是通過火藥爆炸或高壓氣體或高壓放電加在粒子上的瞬時沖量，目前主要應用的是壓縮氣體驅(qū)動的基因槍，如以氦氣、氫氣、氮氣等驅(qū)動的 1000 系統(tǒng)，影響基因轉(zhuǎn)化的主要因素包括： (1)基因槍轟擊參數(shù)。如粒子速度，射入深度，阻擋板至樣品室高度，轟擊次數(shù)，上樣方式，射彈的理化特性， 純度及濃度， 亞精胺濃度等。(2)生物因子。如外植體的種類 ，細胞生理狀態(tài)，轟擊前后的培養(yǎng)條件，以及細胞內(nèi)環(huán)境對外源 運的影響等。目前為止，基因槍轉(zhuǎn)化成功的植物已達 20 多種，包括大豆、煙草、水稻、小麥、棉花、玉米、甘蔗等。但基因槍介導法存在轉(zhuǎn)化效率比較低，插入外源 拷貝整合比較多，容易發(fā)生基因沉默現(xiàn)象，不能導入大片段 缺點，而且成本高，操作比較復雜。在實際應用中有一定局限性。 1992 年 利用基因槍介導法將 因?qū)肓诵←?，獲得了世界上第一例小麥轉(zhuǎn)基因植株。 1993 年 、 利用基因槍介導法分別將 因、 因?qū)肓诵←湥⒘嘶驑尫ㄞD(zhuǎn)化小麥的技術(shù)體系。在隨后的幾年內(nèi)，小麥轉(zhuǎn)基因研究基本上借助 于基因槍介導法。 1994 年 利用基因槍介導法將 因和 因?qū)肓诵←?，獲得了轉(zhuǎn)基因植株。 1995 年 利用基因槍介導法將 因和 因?qū)肓诵←湥@得了轉(zhuǎn)基因植株。 1996 年 、 、 、 利用基因槍介導法分別將 因、 因、 因和 因轉(zhuǎn)入了小麥，完善了基因槍法轉(zhuǎn)化小麥的技術(shù)體系。 (1996)、張曉 東等 (1997)、陳梁鴻 (1997)、 (1998)分別利用基因槍法將編碼高分子量谷蛋白亞基 因?qū)肓诵←溣着吆陀姿?，獲得了穩(wěn)定表達的轉(zhuǎn)基因植株。徐惠君等 (2001)利用基因槍介導法將 制酶基因?qū)肓诵←湥飙偡嫉?(2001)、梁輝等 (2004)分別利用基因槍介導法將 因?qū)肓诵←?，轉(zhuǎn)基因小麥對黃花葉病毒病、中國農(nóng)業(yè)科學院碩士學位論文 第一章 緒論 3 蚜蟲表現(xiàn)較強抗性，目前已進入環(huán)境釋放階段。（表 1 表 1因槍法轉(zhuǎn)化小麥情況 w b y bo 外源基因 Ex 轉(zhuǎn)化結(jié)果 來源 株 (1992) 株 張 嘵 東 等 (1997) 株 a 等 (1996) 植株 (1995) 株 (1992) 株 (1993) 株 (1996) 株 (1993) 株 (1994) 株 y 等 (1996) 株 (1996) 株 (1996) 愈 傷 組 織 (1991) 株 徐 惠 君 等 (2001) 植株 徐 瓊 芳 等 (2001) 株 梁 輝 等 (2004) 桿菌介導的小麥轉(zhuǎn)化 農(nóng)桿菌是一種革蘭氏陰性土壤桿菌， 1907 年發(fā)現(xiàn)農(nóng)桿菌是植物致瘤的起因，植物細胞 被侵染后，形成腫瘤。能夠誘發(fā)冠癭瘤的稱為根癌農(nóng)桿菌 (誘導毛發(fā)狀根的稱為發(fā)根農(nóng)桿菌 (受感染的細胞可產(chǎn)生正常細胞所不能產(chǎn)生的生物堿冠癭堿，被農(nóng)桿菌利用作為自身繁殖所需要的碳源和氮源。致瘤必須有 粒上 因兩部分參與。 有 5端和 3端真核表達信號，如 等。 兩端左右邊界各為 25重復序列，完全保守。盡管 整合進植物基因組中，但 因并不與 轉(zhuǎn)移及整合有關(guān)，因為它不編碼使移的產(chǎn)物。 移由質(zhì)粒上的 因區(qū)控制。 因區(qū)大小為 30括B、 C、 D、 E、 G、