細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)(實(shí)驗(yàn)篇)四

細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù) 實(shí)驗(yàn)篇 2013年1月3日合肥 實(shí)驗(yàn)四 一 VSVTCID50滴定 二 干擾素效價(jià)測(cè)定 一 三 中和試驗(yàn) 一 一 VSVTCID50滴定 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握病毒TCID50滴定的基本原理和計(jì)算方法熟悉病毒TCID50的應(yīng)用 實(shí)驗(yàn)原理 多數(shù)病毒感染體外培養(yǎng)的細(xì)胞后 常引起細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變 如細(xì)胞團(tuán)縮 裂解 細(xì)胞腫大或脫落等 這種改變稱為病毒的致細(xì)胞病變效應(yīng) CPE TCID50 50 tissuecultureinfectiousdose 是病毒毒力的傳統(tǒng)表示法 即能在50 組織細(xì)胞培養(yǎng)孔或試管內(nèi)引起細(xì)胞病變所需的病毒最高稀釋度 TCID50滴定法是50 50 endpoint 終點(diǎn)法測(cè)定病毒滴度的方法之一 是將病毒懸浮液經(jīng)一系列稀釋后 接種至培養(yǎng)成的單層細(xì)胞 將每個(gè)稀釋度造成的細(xì)胞病變做成曲線 找出造成50 細(xì)胞病變的終點(diǎn)稀釋度 實(shí)驗(yàn)材料 細(xì)胞 Hep 2細(xì)胞株病毒 水泡性口炎病毒 VSV 試劑 DMEM培養(yǎng)液 或RPMI1640 小牛血清 PBS VTP材料 細(xì)胞板 微量移液器 tip頭 實(shí)驗(yàn)步驟 細(xì)胞的制備與培養(yǎng) 已完成 病毒的稀釋與接種結(jié)果觀察與計(jì)算 結(jié)果的記錄時(shí)間為感染細(xì)胞的病變不再進(jìn)展為止 不同的病毒不一樣 本實(shí)驗(yàn)所用的水泡性口炎病毒 VSV 增殖較快 一般48小時(shí)左右即可觀察染色 計(jì)算方法常用的有Reed Muench法 制備細(xì)胞 已經(jīng)完成 按傳代細(xì)胞培養(yǎng)的方法制備Hep 2細(xì)胞懸液 細(xì)胞濃度約為1 106 ml 用微量移液器將細(xì)胞懸液加入40孔板微孔中 每孔100 l 37 5 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h 形成良好的單層 病毒稀釋 用含3 小牛血清的DMEM 或RPMI1640 維持液將待測(cè)病毒VSV作連續(xù)10倍稀釋 依次為10 1 10 2 10 3 10 4 10 5 10 6 10 7 稀釋病毒液 待測(cè)VSV DMEM維持液 管號(hào) 稀釋度 病毒接種 將長(zhǎng)好單層細(xì)胞的培養(yǎng)板各孔培養(yǎng)液全部?jī)A棄 用微量加樣器將各稀釋度VSV病毒液加入相應(yīng)孔中 每孔100 l 每個(gè)稀釋度加2孔 同時(shí)設(shè)細(xì)胞對(duì)照孔 不加病毒液 只加維持液 37 5 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 123456789C DMEM維持液 復(fù)孔 試驗(yàn)孔 結(jié)果觀察 于培養(yǎng)后的不同時(shí)間 18h 24h 48h在倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞病變情況 當(dāng)病變不再發(fā)展時(shí)記錄結(jié)果 細(xì)胞病變程度表示法如下 表示無(wú)細(xì)胞病變 表示1 25 的細(xì)胞有病變 表示26 50 的細(xì)胞有病變 表示51 75 的細(xì)胞有病變 表示76 100 的細(xì)胞有病變 Reed Muench法計(jì)算TCID50 舉例如下 由上表可知病毒的TCID50介于10 4與10 5兩個(gè)稀釋度之間 兩稀釋度之間的距離比計(jì)算如下 高于50 病變的百分?jǐn)?shù) 50 距離比例 lg稀釋倍數(shù)高于50 病變的百分?jǐn)?shù) 低于50 病變的百分?jǐn)?shù)83 50 lg10 0 76783 40lgTCID50 高于50 病變的稀釋度的對(duì)數(shù) 距離比例 4 0 767 4 767則該病毒的TCID50 10 4 767 0 1ml 即此病毒的10 4 767的濃度 1 63000 0 1ml接種一組細(xì)胞孔后 可使50 的細(xì)胞感染病變 如何計(jì)算200TCID50 200TCID50 63000 200 315 將病毒作315倍稀釋時(shí)即得200TCID50的病毒液 注意事項(xiàng) 不同的病毒應(yīng)選用各自敏感的細(xì)胞 接種病毒前細(xì)胞單層必須良好 接種病毒時(shí)應(yīng)從低濃度向高濃度方向加樣 防止跳管現(xiàn)象 二 干擾素效價(jià)測(cè)定 一 8組做此實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握微量細(xì)胞病變抑制法測(cè)定干擾素效價(jià)的基本步驟以及結(jié)果分析 熟悉常用生物制品生物學(xué)活性測(cè)定的實(shí)際意義 了解影響結(jié)果的常見因素 實(shí)驗(yàn)原理 何謂干擾素 病毒或其他干擾素誘生劑作用于人或動(dòng)物的白細(xì)胞 T細(xì)胞或成纖維細(xì)胞后 刺激細(xì)胞產(chǎn)生的具有抗病毒 抗腫瘤和調(diào)節(jié)免疫功能的一類小分子糖肽 統(tǒng)稱為干擾素 具有間接的廣譜抗病毒作用 實(shí)驗(yàn)原理 為了進(jìn)一步確定人工方法制備的干擾素的生物學(xué)活性 需進(jìn)行體外抗病毒試驗(yàn)測(cè)定 即干擾素效價(jià)的測(cè)定 干擾素效價(jià)一般定義為 若1ml干擾素標(biāo)本的最高稀釋度仍能保護(hù)半數(shù)細(xì)胞 50 免受 攻擊病毒 損害 則該稀釋度的倒數(shù)即為干擾素的效價(jià) 表示為單位 毫升 實(shí)驗(yàn)原理 測(cè)定干擾素效價(jià)的方法有多種 最常用的是 細(xì)胞病變抑制法 MethodofCytopathiceffectinhibitionassay 此法的主要優(yōu)點(diǎn)是操作簡(jiǎn)便 易于掌握 結(jié)果可靠 故已成為目前各實(shí)驗(yàn)室的常規(guī) 亦可用 放射化學(xué)測(cè)定法 染料攝入測(cè)定法 全量細(xì)胞病變抑制測(cè)定法 常規(guī)微量細(xì)胞病變抑制測(cè)定法 微量快速檢測(cè)法 一步快速法 實(shí)驗(yàn)材料 待測(cè)標(biāo)本 本室制備的動(dòng)物干擾素測(cè)定細(xì)胞 人喉癌上皮細(xì)胞 Hep 2 攻擊病毒 100TCID50VSV其它材料 DMEM液 VTP 小牛血清 雙抗 40孔細(xì)胞培養(yǎng)板 微量移液器 tip頭 10ml吸管等 實(shí)驗(yàn)步驟 稀釋待檢干擾素 待測(cè)干擾素先作稀釋后 然后在40孔板中作倍比稀釋 微量單層細(xì)胞培養(yǎng) 按傳代細(xì)胞的方法制備4 105 ml的Hep 2細(xì)胞懸液 由低稀釋度向高稀釋度的順序向上述各孔加100 l細(xì)胞懸液 37 5 CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h 形成良好的單層 三 中和試驗(yàn) 一 7組做此實(shí)驗(yàn) 稀釋血清固定病毒法 實(shí)驗(yàn)?zāi)康?測(cè)定血清中的VSV中和抗體效價(jià) 實(shí)驗(yàn)原理 特異的抗病毒免疫血清 中和抗體 和病毒作用后 使病毒失去感染的能力 一種病毒只能被相應(yīng)的免疫血清所中和 中和一定量的病毒的感染力必須有一定效價(jià)的中和抗體 根據(jù)稀釋成分不同可分為兩種方法 一為固定病毒用量 100TCID50 與等量一系列倍比稀釋的血清進(jìn)行中和試驗(yàn) 以血清中和抗體滴度表示 二為固定血清用量與等量一系列對(duì)數(shù)稀釋的病毒進(jìn)行中和試驗(yàn) 結(jié)果以中和指數(shù)表示 實(shí)驗(yàn)材料 VSV免疫動(dòng)物血清 S1 S2100TCID50VSV病毒懸液稀釋液 40孔平底細(xì)胞板 Hep 2細(xì)胞一瓶 吸管 加樣器等 實(shí)驗(yàn)步驟 1 1 40孔板每孔加稀釋液 DMEM 50 l 作好標(biāo)記 每塊板做2個(gè)血清標(biāo)本 S1 S2 2 取滅活血清 第一孔加入50 l 吹吸三次后吸出50 l加入第二孔 吹吸三次吸出50 l加入第三孔 依次直至第八孔 吸出50 l棄去 第九孔細(xì)胞對(duì)照 第十孔病毒對(duì)照均不加血清 稀釋血清 血清S1 稀釋液 管號(hào) 稀釋度 棄0 05ml 100TCID50VSV S2操作同上 Hep 2細(xì)胞 3 預(yù)先配好100TCID50VSV病毒懸液 按照每孔50 l加入 C對(duì)照 即第9孔 不加病毒 V對(duì)照加100TCID5050 l 最后每孔總量200 l 4 37 作用1小時(shí) 實(shí)驗(yàn)步驟 2 5 利用此1小時(shí)制備Hep 2細(xì)胞懸液并加入上述混合液中 Hep 2一瓶 PBS洗滌二次VTP1ml消化約5min后傾去37 至細(xì)