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萬壽菊植物不同部位中光活化成分a三聯(lián)噻吩在不同生長期的含量莫卓群 楊 華 管金星 （長沙今草生物科技有限公司 湖南 長沙 410000）摘要： a-三聯(lián)噻吩（a-T）是一種光活化殺蟲劑，它是一種優(yōu)良的光活化毒素。本文采用高效液相色譜法對陜西西安地區(qū)萬壽菊同一品種的根、莖、葉、花柄、花、根乙醇提取物在不同生長時期連續(xù)4年時間的aT含量測定。方法： 采用Phenomenex prodigy 5m ODS3 100A (4.6 mm250 mm,5m)色譜柱，流動相為甲醇水（85:15），流速1.0ml/min，檢測波長351nm，柱溫35。結(jié)果：aT進(jìn)樣量在0.0495 2.475g（R2=0.9995）與峰面積呈線性關(guān)系；平均回收率（n=6）為101.07%。結(jié)論：本方法具有較高的靈敏度和較好的重現(xiàn)性，快速便捷，專屬性強，結(jié)果準(zhǔn)確，適用于萬壽菊及其根乙醇提取物中a-T的含量測定。結(jié)果顯示根的含量最高，其次是花柄、花、葉，含量最低的是莖；不同生長期根的aT含量差異顯著，7月含量最高，9月最低?；ū突?月含量高。莖的含量很低，含量變化不明顯。根乙醇提取物含量隨根含量變化而變化，產(chǎn)率7月份的最高。萬壽菊花的采集時期在89月為最佳，也就是在植物盛花末采集。關(guān)鍵詞：萬壽菊 a-三聯(lián)噻吩 光活化殺蟲劑 反相高效液相色譜 萬壽菊(Tagetes erecta L)，又名：金盞花（Marigold）, 臭芙蓉，菊科、萬壽菊屬，一年生草本，高50150厘米；莖直立，粗壯，具縱細(xì)條棱，分枝向上平展；葉羽狀分裂，長510cm，寬48cm，裂片長橢圓形或披針形，邊緣具銳鋸齒，上部葉裂片的齒端有長細(xì)芒，沿葉緣有少數(shù)腺體，基部收縮成長爪，頂端微彎缺；頭狀花序單生，管狀花花冠黃色，花期7-9月；原產(chǎn)墨西哥，我國各地均有栽培?？缮L在海拔1,150米至1,480米的地區(qū)，多生在路邊草甸。萬壽菊常于春天播種，花大、花期長，常用于花壇布景，可供觀賞。根：苦、涼；解毒消腫，用于上呼吸道感染，百日咳，支氣管炎，眼角膜炎，咽炎，口腔炎，牙痛。葉：甘，寒；用于癰、瘡、癤、疔，無名腫毒。花序：苦，涼，平肝解熱，祛風(fēng)化痰，用于頭暈?zāi)垦?，頭風(fēng)眼痛，小兒驚風(fēng)，感冒咳嗽，頓咳，乳痛，痄腮?；ǎ呵鍩峤舛?，化痰止咳，有香味，可作芳香劑，曾用作抑菌、鎮(zhèn)靜、解痙劑。我國萬壽菊的種植面積較廣，萬壽菊花花朵盛茂，產(chǎn)花率極高，花中葉黃素含量很高1，主要用來提取葉黃素，是提煉葉黃素及類胡蘿卜素的主要原料；葉中的精油可用來殺沒滅瓜果的腐霉??；其根含有黃酮、生物堿和特殊的活性物質(zhì)而備受重視，成為從2400種記載的控害植物中挑選出來的43種廣譜控害植物之一，被譽為“控害植物精華”2。萬壽菊的根提取物對小菜娥（Plutella xylostelle）、歐洲玉米螟（Ostrinia nubilalis）、煙草天蛾（Manduca sexta ）、白紋伊蚊（Aedes albopictus）3、埃及庫蚊（A.aegypti）、中華按蚊（Anopheles sinensis）、谷蠢（Rhizonertha dominica）、黃粉甲（Tenebrio molitor）、山楂葉螨（Tetranychus viennensis）等有較好的毒殺活性，并且以光活化活性為主3，4，12。萬壽菊的根提取物對多種線蟲的殺蟲活性的主要殺蟲活性成分是噻吩類物質(zhì)，其中的主要物質(zhì)是BBT、BBTOAc、BBTOH和a-三聯(lián)噻吩5，13；（aT）在所有器官（根、莖、葉、花）有都存在14。aT是一種光活化殺蟲劑【6,8】，它是一種優(yōu)良的光活化毒素，在光照時其殺蟲活性成幾十倍的提高11。AT在陽光下的半衰期為4h，發(fā)揮殺蟲作用的過程也是活性成分本身降解的過程，不會在環(huán)境中持久殘留，被稱為“綠色農(nóng)藥光活化農(nóng)藥”7。因植物性殺蟲劑的來源受到地域、季節(jié)、土地資源、生態(tài)條件、氣候等諸多因素的制約，因此不同地區(qū)種植的不同品種的萬壽菊其有效成分含量不同9。長沙今草生物科技有限公司和陜西西安地區(qū)某萬壽菊種植基地從2011年開始研究萬壽菊的種植和綜合開發(fā)。本文以陜西西安地區(qū)某萬壽菊種植基地種植的萬壽菊為研究試材，采用高效液相色譜法測定了2012年至2015年四年時間同一品種的根、莖、葉、花柄、花和根乙醇提取物在不同生長時期（采樣日期為每月20日）中aT的含量10，為綜合開發(fā)利用萬壽菊和工業(yè)化生產(chǎn)提供支持。1 儀器和試藥1.1 主要儀器Agilent 1260儀（G1311B，VWD：G1314F，7725i進(jìn)樣器，ChemStation中文色譜數(shù)據(jù)工作站），MS105DU電子天平（Mettler，0.01mg），F(xiàn)A1104 電子天平（上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司，0.1mg），KQ5200B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司），LU5A5-PCP-2A反滲透凈水機（深圳立昇凈水科技有限公司），SYZ-550型石英亞沸高純水蒸餾器（江蘇省金壇市白塔石英玻儀廠），RE-3000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮生化儀器廠），GZX-9070MBE電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），DZF-6020MBE真空干燥箱（上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠），SHB-III循環(huán)水式真空泵（鄭州長城科工貿(mào)有限公司），B-220可調(diào)恒溫水浴鍋（上海亞榮生化儀器廠），JJ-1.25W精密增力電動攪拌器（常州國華電器有限公司），GY-10A 500克多功能粉碎機（江西贛州市客家大道180號），酒精計。1.2 化學(xué)試劑甲醇為色譜純（Spectrum HPLC Grade），乙醇等其余試劑均為分析純，水為超純水。aT對照品（純度99.0%,美國Aldrich公司）。萬壽菊（整株）采自陜西西安某萬壽菊栽培基地。萬壽菊根乙醇提取物自制。2 方法2.1 對照品溶液的制備精密稱取T對照品1.25mg（精確至0.01mg），置于50ml棕色容量瓶中，加入色譜純甲醇約45ml，超聲（功率300W，40KHz）溶解20min，溶解完全后，冷卻至室溫，加甲醇定容，充分搖勻。使用時過0.45m濾膜即可(對照品濃度24.75g/ml)，備用。2.2 供試品溶液的制備2.2.1 原藥材供試品溶液的制備 每次隨機摘取30株萬壽菊，清洗泥沙等雜物，陰涼處瀝干水分，將每株的根、莖、葉、花柄（序）、花分別整理后合并，分別在3538電熱鼓風(fēng)干燥箱中干燥48.0h，冷卻至室溫，粉碎，過60目篩，得萬壽菊原藥材各部位供試樣品。取10.0g供試樣品在105條件下恒溫8.0h測定水分。 精密稱取萬壽菊原藥材各部位供試樣品2.5g（精確至0.01mg），置于50ml棕色容量瓶中，加入甲醇（A.R.）約45ml，超聲（功率300W，40KHz）提取40min，冷卻至室溫，加甲醇定容，充分搖勻。過0.45m濾膜即可。2.2.2 萬壽菊根乙醇提取物供試品溶液的制備 精密稱取過60目篩的根乙醇提取物80.0mg（精確至0.01mg），置于50ml棕色容量瓶中，加入甲醇（A.R.）約45ml，超聲（功率300W，40KHz）溶解20min，冷卻至室溫，加甲醇定容，充分搖勻。過0.45m濾膜即可。 2.3 檢測波長的選擇 采用PAD檢測器對1g/mL的aT在流動性中在190nm400nm掃描，a-T最大吸收波長為352nm，選擇351nm為檢測波長，信噪比高，極限穩(wěn)定，待測組分峰形對稱。2.4 色譜條件 Phenomenex prodigy 5m ODS3 100A(4.6 mm250 mm,5m)色譜柱，流動相為甲醇水（85:15，V甲醇/V水），流速1.0ml/min，檢測波長351nm，柱溫35，進(jìn)樣量10.0L，采用外標(biāo)法定量分析。aT理論塔板數(shù)大于5000，對稱因子為0.99。對照品及供試品色譜圖見圖2。 圖2 aT對照品、萬壽菊根（2013年8月）和萬壽菊根乙醇提取物（2013年8月）HPLC2.5 萬壽菊根乙醇提取物的制備 稱取過60目篩的萬壽菊根樣品100.0g（精確至0.1g），置于1000ml三頸圓底燒瓶中，第次加入70%乙醇水溶液700mL，浸提8.0h，然后在攪拌下65提取1.5h，冷卻至40抽濾；濾渣進(jìn)行第次提取，加入70%乙醇水溶液500mL，攪拌下65提取1.5h，冷卻至40抽濾；濾渣進(jìn)行第次提取，加入70%乙醇水溶液400mL，攪拌下65提取1.0h，冷卻至40抽濾。 合并提取濾液，在60，P-0.095MPa下回收乙醇完全，置7580，P-0.095MPa真空干燥至水分小于1.0%，取出置干燥器中冷卻，粉碎過60目篩 ，得萬壽菊根乙醇提取物。2.6 測定 在上述色譜條件下，待儀器穩(wěn)定后，先注入數(shù)針對照品溶液，計算各針峰面積，直至對照品溶液峰面積變化小于1.0%，按照標(biāo)樣、試樣、試樣、標(biāo)樣的順序測定。2.6.1 aT的含量測定按下式計算 AT含量% = （A樣M標(biāo)N標(biāo)%）/（A標(biāo)M樣） 100% 式中： A樣 樣品溶液樣品的峰面積； A標(biāo) 對照品溶液對照品的峰面積； M樣 樣品的質(zhì)量（mg）； M標(biāo) 對照品的質(zhì)量（mg）； N標(biāo)% 對照品的質(zhì)量百分含量（%）。2.6.2 樣品中aT含量% = AT含量% /（100（%）水分含量（%）100%。2.7 允許差 每個樣品平行測定3次，其結(jié)果之差應(yīng)小于0.5%，取平均值作為測定結(jié)果。2.8 標(biāo)準(zhǔn)曲線的測定精密稱取T對照品12.5mg（精確至0.01mg），置于50ml棕色容量瓶中，加入色譜純甲醇約45ml，超聲（功率300W，40KHz）溶解20min，溶解完全后，冷卻至室溫，加甲醇定容，充分搖勻 (對照品濃度247.5g/ml)。準(zhǔn)確吸取對照品溶液各0.2mL，1.0mL，2.0mL，4.0mL，6.0Ml,10.0mL于10ml棕色容量瓶中，甲醇定容至刻度得6個不同濃度的對照品液。按上述色譜條件測定，以濃度為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)分別得線性方程：y = 66340 X -18.80,R2=0.9995。線性范圍aT為0.0495 2.475g。2.9 精密度實驗 精密吸取aT對照品進(jìn)樣6次，峰面積RSD為0.56%，進(jìn)樣方法和儀器精密度良好。 表1-1 精密度實驗數(shù)據(jù)重復(fù)峰面積RSD%123456結(jié)果1619.61601.81610.21622.51605.21623.60.562.10 重現(xiàn)性實驗取同一批次萬壽菊根原藥材，分為5份，以2.2.1制備方法制備5份樣品液，分別測定aT峰面積， RSD%為0.89%，重現(xiàn)性良好。2.11 穩(wěn)定性實驗取同一批次萬壽菊根乙醇提取物供試品溶液，避光放置0、1、2、4、8、12、24h進(jìn)樣測得aT峰面積的RSD% 0.97%，表明供試品在避光條件下24h內(nèi)基本穩(wěn)定。2.12 加樣回收實驗精密稱取已知含量的萬壽菊根乙醇提取物6份，精密加入aT對照品液2ml、4ml、6ml按供試品制備方法操作，測定；aT平均回收率為101.07%，RSD%為1.15%。3 結(jié)果與分析 對2012年至2015年于每年7月20日、8月20日、9月20日采摘的同一品種的根、莖、葉、花柄、花、根乙醇提取物的供試樣品進(jìn)行aT測定。表2 萬壽菊及根提取物中aT的含量年份 采 摘 根SE 莖SE 葉SE 花柄SE 花SE 根提取物SE 根提取物產(chǎn)率 時 間 （PPm） （PPm） （PPm） （PPm） （PPm） （PPm） （%）2012年 7月 155.00.57 4.80.74 2.80.64 1083.80.81 14.3 8月 135.60.62 3.10.77 9.70.86 29.90.71 25.70.62 1084.70.95 12.5 9月 84.70.71 4.20.93 6.10.42 0.80.78 830.30.75 10.2 2013年 7月 154.80.97 3.90.44 2.50.74 29.90.80 26.70.23 1113.60.79 13.9 8月 136.2 0.82 4.00.57 8.20.76 31.20.78 28.50.69 1107.30.67 12.3 9月 87.80.78 4.90.91 6.40.62 1.10.67 860.70.55 10.2 2014年 7月 153.70.77 5.80.73 2.60.46 31.10.65 27.20.53 1090.00.82 14.1 8月 136.80.82 3.70.87 9.2.00.96 28.90.77 21.60.52 1077.10.85 12.7 9月 88.60.78 3.90.83 6.80.49 1.40.97 894.90.73 9.9 2015年 7月 150.80.71 5.20.73 2.50.36 29.40.56 26.00.63 1108.80.90 13.5 8月 135.20.92 3.50.83 11.10.76 27.30.97 22.00.32 1053.71.13 12.1 9月 86.30.88 4.60.63 7.10.69 0.70.77 814.10.93 10.6 圖3 2013 年不同部位、不同時期萬壽菊中aT的含量圖41 2013 年不同部位、不同時期萬壽菊中aT的含量變化圖42 2014 年不同部位、不同時期萬壽菊中aT的含量變化圖43 2015 年不同部位、不同時期萬壽菊中aT的含量變化從圖中可以看出：從不同部位來看，以根中的含量為最高，其次是花柄、花、葉，含量最低的是莖；不同生長期根的aT含量差異顯著，7月含量最高，可達(dá)155PPm，9月含量最低,含量下降明顯。 從圖中可以看出，不同生長期：花（9月15日后花已凋落）的aT含量變化不顯著，變化較平穩(wěn)；花柄含量變化與花相似，7月后呈下降,8月下旬后是花的晚期，隨花的凋落，含量開始顯著下降；葉8月含量最高，然后平穩(wěn)下降；莖在花前含量高，花后平穩(wěn)降低，但在整個生長周期中含量很低。 圖5 20122015年不同時期萬壽菊根乙醇提取物中aT的含量圖6 20122015年不同時期萬壽菊根乙醇提取物產(chǎn)率 萬壽菊根乙醇提取物中aT的含量78月高，8月下旬后是花的晚期，隨花的凋落，含量開始顯著下降；產(chǎn)率隨季節(jié)而明顯下降。 不同生長時期萬壽菊根乙醇提取物HPLC圖譜：圖71 萬壽菊根乙醇提取物（2013年7月）HPLC圖72 萬壽菊根乙醇提取物（2013年9月）HPLC萬壽菊根乙醇提取物中噻吩類物質(zhì)主要組分隨植物生長期的不同而變化，aT在89月組分百分比較高。4 結(jié)論試驗結(jié)果表明，萬壽菊植物整株都含有aT，其根的含量最高，其次是花柄、花、葉，含量最低的是莖；不同生長期根的aT含量差異顯著，78月含量最高；花柄和花8月含量高；莖的含量很低，含量變化不明顯；根的乙醇提取物含量隨根含量變化而變化， 78月份根產(chǎn)率較佳；提取物中噻吩類物質(zhì)主要組分隨生長期的不同而變化，aT在89月組分百分比較高，10月（9月下旬土壤中根開始腐爛）以后逐漸降低。本文建立了測定萬壽菊及根提取物中aT含量的反相高效液相色譜定量方法，采用甲醇和水為流動相，以甲醇：水=85:15達(dá)到了最佳的分離效果。試驗結(jié)果證明，萬壽菊花的采集時期在89月為最佳，也就是在植物盛花末采集；此時花中的aT含量最低，而根中的含量較高，根的乙醇提取物質(zhì)量和產(chǎn)率均較理想。以采集花用于提取葉黃素為主要原料時，不要將花柄連同一起采集。參考文獻(xiàn)：1. 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