菌種選育理論和技術(shù)

第二章工業(yè)微生物菌種選育 1 微生物分離2 自然選育3 誘變育種4 雜交育種5 原生質(zhì)體技術(shù)6 分子育種 菌種選育 第一節(jié)微生物分離 1 1菌種分離的一般過程 土樣的采取 預(yù)處理 培養(yǎng) 菌落的選擇 產(chǎn)品的鑒定 如何使樣品中所含微生物的可能性大 如何在后續(xù)的操作中使這種可能性實(shí)現(xiàn) 目的 高效地獲取一株高產(chǎn)目的產(chǎn)物的微生物 問題 1 2采樣時(shí)要注意的問題 氣候 水分 空氣 來源要廣 結(jié)合產(chǎn)品的特點(diǎn) 標(biāo)簽 地點(diǎn) 時(shí)間 氣候等 富集的三種方案 定向培養(yǎng) 采用特定的有利于目的微生物富集的條件 進(jìn)行培養(yǎng) 1 3目的微生物富集的一些基本方法 富集的目的 讓目的微生物在種群中占優(yōu)勢(shì) 使篩選變得可能 當(dāng)不可能采用定向培養(yǎng)時(shí) 則可設(shè)計(jì)在一個(gè)分類學(xué)中考慮 不能提供任何有助于篩選產(chǎn)生菌的信息 這時(shí)只能通過隨機(jī)分離的辦法 定向培養(yǎng)的富集方法 1 底物 2 pH條件 3 培養(yǎng)時(shí)間 4 培養(yǎng)溫度 等一切能提高目的微生物相對(duì)生長速度的手段 培養(yǎng) 固體 液體 分批連續(xù) 后使目的微生物在種群中占優(yōu)勢(shì) 定向培養(yǎng)的方法 物理方法 加熱 膜過濾等 但主要是通過培養(yǎng)的方法 1 4菌落的選出 從產(chǎn)物角度出發(fā) 在培養(yǎng)時(shí)以產(chǎn)物的形成有目的的設(shè)計(jì)培養(yǎng)基 利用簡單 快速的鑒定方法 如抗生素 從形態(tài)的角度 菌落的外觀形態(tài) 是微生物的一個(gè)重要表征 如多糖產(chǎn)生菌在適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)基上生長 從具有粘液性的菌落外觀上就可以初步識(shí)別 例 醛肟水解酶的篩選 Journalofbiotechnology94 2002 65 72 培養(yǎng)基中含0 05 ofZ PAOx 每隔2 3天移去一半培養(yǎng)物 補(bǔ)充新鮮培養(yǎng)基 不斷分析樣品 2 3個(gè)月后Z PAOx降低后 稀釋分離單菌落 1 5目的微生物富集方法的研究進(jìn)展 分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)手段 在微生物鑒別及特定目標(biāo)產(chǎn)物的篩選方面發(fā)揮了著越來越重要的作用 如 16SRNA同源性分析 基因序列分析及DNA DNA雜交技術(shù)等 目前土壤中能夠培養(yǎng)的微生物不到總數(shù)的1 微生物的多樣性及資源的開發(fā)仍然是今后若干年的研究重點(diǎn) Incontrasttothistraditionalapproach modernmolecularbiologytechniquesallowforDNAlibraryexpressionscreening whichalsoenablesaccesstoenzymesof nonculturable organisms Bythisstrategy forinstance thecompanyDiversa SanDiego CA USA identised120uniqueesterases lipasesfromonly16 ofthetotalDNAobtainedfromanalkalinesoilsample 第二節(jié)自然選育 2 1定義利用微生物在一定條件下產(chǎn)生自發(fā)突變的原理 通過分離 篩選排除衰退型菌株 從中選擇維持原有水平的菌株 又稱自然分離 二 菌種退化的原因自發(fā)突變 異核體的存在 突變株不穩(wěn)定 移種 搖瓶初篩 2 2自然選育流程圖 第三節(jié)誘變育種 3 1定義將生物體暴露于物理 化學(xué)或生物誘變劑作用下 促使生物體發(fā)生突變 提高變異幅度 從而選出優(yōu)良菌種的過程 穩(wěn)定性試驗(yàn) 菌種特性考察 3 2誘變育種流程圖 3 3誘變劑 凡能提高生物體突變頻率的物質(zhì)稱誘變劑 3 3 1物理誘變劑紫外線 X射線 射線 快中子 離子束UV 260nm 是堿基共軛體系的最高吸收峰引起胸腺嘧啶二聚體的形成和胞嘧啶水合作用生物學(xué)效應(yīng) DNA鏈的斷裂 DNA分子內(nèi)和分子間的交聯(lián) 核酸和蛋白的交聯(lián) 實(shí)驗(yàn)室 15W 253 7nm 燈管與樣品的距離30cm 劑量由時(shí)間 30秒 60秒 90秒 120秒 或能量 格爾 決定 死亡率控制在70 90 誘變后注意要避光培養(yǎng) 因?yàn)楣鈴?fù)活現(xiàn)象 3 3 2化學(xué)誘變劑烷化劑 如亞硝基胍 NTG 硫酸二乙酯 DES 乙烯亞胺 EI 氮芥作用機(jī)制 使核酸的氮原子上烷基 從而使配對(duì)錯(cuò)誤 堿基類似物 5 氟尿嘧啶 5 溴尿嘧啶 2 氨基嘌呤 5 BU 酮式 5 BU 烯醇式 移碼誘變劑 丫啶橙 丫啶黃引起堿基喪失或增加抗癌藥物 絲裂霉素 爭光霉素抑制DNA復(fù)制3 3 3生物誘變劑噬菌體 轉(zhuǎn)座子 3 4菌種誘變的方法 誘變育種包括出發(fā)菌種選擇 誘變處理和篩選突變株三個(gè)部分 3 4 1出發(fā)菌種選擇原則 選取純種作為出發(fā)菌株選擇具有優(yōu)良性狀的菌株對(duì)誘變劑敏感的菌株 處理單孢子 或單細(xì)胞 懸液 芽孢桿菌應(yīng)處理芽孢 放線菌 霉菌應(yīng)處理孢子 細(xì)菌指數(shù)期 放線菌 霉菌要稍加萌發(fā)后使用 出發(fā)菌株應(yīng)制成均勻懸液 誘變劑的使用 劑量以誘變劑濃度和處理時(shí)間來表示 合適劑量 能擴(kuò)大變異幅度又能促使變異移向正變范圍的劑量 3 4 2誘變處理 還可加誘變?cè)鰪?qiáng)劑 如LiCl 充分利用復(fù)合處理的協(xié)同效應(yīng) 兩種或多種誘變劑先后使用 同種誘變劑重復(fù)使用 兩種或多種誘變劑同時(shí)使用 3 4 3突變株的選擇 3 4 3 1隨機(jī)篩選搖瓶篩選法瓊脂塊篩選法篩選自動(dòng)化和篩選工具微型化 3 4 3 2理性化篩選初級(jí)代謝產(chǎn)物高產(chǎn)菌株的篩選 篩選營養(yǎng)缺陷型若分別篩選 高產(chǎn)菌株 根據(jù)下列代謝途徑 應(yīng) ABCDEABCD EF 篩選E缺陷型 篩選F缺陷型 篩選細(xì)胞膜透性改變的突變株篩選油酸缺陷型或甘油缺陷型 篩選結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株結(jié)構(gòu)類似物一方面與代謝物結(jié)構(gòu)相似 有相似的反饋調(diào)節(jié)作用 一方面不同于代謝物不具有正常的生理功能 使細(xì)胞死亡 添加此類物質(zhì) 大部分細(xì)胞缺少該種初級(jí)代謝物而死亡 生長下來的菌株對(duì)此結(jié)構(gòu)類似物不敏感 不受此反饋調(diào)節(jié)抑制 HD 高絲氨酸脫氫酶 黃色短桿菌中賴氨酸的合成調(diào)節(jié)機(jī)制 HT 高絲氨酸轉(zhuǎn)乙酰酶 AK 天冬氨酸激酶 結(jié)構(gòu)類似物抗性 Lys的類似物AEC Thr的類似物AHV 營養(yǎng)缺陷型 如Thr缺陷型 黃色短桿菌F9 50的誘變譜系 BervibacteriumflavumAs1 495 Ile lys HCl2 1g l F6 16 Ile Thr 20 8g l F9 50 leu Thr AECr 33 5g l 利用回復(fù)突變篩選抗反饋突變株先選對(duì)產(chǎn)物敏感的菌株 再誘變處理得到恢復(fù)突變株 改變酶的調(diào)節(jié)位點(diǎn) 不受產(chǎn)物的反饋抑制 次級(jí)代謝產(chǎn)物高產(chǎn)菌株的篩選 篩選營養(yǎng)缺陷型 篩選負(fù)變株或零變株的回復(fù)突變株 篩選去磷酸鹽調(diào)節(jié)突變株磷酸鹽對(duì)許多抗生素的生物合成有抑制作用 篩選去除碳源分解代謝突變株能被菌快速利用的碳源在被代謝后 對(duì)其他代謝途徑的酶有抑制作用 例葡萄糖效應(yīng) 葡萄糖效應(yīng) 培養(yǎng)基中同時(shí)含有葡萄糖和乳糖 微生物先利用葡萄糖 葡萄糖利用完后才利用乳糖 出現(xiàn)兩次菌體生長旺盛時(shí)期 若加入乳糖酶誘導(dǎo)物 也不產(chǎn)生乳糖酶 而是在葡萄糖利用完后才產(chǎn)生 方法 將菌在含有葡萄糖和以組氨酸為唯一氮源的培養(yǎng)基連續(xù)傳代 篩選氨基酸結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株許多抗生素和氨基酸有共同的前體 篩選二價(jià)金屬離子抗性突變株二價(jià)金屬離子可與產(chǎn)物或其中間體結(jié)合 抑制產(chǎn)物合成 篩選前體或前體結(jié)構(gòu)類似物抗性突變株前體或前體結(jié)構(gòu)類似物對(duì)菌體的生長和抗生素的生物合成有抑制作用 篩選自身所產(chǎn)抗生素抗性突變株 第四節(jié)雜交育種 4 1定義將兩個(gè)基因型不同的菌株經(jīng)吻合或接合使遺傳物質(zhì)重新組合 從中分離和篩選具有新性狀的菌株 4 2舉例一株大腸桿菌A B Lac SMrT1s另一株大腸桿菌A B Lac SMsT1r混合培養(yǎng)后 長出少數(shù)菌落 4 2 1細(xì)菌雜交 在細(xì)菌中實(shí)現(xiàn)雜交的種類尚不多 主要是大腸桿菌 其他還有鼠傷寒沙門氏菌 銅綠假單胞菌 淋病奈氏球菌等 大腸桿菌中存著致育因子F 有F因子為F 沒有F因子稱F 整合狀態(tài)為Hfr F因子有明顯的感染性 大腸桿菌的接合 實(shí)質(zhì)上是F因子的轉(zhuǎn)移 所以F 和Hfr稱供體菌 而F 稱受體菌 4 2 2酵母雜交育種技術(shù) 酵母繁殖方式 酵母為單細(xì)胞型真菌 一般以出芽方式生殖 在通常情況下 繁殖體為雙倍體 但經(jīng)過特定條件的誘導(dǎo) 可使其產(chǎn)生單倍體孢子并可出芽產(chǎn)生單倍體繁殖體 單倍體細(xì)胞具 及 2兩種交配型 兩種交配型細(xì)胞經(jīng)其細(xì)胞壁上特定的凝聚因子誘導(dǎo)而進(jìn)行交配 恢復(fù)為雙倍體 同一交配型細(xì)胞之間 則因細(xì)胞壁上凝集因子的存在而不能進(jìn)行交配 在生活過程中 酵母細(xì)胞還可以形成三倍體 四倍體 多倍體或非整倍體細(xì)胞 一般而言 雜交育種運(yùn)用了酵母的單雙倍生活周期 將不同基因型和相對(duì)的交配型的單倍體細(xì)胞經(jīng)誘導(dǎo)雜交而形成二倍體細(xì)胞 經(jīng)篩選便可獲得新的遺傳性狀 第五節(jié)原生質(zhì)體技術(shù) 菌體經(jīng)溶菌酶處理后 去掉了細(xì)胞壁 露出球形且特別脆弱的原生質(zhì)體 它對(duì)滲透壓 振蕩 離心等十分敏感 但由于原生質(zhì)體結(jié)構(gòu)與生理活性均未發(fā)生改變 故在適宜的條件下 可以再生出細(xì)胞壁進(jìn)行細(xì)胞分裂 原生質(zhì)體制備和再生的過程 培養(yǎng)菌絲 細(xì)胞 洗滌菌絲 溶菌酶處理菌絲 形成原生質(zhì)體 離心 用高滲溶液洗滌原生質(zhì)體 原生質(zhì)體融合 第六節(jié)分子育種 6 1提高次級(jí)代謝產(chǎn)物的產(chǎn)量 基因工程技術(shù)提高抗生素產(chǎn)量的主要手段1 增加限速酶的基因拷貝數(shù)2 增加正調(diào)節(jié)基因 去除負(fù)調(diào)節(jié)基因3 增加抗性基因的拷貝數(shù) 6 1 1增加限速酶的基因拷貝數(shù) 原理 EaEbEcEdABCDE 代謝產(chǎn)物 限速酶Rate limitingenzyme Bottleneck 例1 起始原料EaEbEc aminoadipicacidACV三肽異青霉素N青霉素L cysteineL valineEa ACV合成酶 限速酶 Eb 異青霉素N合成酶Ec 異青霉素N?；饷?例2 頭孢菌素C生物合成的限速酶 在頭孢菌素C的工業(yè)發(fā)酵生產(chǎn)中 人們發(fā)現(xiàn)發(fā)酵結(jié)束后在得到的發(fā)酵液中 除了主要產(chǎn)物是頭孢菌素C外 在發(fā)酵液中還積累另一種產(chǎn)物 青霉素N 問題 積累中間產(chǎn)物 青霉素N原因 下一步反應(yīng)為限速酶反應(yīng)解決 導(dǎo)入額外的擴(kuò)環(huán)酶 羥化酶基因結(jié)果 使頭孢菌素C的產(chǎn)量提高25 50 積累的青霉素N消失 6 1 2增加正調(diào)節(jié)基因 去除負(fù)調(diào)節(jié)基因 調(diào)節(jié)基因根據(jù)其作用的不同分為正調(diào)節(jié)和負(fù)調(diào)節(jié) 正調(diào)節(jié)促進(jìn)生物合成結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄 負(fù)調(diào)節(jié)阻扼結(jié)構(gòu)基因的轉(zhuǎn)錄 去除負(fù)調(diào)節(jié)基因使結(jié)構(gòu)基因超量表達(dá) 6 1 3增加抗性基因的拷貝數(shù) 抗性基因的作用是避免抗生素產(chǎn)生菌被自身產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物所殺滅 其作用可通過三條途徑實(shí)現(xiàn) 抗性基因產(chǎn)物 酶 將抗生素作用的底物加以修飾 將抗生素的分子結(jié)構(gòu)加以修飾 使其失活 將抗生素分子排出細(xì)胞外 例1 DaviesJ 利用鏈霉菌質(zhì)粒pIJ702從卡那霉素產(chǎn)生菌克隆了6 N 氨基糖苷乙酰轉(zhuǎn)移酶AAC6 的基因 aacA 該基因產(chǎn)物在乙酰輔酶A的存在下 可將氨基糖苷類抗生素的氨基糖6 乙?；?將aacA基因轉(zhuǎn)入新霉素和卡那霉素的產(chǎn)生菌中 結(jié)果顯著提高了抗生素的產(chǎn)量 轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)化子 鏈霉菌細(xì)胞氨基糖苷類抗生素產(chǎn)量提高 卡那霉素6 乙酰轉(zhuǎn)移酶 AAC 6 的作用 例2 螺旋霉素抗性基因srmB重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化S ambofaciens 生二素鏈霉菌 轉(zhuǎn)化子使螺旋霉素產(chǎn)量提高 6 2改進(jìn)代謝產(chǎn)物的組分 鏈霉菌產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物常常是一組結(jié)構(gòu)相似的混合物 每個(gè)化合物稱為它的一個(gè)組分 多組分產(chǎn)生的分子基礎(chǔ)是因?yàn)榇渭?jí)代謝產(chǎn)物的合成酶對(duì)底物的選擇性不強(qiáng)以及合成途徑中分支途徑的存在 通過基因工程手段 滅活某分支途徑的酶 就可以去除該分支途徑的產(chǎn)物 此策略常用來去除發(fā)酵產(chǎn)物中的無用組分 提高有用組分的含量 只產(chǎn)Avermectin 2 組分基因工程菌的構(gòu)建 aveC脫水酶 阿維菌素 2 組分 阿維菌素 1 組分 aveC基因在染色體上的位置 重組質(zhì)粒的構(gòu)建 pC04 Bgl II p pC05 圖 1 8 質(zhì)粒 pC05 的構(gòu)建過程 Fig 1 8 Theproceduresinthe constructionofplasmidpC05 pC03 Ligase 重組質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化 轉(zhuǎn)化阿維菌素產(chǎn)生菌 tsrRamR tsrRamR Generep