實驗一 抗體的制備及效價檢測.doc

實驗一 抗體的制備及效價檢測一、實驗?zāi)康谋緦嶒炇菃慰寺】贵w技術(shù)的免疫階段的過程，為單克隆抗體技術(shù)提供免疫淋巴細(xì)胞。了解免疫的原理，掌握免疫方法和抗血清的制備技術(shù)，掌握雙向免疫擴(kuò)散法測定抗體的效價。二、實驗原理機(jī)體的特異性免疫反應(yīng)是指機(jī)體受抗原物質(zhì)刺激后產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫的過程。一種抗原能否引發(fā)抗體反應(yīng)，一方面取決于抗原分子表面有無特異性的化學(xué)結(jié)構(gòu)-抗原決定簇，另一方面取決于機(jī)體有無相應(yīng)的免疫活性細(xì)胞。當(dāng)上述兩個條件具備時，抗原進(jìn)入機(jī)體經(jīng)過一定的潛伏期，抗體效價逐步上升，達(dá)到高峰后，能維持一短暫的時期，以后又逐漸下降，但當(dāng)?shù)诙谓佑|相同的抗原時，抗體的上升較前次為快， 高峰時的效價也比前次為高。抗體持續(xù)的時間也較長，此也稱為再次反應(yīng)。完全福氏佐劑的使用能夠延長抗原在體內(nèi)的存留時間，增加可溶性抗原的免疫性。通常制備抗體時常用完全福氏佐劑加強(qiáng)免疫。抗原、抗體在合適的濃度和比例條件下，抗原和其相應(yīng)的抗體在有固相支持的液相環(huán)境中各自發(fā)生擴(kuò)散。分子雙向擴(kuò)散接觸時形成肉眼可見的沉淀線反應(yīng)?？贵w的效價即時指與固定濃度的抗原發(fā)生沉淀反應(yīng)時所需的最小抗體濃度。三、實驗步驟1動物的選擇：選擇2-3個月以上的小鼠。免疫作好標(biāo)號。分籠飼養(yǎng)。2抗原的選擇：將抗原（纖維素酶）稀釋為4 mg/ml，即可與佐劑混合制成乳劑用于動物免疫。3佐劑和抗原乳劑的制備佐劑 完全福氏佐劑：輕礦物油（石臘油）8.5 ml；羊毛脂1.5 ml；滅活結(jié)核桿菌10 mg?？乖閯┲苽?（1）油劑：礦物油和羊毛脂按比例混合，高壓8磅20分鐘滅菌后作為油劑，使用前微火融化。（2）水劑：滅活結(jié)核桿菌1 mg/ml + 抗原4 mg/ml （均為終濃度）。（3）油劑和水劑1：1混合?；旌戏绞剑貉心セ蛘咦⑸淦骰旌稀?免疫方法：小鼠背部皮下多點注射，每點0.1ml。第一次免疫：實驗組小鼠加佐劑的抗原。A組：每只小鼠背部、腋下多點注射，共計0.4 ml磷酸緩沖液。B組：每只小鼠背部、腋下多點注射，共計0.4 ml加佐劑的抗原乳劑。第二次免疫：第3周實驗組小鼠不加佐劑抗原。A組：每只小鼠背部、腋下多點注射，共計0.4 ml磷酸緩沖液。B組：每只小鼠背部、腋下多點注射，共計0.4 ml 2mg/ml纖維素酶液。第三次免疫：第二次免疫后1周，實驗組小鼠不加佐劑抗原。A組：每只小鼠背部、腋下多點注射，共計0.4 ml磷酸緩沖液。B組：每只小鼠背部、腋下多點注射，共計0.4 ml 2mg/ml纖維素酶液。第四次免疫：第三次免疫后1周，實驗組小鼠不加佐劑抗原。A組：每只小鼠背部、腋下多點注射，共計0.4 ml磷酸緩沖液。B組：每只小鼠背部、腋下多點注射，共計0.4 ml 2mg/ml纖維素酶液。5抗血清的制備第四次免疫一周后，乙醚麻醉小鼠，眼眶取血或心臟取血。收集的血液置于室溫下1h左右，凝固后，置4下，析出血清，離心，4000rpm,10min。在無菌條件，吸出血清，分裝（0.050.2ml），貯于-40以下冰箱，或凍干后貯存于4度冰箱保存。6抗體的效價檢測：雙向免疫擴(kuò)散法。瓊脂凝膠板的制備：膠布包圍一片載玻片使之形成不透水的槽。用生理鹽水加熱溶解瓊脂配成1%溶液，均勻澆注于玻片內(nèi)。注意勿產(chǎn)生氣泡，瓊脂厚度約2.5mm。打孔：待瓊脂凝固后，用去尖頭的吸頭（直徑約為3-4mm）在凝膠上打孔，孔間距為3-5mm。在小孔中加少量加熱的液體瓊脂，防止?jié)B漏。打孔樣式為梅花樣，如圖抗原:纖維素酶C組: 血清A組血清B組: 血清酶加樣：加樣于孔內(nèi)，左中間孔為抗原；右中間孔為無關(guān)抗原（牛血清白蛋白）；邊孔為不同濃度的抗體（系列用生理鹽水稀釋的抗體1-1/2-1/4-1/8-1/16-1/32，效價分析，本實驗不做）。注意不要外溢（加滿為止）。 結(jié)果觀察：加樣完畢，將瓊脂板平放于濕盒內(nèi)，在室溫或37 擴(kuò)散18-24小時后，觀察結(jié)果。四實驗結(jié)果五結(jié)果討論實驗內(nèi)容要求：（1）每組要求注射同一只小鼠；（2）在注射過程中，不要弄死小鼠；盡量選擇淋巴較多的部位，增加小鼠產(chǎn)生抗體能力；（3）免疫后小鼠取血時，盡量讓血取在離心管中；（4）效