【畢業(yè)學位論文】（Word原稿）兩個水稻花器官突變體的遺傳分析生物化學與分子生物學博士論文

密級： 論文編號： 中國農(nóng)業(yè)科學院 博士 學位論文 兩個水稻花器官突變體的遺傳分析 of he of I 摘 要 水稻是世界上最重要的糧食作物之一，也是單子葉植物發(fā)育分子生物學研究的理想模式植物。水稻花器官的結(jié)構(gòu)明顯不同于雙子葉植物 ， 正常水稻的小花從外到內(nèi)依次由 1 個 外穎、 1 個 內(nèi)穎、 2 個漿片、 6 個雄蕊和 1 個雌蕊組成。 植物花發(fā)育突變體的獲得和研究，在揭示花發(fā)育相關(guān)基因的作用及其相互關(guān)系， 探明植物生殖發(fā)育，特別是花發(fā)育的奧秘中起了十分重要的作用。水稻作為 糧食作 物的代表，研究 其 生 殖發(fā)育機制具有重要的理論意義和應用價值。 目前對水稻花發(fā)育的研究主要是利用雙子葉植物 因的保守序列設(shè)計引物，在水稻基因組文庫或 庫中篩選與雙子葉植物花器官發(fā)育相對應的 基因，然而大多數(shù)基因的確切功能因缺乏與性狀的連接點而無法確定。顯然，沒有花器官異常發(fā)育的突變體是難以開展此項研究的；而且，利用突變體研究基因的表達與功能也是當前功能基因組學的發(fā)展方向。 水稻花器官的發(fā)育結(jié)果直接影響稻谷產(chǎn)量 。 因此，利用水稻穎花突變體研究單子葉植物花器官發(fā)育的分子調(diào)控機制是目前植物分子遺傳學的研究熱 點。 我們從突變體庫中分別發(fā)現(xiàn) 3 份多穎突變體和 1 份凹陷內(nèi)穎突變體。本研究對這兩種突變體進行了花器官的解剖結(jié)構(gòu)觀察，突變性狀遺傳分析和相關(guān)基因的精細定位研究，主要結(jié)果如下： 1. 多穎突變體 研究 （ 1） 3份突變體的等位性實驗： 對 3份多穎突變體 進行正反交，并對 果表明這 3個突變體是等位的，相應的突變體分別命名為 （ 2）突變性狀的遺傳分析：以水稻 本晴和 浙輻 802為母本配制雜交組合進行性狀遺傳分析。所有組合 的表型， 說明突變體性狀是受隱性基因控制。 根據(jù) 2測驗結(jié)果表明，正常株與突變株的比例符合 1對基因控制的分離比 3:1，即該突變性狀是受 1對隱性基因控制的。 （ 3）花器官解剖結(jié)構(gòu)觀察：與正常水稻穎花結(jié)構(gòu)相比， 3個突變體大部分小花表現(xiàn)為多出一個穎殼，同時還會 表現(xiàn)為 雄蕊和雌蕊數(shù)目的改變、漿片轉(zhuǎn)變?yōu)轭愃品f殼的結(jié)構(gòu)，但是有一小部分小花是正常的。 漿片和雌雄蕊基本無變化或變化很??； 但是 出一個穎殼外， 該突變基因 還影響到所有的花器官，雄蕊數(shù)目在 0蕊數(shù)目在 0些小花的中心還產(chǎn)生了無法分辨的分生組織，約 25%的小花中，漿片同源轉(zhuǎn)化為類似穎殼狀的結(jié)構(gòu)，特別值得注意的是，在 少 20%的小穗在小花中心（ 3、 4輪）的花柄產(chǎn)生一至多個小花，這些額外的小花具有類似穎殼狀的結(jié)構(gòu)，偶爾含有 1外，一些 （ 4）突變體 基因精細定位：利用圖位克隆方法， 從 2代中鑒定出突變體表型的植株用作定位群體，運用 染色體短臂上 物理距離為 31 在這一區(qū)域內(nèi)，共有 2個開放閱讀框。 2. 凹陷內(nèi)穎突變體 研究 （ 1） 水稻凹陷內(nèi)穎突變體的遺傳分析： 在抽穗期，對 本晴 2個組合的 2代植株進行調(diào)查。結(jié)果表明， 2個組合的 明突變體性狀是受隱性基因控制。對 2測驗結(jié)果均為 2 c2 0 . 0 5=正常株與突變株的 比例符合 1對基因控制的分離比 3:1，進一步表明該突變性狀是受 1對隱性基因控制的。 （ 2） 花器官觀察：突變體穎花除了正常水稻穎花所具有的 1個外穎、 2枚漿片、 6枚雄蕊和 1枚雌蕊外，也具有 1個內(nèi)穎，但是發(fā)育不良，致使整個小花呈彎曲狀。 （ 3） 突變體 基因 精細 定位： 利用 圖位克 隆 方法， 從 與 用 染色體短臂上 物理距離為 17 在這一區(qū)域內(nèi)， 只 有 1個開放閱讀框。 關(guān)鍵詞 ： 水稻 ， 花器官 ， 發(fā)育 ， 遺傳分析 ， 基因 ， 精細定位 .) is of in a of in an of A of as of in an a of on to an in of in in on is in in 0 by of of as or it is to of A of of is a in s on of of of of in We of of is In we of of of of as 1. of ( 1） as （ 2） of in 1 2 In 1 is in 2 of in a :1 is by （ 3） of No in of in to in an of of a ee In of in or no in of of as an or in , in , in of a of or in a of at 0% of or in c of , 4) of -3 （ 4） G1 To G1 by a G1 in .7 cM on by We G1 to a 31 kb by 13 F2 2. of ( 1） of of is （ 2） of in 1 2 In 1 is in 2 of in a 3:1 is by V （ 3） P2 P2 in .8 cM 45 on by We P2 to a 17 kb by 038 F2 錄 摘 要 . I . 文縮略表 . 1 第一章 緒論 . 2 言 . 2 等植物花序和花器官發(fā)育的分子生物學研究 . 3 花序形成的分子生物學 . 4 器官發(fā)育的 分子生物學 . 5 雙子葉植物花器官的區(qū)別 . 10 稻花發(fā)育研究進展 . 10 稻花分生組織特征基 因 . 10 稻花器官發(fā)育基因的研究 . 12 子標記及其在水稻遺傳研究中的應用 . 15 子標記的研究 進展 . 15 于分子雜交的分子標記 . 15 于 分子標記 . 16 酶切相 結(jié)合的分子標記 . 17 型分子標記 . 18 子標記在水稻遺傳研究中的應用 . 19 稻分子遺 傳連鎖圖譜的構(gòu)建 . 19 稻基因定位和克隆 . 20 子標記在水稻育種上的應用 . 20 稻基因 的圖位克隆 . 21 位克隆的技術(shù)環(huán)節(jié) . 22 建遺傳作圖群體 . 22 選與目標基因連鎖的分 子標記 . 23 部區(qū)域的精細定位、作圖 . 24 色體步行、登陸 . 25 定目標基因 . 25 位克隆技術(shù)在水稻中的應用 . 26 研究的目的和意義 . 30 第二章 水稻多穎突變體的鑒定、遺傳分析及基因 的精細定位 . 31 料和方法 . 31 驗材料 . 31 間雜交及 傳群體的構(gòu)建 . 31 常用分子生物學試劑 . 31 驗方法 . 32 份突變體的等位性分析 . 32 穎突變體的遺傳分析 . 32 態(tài)解剖學觀察 . 32 稻 取 . 32 應體系 . 33 泳檢測 . 33 定位的 記 . 34 過新發(fā)展的 記精細定位 因 . 34 據(jù)分析 . 35 果與分析 . 35 稻多穎突變體的等位性測定和遺傳分析 . 35 份突變體的等位性實驗 . 35 穎突變體的遺傳分析 . 35 稻多穎突變體 形態(tài)特征 . 36 變體的植株形態(tài) . 36 花的解剖結(jié)構(gòu) . 36 稻多穎 因的精細定位 . 38 因的初步定位 . 38 用新發(fā)展的 記精細定位 因 . 38 論 . 40 第三章 水稻凹陷內(nèi)穎突變體的鑒定、遺傳分析及基因的精細定位 . 42 料和方法 . 42 驗材料 . 42 間雜交及 傳群體的構(gòu)建 . 42 用分子生物學試劑 . 42 驗方法 . 42 果與分析 . 42 稻凹陷內(nèi)穎突變體的遺傳分析 . 42 稻凹陷內(nèi)穎突變體 形態(tài)特征 . 43 稻凹陷內(nèi)穎 因的精細定位 . 44 因的初步定位 . 44 用新發(fā)展的 記精細定位 因 . 44 論 . 45 第四章 結(jié)論及進一步的研究設(shè)想 . 47 論 . 47 穎突變體 研究 . 47 凹陷內(nèi)穎突變體 研究 . 48 一步的研究設(shè)想 . 48 參考文獻 . 49 致 謝 . 60 作 者 簡 歷 . 61 中國農(nóng)業(yè)科學院博士學位論文 第一章 緒論 1 英文縮略表 英文縮寫 英文全稱 中文名稱 細菌人工染色體 局部排列搜索工具 bp 基對 割擴增長度多態(tài)性 補 摩 溴化十六烷三甲基銨 氧核糖核酸 DH 倍單倍體 脫氧核糖核苷三磷酸 乙二胺四乙酸 基磺酸乙酯 表達序列標簽 kb 堿基對 等基因系 1質(zhì)粒人工染色體 聚合酶鏈式反應 量特性定位 糖核酸 組自交系 轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈式反應 二烷基硫酸鈉 單序列重復（微衛(wèi)星） 列標簽位點 中國農(nóng)業(yè)科學院博士學位論文 第一章 緒論 2 第一章 緒論 言 水稻 (.)是人類賴以生存的 主要糧食作物，全世界約有 1/2 的人口以大米為主食。水稻不僅是重要的糧食作物，而且還是單子葉植物分子生物學研究的模式植物。水稻的基因組是禾谷類作物中最小的，有 38995%完成測序(2005)；水稻中已經(jīng)建立了高密度的分子標記連鎖圖 (水稻基因組與其他禾本科作物如小麥、玉米等有很高的共線性和基因間的同源性，在比較基因組研究中有較大的利用價值 (1998； 2003)；水稻中建立了比較良好的遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng) (et 1994)，目前已成為遺傳學和基因組研究的模式植物。 雙子葉植物的花從外到內(nèi)依次花萼、花瓣、雄蕊和心皮四輪花器官組成。單子葉植物的花分生組織及花器官組成的許多特征明顯不同于雙子葉植物。水稻等在單子葉植物的花具有與雙子葉植物類似的雄蕊和雌蕊繁殖器官， 但它們沒有明顯的雙子葉植物所具有的花萼和花瓣結(jié)構(gòu)，圍繞雄蕊和雌蕊繁殖花器官的是外穎、內(nèi)穎和漿片。水稻的花器官在禾本科單子葉植物中具有代表性。水稻花序分生組織的單位是小穗，小穗由小花和兩個穎片組成，小花從外到內(nèi)依次由外穎、內(nèi)穎、2個漿片、 6枚雄蕊和 1個雌蕊 (包括 1個子房和 2個柱頭 )組成 。 禾本科植物的花器官雄蕊和雌蕊是保守的 (Ma 2000)；漿片被認為是雙子葉植物花瓣的同源器官也已得到許多實驗結(jié)果的證實（ et 000； et 1998）。然而外 穎和內(nèi)穎與雙子葉植物和其他單子葉植物的花器官之間是怎樣的關(guān)系，目前仍不清楚。最簡單的解釋是：外穎和內(nèi)穎都是與雙子葉植物花萼一致的器官。然而外穎和內(nèi)穎在形態(tài)上存在差異，而且排列上也不同 (即不是在同一輪中形成的 )。在水稻中，還沒有表明外穎和內(nèi)穎不是同一器官的報道。因而，水稻中外穎或內(nèi)穎突變體的發(fā)現(xiàn)及其深入的研究對了解單子葉植物花器官外輪形態(tài)結(jié)構(gòu)建成機制 具 是非常有意義的。近年來，花器官的發(fā)育受到人們的廣泛關(guān)注并成為現(xiàn)代分子生物學研究的焦點之一。這不僅是因為花在植物的生長發(fā)育中處于中心位置，而且花器官的發(fā)育過程為研 究基因表達調(diào)控與器官的形態(tài)發(fā)生之間的關(guān)系提供了一個非常獨特的系統(tǒng)。通過對花發(fā)育遺傳機制的理解，中國農(nóng)業(yè)科學院博士學位論文 第一章 緒論 3 我們就能通過基因工程的手段改變花分生組織和花的發(fā)育，控制作物的開花時間。 我們在水稻中發(fā)現(xiàn)了兩個花器官突變體，一個表現(xiàn)為內(nèi)穎發(fā)育不完全，并且造成小穗和谷粒形狀的不正常，命名為凹陷內(nèi)穎（ ， 另一個表現(xiàn)為除內(nèi)穎和外穎外多出一個穎殼，有的還出現(xiàn)多重穎殼，命名為多穎（ ， 這二者都是水稻穎殼突變體，對它們進行研究，對了解水稻花器官發(fā)育的分子調(diào)控機制， 外穎和內(nèi)穎之間以及二者與雙子葉植物花器官之間的對應關(guān)系， 完善水稻花器官發(fā)育模型， 拓寬人們對單子葉植物花器官外輪形態(tài)結(jié)構(gòu)建成機制 具有十分重要的理論意義 。 導師錢前研究員長期從事水稻經(jīng)典遺傳、分子遺傳和育種研究。 他所領(lǐng)導的創(chuàng)新小組在水稻優(yōu)異種質(zhì)資源的發(fā)掘、創(chuàng)新和利用、遺傳學研究群體的構(gòu)建和基因定位、生物技術(shù)的實用化和產(chǎn)業(yè)化等領(lǐng)域開展研究，許多研究已處于國內(nèi)外同類或相關(guān)研究的前列 。在 刊物上 發(fā)表了多篇文章，積累了寶貴的經(jīng)驗和方法。作者在此基礎(chǔ)上，廣泛查閱國內(nèi)外的相關(guān)文獻資料，結(jié)合實際情況，研究了 凹陷內(nèi)穎和多穎水稻花器官突變體的形態(tài)解剖結(jié)構(gòu)、突變性狀的遺傳分析及突變相關(guān)基因的分子標記精細定位，為突變相關(guān)基因的克隆和進一步的基因功能研究奠定基礎(chǔ)。對這 2個水稻花發(fā)育 突變體材料的研究將有助于我們深入了解水稻花器官發(fā)育的分子機理。但限于博士學位論文有限的研究時間、作者有限的知識積累，本文對這 2 個水稻花發(fā)育 相 關(guān)突變體材料的研究只 是一個初步的工作，離導師的要求和期望相距甚遠，并且有些問題在 博士論文期間還沒有 得到很好地解決，尚需要今后從各方面進行進一步的深入研究。 等植物花序和花器官發(fā)育的分子生物學研究 花是植物中最復雜、最吸引人的器官。千百年來，人們一直尋求揭示植物開花潛在的奧秘。 20 世紀 80 年代以前，對開花的研究多限于形態(tài)及純生理方面的研究。 20 世紀 80 年代后期，隨著分子生物學和分子遺傳學研究方法和技術(shù)的發(fā)展，借助于現(xiàn)代生物技術(shù)結(jié)合模式植物的開花突變體，開花遺傳研究在短短的十幾年內(nèi)獲得了突飛猛進的進展，成為發(fā)育生物學研究中最引人矚目的熱點。 花的發(fā)育是顯花植物生殖生長期最明顯的特征，植物開花是一個 高度受控的過程，近十多年來，利用模式植物擬南芥和金魚草的花發(fā)育突變體，已經(jīng)分離了大量的與花序和花器官形態(tài)有關(guān)的基因，伴隨著這些基因的分離及分析，人們對以擬南芥為代表的植物開花的分子機制有了深入的了解，提出了一些試圖系統(tǒng)解中國農(nóng)業(yè)科學院博士學位論文 第一章 緒論 4 釋有關(guān)基因控制的假說，已取得令人矚目的進展。 花序形成的分子生物學 花序的形成，即莖端分生組織 (花分生組織的轉(zhuǎn)變，由花分生組織特性基因 (制，這類基因在成花轉(zhuǎn)變中 被激 活， 又控 制著下 游花 器官 特性 基因和 級聯(lián) 基因 的表 達 (et 1998)。 是擬南芥中控制莖向花轉(zhuǎn)變的一個主要基因，其強突變體基部花完全轉(zhuǎn)變?yōu)槿~芽，頂部花表現(xiàn)出部分花的特性 (1991)，即使在 因失活的情況下，最終還是會成花，表明還有其他基因促進花序向花的轉(zhuǎn)變。 的功能與 分冗余，其表達時期晚于 者具有加性效應，能相互