細胞顯微注射-資料中心-生物在線

受精卵原核顯微注射實驗目的1 了解受精卵顯微注射的基本原理及動物轉基因制作過程2 掌握受精卵顯微注射基本技術實驗原理顯微注射技術是利用顯微操作系統(tǒng)和顯微注射技術將外源目的基因直接注入到受精卵的原核中，使外源基因整合到受體細胞的基因組內，再通過胚胎移植技術將整合有外源基因的受精卵移植到受體動物的子宮內發(fā)育，從而獲得轉基因動物。它是目前基因轉移效率較好的一種基因轉移方法，可直接用不含有原核載體DNA片段的外源基因進行轉移；外源基因的長度不受限制,可達100kb；實驗周期相對比較短。由于顯微注射技術直接對基因進行操作，整合率較高，因而是目前建立轉基因動物極為重要的方法。 儀器、材料和試劑（一）儀器和耗材：1.PN-30拉針儀（Narishige）2. OLYMPUS SZX7實體鏡3. EG-400磨針儀（Narishige）4. MF-900 鍛針儀（Narishige）5. OLYMPUS IX71倒置顯微鏡6. Narishige顯微操作系統(tǒng)7. JM-250電泳儀（大連捷邁）8 眼科手術器械及顯微手術器械（ROBOZ）9. 毛細玻璃管G-100，GC-1（Narishige）10.細胞培養(yǎng)箱（Heraeus）、超凈工作臺、塑料平皿等。（二）試劑1.目的基因制備相關試劑1.1 分子克隆相關試劑：TaqDNA聚合酶，DNA 連接酶，各種內切酶等1.2受精卵制備相關試劑：孕馬血清（PMSG），人絨毛膜促性腺激素（HCG），透明質酸酶等1.3 轉基因載體制備相關試劑1.3.1 細菌培養(yǎng)基（1）LB培養(yǎng)基（1L）： NaCl 10g， 酵母提取物5g，蛋白胨10g ，pH7.0（2）2YT培養(yǎng)基(1L)：NaCl 5g， 酵母提取物10g，蛋白胨16g 1.3. 2 質粒提取溶液配制溶液：L-葡萄糖50mM，Tris-Cl(pH8.0) 25 mM，EDTA(pH8.0) 10mM，121.5 高壓滅菌20min。溶液（100ml）：1N NaOH 20ul，10%SDS 10ml，水90ml現用現配。溶液（100ml）：5mM乙酸甲60ml，冰乙酸11.5ml，水28.5ml。1.4胚胎培養(yǎng)及注射緩沖液：胚胎培養(yǎng)液M16(5.533g NaCl, 0.356g KCl, 0.252g CaCl22H2O, 0.162g KH2PO4, 0.293g MgSO47H2O, 2.101gNaHCO3, 2.610g Sodium lactate, 0.036g Sodium pyruvate, 1.00g Glucose, 4.00g BSA, 0.06g Penicillin G potassium salt, 0.05g Streptomycin sulfate, 0.01g Phenol Red, 用三蒸水定容至1L)，也可以用商品化的M16培養(yǎng)基。 受精卵操作培養(yǎng)液M2 (5.533g NaCl, 0.356g KCl, 0.252g CaCl22H2O, 0.162g KH2PO4, 0.293g MgSO47H2O,0.349g NaHCO3, 4.969g HEPES, 2.610g Sodium lactate, 0.036g Sodium pyruvate, 1.00g Glucose, 4.00g BSA, 0.06g Penicillin G potassium salt, 0.05g Streptomycin sulfate, 0.01g Phenol Red, 用三蒸水定容至1L)，也可以用商品化的M2培養(yǎng)基。注射緩沖液（5-10mM tris-HCl pH7.4，0.1-0.25mM EDTA） 1.5 轉基因鑒定相關試劑（1）核酸提取組織裂解液：TrisCl (pH7.4) 25mM，EDTA 100mM，SDS 0.5%，protease K 100ug/ml.（3）PCR鑒定試劑：TaqDNA聚合酶，dNTP，引物等 方法與步驟（一）外源基因的制備及純化相對其他轉基因方法來說，用于顯微注射的載體構建簡單，最典型的載體主要包括：載體在細菌中擴增的相關元件（復制原點，篩選抗性基因等）；真核表達相關元件（啟動子、增強子、目的基因、Poly A等）（如下圖）為了增強目的基因表達，可在目的基因中引入內含子或者直接用含內含子的基因組序列。為了提高目的基因整合的幾率，在注射前需用限制性內切酶將載體線性化并盡量去掉原核序列。另外，注射的用DNA的純度要求比較高，不能有微小顆粒和提取過程中有害雜質，否則會對細胞造成毒害，一般要求用cscl梯度離心純化。所用的TE的濃度比一般溶解DNA所的TE有所區(qū)別，該TE由 510mmol Tris(pH7.4)和0.1-0.25mM EDTA組成。注射用的DNA的濃度一般為13ug/ml，濃度高有助于提高目的基因的整（1）根據所用的轉基因載體特點，選擇特定的限制性核酸內切酶將包含完整真核表達元件及目的基因的片段切下，進行瓊脂糖凝膠電泳，電泳完畢在紫外燈下將含目的轉基因的片段的瓊脂糖凝膠切下，操作時盡可能減少凝膠的體積。將所得凝膠塊放入透析袋中，電泳2-3小時使凝膠中的DNA片段完全游離出凝膠并粘貼到透析袋壁上。去除透析袋中的凝膠塊，將貼有DNA片段的透析袋放入到新鮮的電泳液中再電泳3-5分鐘，收集袋中含DNA片段溶液。（2）用Tris-HCl飽和酚抽提DNA溶液數次，以去除瓊脂糖、蛋白等雜質，然后用乙醚抽提3次，留下層液體。（3）用2倍體積無水乙醇沉淀2-3次， 70%乙醇洗2-3次，用2.4ml Tris-HCl(pH8.0)，1mM EDTA溶解沉淀（至少需含5-10ug DNA），然后加入3g超純CsCl，待其充分溶解后，檢測其密度是否是1.700.01g/ml，如果有差異，可用CsCl或Tris/ EDTA緩沖液進行調整。（4）將調整好密度的溶液轉移到1.3cm5.0cm超速離心管中，然后加幾滴石蠟油封管，40000rpm室溫離心48h（Bekman SW50.1轉子），離心完畢，用針頭在離心管底部扎孔收集管底約0.2ml組份，另外抽取離心管中部組份，用瓊脂糖凝膠電泳進行鑒定是否含有DNA，最后將含DNA的組份與離心管底部組份合并。（5） 收集到的DNA溶液裝入透析袋，于4在大體積的注射緩沖液中透析48h，期間換透析液5-7次。（6） 將充分透析的DNA溶液經0.2um濾膜過濾除菌，電泳定量其濃度。按20ul/管分裝凍存待用。（二）實驗動物的繁育通常用于制作轉基因小鼠的實驗動物主要有近交系C57BL/6J，CBA/J、C3H/HeJ、DBA/2J、SJL等以及遠源雜交系CD1、KM等。制作過程中需要高質量的供卵鼠、可育雄鼠、不育雄鼠以及假孕母鼠（代孕鼠），這些動物需要飼養(yǎng)在濕度（50-70%）和溫度（19-22）均可控且具有過濾系統(tǒng)的環(huán)境中，因為光照時間對小鼠的性周期影響較大，繁育環(huán)境明暗周期一般控制為12h，為早6:00-晚6:00。1、受精卵供應鼠可選用4到6周齡的C57BL/6J CBA/J、C57BL/6JSJL、 C57BL/6JC3H/HeJ、 C57BL/6JDBA/2J 及C3H/HeJDBA/2J等產生的F1代雌鼠，也可以用4到6周CD1、KM等遠源雜交系雌鼠。2、可育雄鼠可選用8周齡以上的C57BL/6J CBA/J、C57BL/6JSJL、 C57BL/6JC3H/HeJ、 C57BL/6JDBA/2J 及C3H/HeJDBA/2J等產生的F1代雄鼠，也可以用CD1、KM等遠源雜交系雄鼠3、結扎雄鼠取6周左右的C57BL/6J CBA/J、C57BL/6JSJL、 C57BL/6JC3H/HeJ、 C57BL/6JDBA/2J 及C3H/HeJDBA/2J等產生的F1代雄鼠或者CD1、KM等遠源雜交系雄鼠，按5ml/kg的劑量腹腔注射10的水合氯醛麻醉，待其完全麻醉后，用虹膜組織剪剪去腹部被毛，用75酒精檫拭消毒，用虹膜剪在沿腹中線靠近生殖器約1.5cm處開一約1cm長的開口，用彎頭眼科鑷子在腹腔內兩側各找到白色的脂肪墊，夾著輕輕往外拉直到睪丸外露，在睪丸的下方可見輸精管，將另一眼科鑷子在酒精等上燒紅后夾住輸精管，將其燒斷。用同樣的方法將另一側的輸精管燒斷?？p和好創(chuàng)口，將小鼠保溫安放，待其蘇醒，術后一周，挑2-4只6周左右的雌鼠與之合籠，一個月后雌鼠未見懷孕則標志手術成功。4、代孕鼠由6周齡以上上述F1代雌鼠與結扎雄鼠交配所成。其性周期與受精卵供應鼠保持一致。（三）受精卵的制備本實驗選用CD1背景鼠作為實驗小鼠，選取10只5-6周齡的雌性小鼠，于下午1:00-2:00按5IU/只腹腔注射孕馬血清(PMSG),46-48小時之后注射按5IU/只腹腔注射人絨毛膜促性腺激素(HCG)。然后與可育雄鼠合籠交配，次日晨選出有陰道栓的雌鼠準備取受精卵。因為外源基因注入原核者整合到染色體上的比例最高，注人細胞質內的整合率很低。因此，取卵的時間應選在卵子受精后，雌雄原核已形成，但二者尚未結合的發(fā)育階段為宜。取受精卵過程如下圖：查栓當天10:00-12:00將有陰道栓的小鼠處死，經剝離后將完整的輸卵管帶一小段子宮剪下，置于M2培養(yǎng)液中，在解剖鏡下找到輸卵管的膨脹壺腹部，用細尖頭鑷子撕開即見帶有卵丘細胞的卵子自行流出。有時會遇到受精卵已從壺腹部遷移到輸卵管的狹窄部位，此時可用沖洗的辦法。先準備1毫升注射器和已磨鈍的4號注射針頭，吸取預熱37 的培養(yǎng)液，將取下的輸卵管置于6厘米培養(yǎng)皿中，針頭從喇叭口插人，并用鑷子輕輕夾住喇叭口固定針頭以防脫滑，這時慢慢地推動注射器即可見到卵子隨培養(yǎng)液由子宮端流出。此法操作方便且不丟失卵子。隨后將帶有卵丘細胞的受精卵移入含有l(wèi)mg/ml透明質酸酶,(Hyaluronidase)的M2培養(yǎng)液內，溶去卵丘細胞，立即用預先拉制的吸管將卵子吸至新鮮的M2培養(yǎng)液中洗滌2-3次，然后再將受精卵吸至另外新鮮M2培養(yǎng)液中，如此進行4-5次，直至視野中沒有組織碎片和血細胞為止。最后將受精卵吸至已經CO2平衡的M16培養(yǎng)液滴中（約50ul），液滴上再覆蓋一層胚胎級石蠟油，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待卵原核發(fā)育清晰飽滿后即可做顯微注射。整個實驗過程所用的解剖器械、玻璃器皿、溶液等，均需滅菌以防污染。（四）代孕鼠的制備在供卵鼠與可育雄鼠合籠當天，挑選處于發(fā)情期的CD1雌鼠（6周齡以上，最好生育過）與結扎雄鼠合籠，第二天早上檢查交配情況，標記有陰栓者，可做代孕鼠。（五）顯微注射系統(tǒng)的建立1、注射針的拉制 選用外徑為1mm，內徑0.75-0.8mm帶芯毛細玻璃管，裝在水平拉針儀上，擰緊左右兩側的夾子，做好固定，并使其中間部位對準加熱絲。設定好電流、拉力和時間。然后按開始鍵，等待毛細管被拉成兩個所需的微注射針頭。由于不同廠家生產的玻璃毛細玻璃管參數存在細微差異，所以，不同廠家同一型號的玻璃毛細玻璃管拉針參數組合不同，需要預先摸索。為了防止空氣中灰塵顆粒沾染注射針引起針尖阻塞，注射針需現用現拉制且最好使用硼硅酸鹽玻璃的毛細管。另外可以采用硅烷對注射針頭進行處理，以防樣品和培養(yǎng)基成分與玻璃的親水表面相互作用，從而引起針尖阻塞而影響注射。如果拉制的注射針不虹吸DNA溶液，可將毛細玻璃管放入盛有0.1mol/L HCl的燒杯中浸洗2-4小時，然后用自來水沖洗數次，再用三蒸水清洗數次，經高壓滅菌后即可利用。2、持卵針的制作選用外徑為1mm，內徑0.75mm無芯毛細玻璃管作為制作持卵針的材料，裝在拉針儀上，擰緊左右兩側的夾子，做好固定，并使其中間部位對準加熱絲。設定好電流、拉力和時間。按鍵拉出針坯，用細沙輪在直徑為80-100um處將玻璃針切斷，盡量使斷面平齊，然后在煅針儀上處理斷面，將斷面燒圓；也可以先在煅針儀的鉑金絲上燒制一小玻璃泡，在中溫情況下將針坯直徑為80-100um處貼上玻璃泡，偶后斷電冷卻玻璃泡，利用熱脹冷縮斷列針坯前端，盡量使斷端平齊。然后對斷面進行光滑處理。最后用酒精燈焰或煅針儀鉑金絲在距針尖2-3mm處，將針坯彎成450（如下圖）。（六）顯微注射操作過程1、注射針頭裝液將用注射緩沖液稀釋的DNA溶液（13ug/ml）12000rpm離心5min，用經三蒸水清洗過的移液頭將上清轉移至另一同樣經三蒸水清洗的ependorf管中作為注射DNA。使用帶芯毛細玻璃管拉出注射針，將針頭后部浸入DNA溶液中，深度約為1mm，注意不要用手指或其他東西接觸針頭及針尖，通過虹吸作用，DNA溶液很快就到達針尖部。另外也可直接使用無菌的微量加樣器從微注射針頭的后部加入0.51l的注射樣品。2、注射針頭及持卵針的定位將裝液后的針頭的游離端安在注射連接器上，然后旋緊連接器以固定針頭，再將其固定到微操作儀的托針管上。同樣將持卵針的針頭安在卵固定連接器上，然后旋緊連接器以固定針頭，再將其固定到微操作儀的托針管上。3、顯微注射的操作：（1）在35cm的培養(yǎng)皿中央加一滴約50ul的M2培養(yǎng)基，加入5ml液體石蠟油并將培養(yǎng)皿液滴調整到顯微鏡視野中央，然后吸取10-20枚細胞核清晰的受精卵吹到液滴中央，在吹卵過程中盡量不要吹出氣泡以免影響視野。（2）用低倍物鏡對準受精卵調焦，輕輕的落下針尖，并將注射針尖推入視野中心，通過微操作系統(tǒng)的微調調整注射針位置，直到清晰見到針尖為止。（3）將目鏡轉到工作放大倍數（20-40），移動顯微鏡載物臺，使注射針尖位于石蠟油中，轉動注射針相連的注射器在注射針內形成正壓，檢驗是否在針尖形成液泡，如果沒有說明注射針被堵塞，換新的注射針。用同樣的方法調整持卵針的位置，使持卵器開口端正對注射針尖。然后在中倍放大倍數（10）下，調節(jié)持卵針注射器使持卵針內形成負壓，吸取邊緣清晰、形狀飽滿且細胞核明顯的受精卵，通過改變注射器的壓力，調整受精卵的位置，使受精卵的雄性細胞核正對注射針尖且兩者之間的距離最小。將放大倍數調至工作倍數（目鏡20-40），進一步調整顯微鏡焦距和注射針及持卵針的位置，使細胞核和注射針尖均達到最佳清晰程度。推動操縱桿，小心進針，使注射針針尖進入細胞核。（4）加大注射壓，直到細胞核明顯脹大為止，。（5）輕而迅速往外拔針頭，直到離開細胞。（6）移動顯微鏡載物臺，找到下一個細胞，重復以上步驟。注射完畢，將受精卵放回M16中，在細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，吸取下-批受精卵繼續(xù)進行，直到注完為止。將注射過受精卵培養(yǎng)過夜。注意事項1 . 在整個過程中，嚴禁將注射針尖對著人員和儀器，因為注射針在持針器上安裝不牢時或針尖堵塞，注射器、管子及注射針內的壓力，可能將注射針射出。2 .注射時注射器的壓力不宜變化太快，否則會造成注射量操作難以控制，導致細胞核內環(huán)境改變過快過大甚至脹破細胞。3 在注射過程中，常發(fā)生注射