液相色譜教程(三)相色譜實驗操作.ppt

液相色譜教程(三)液相色譜實驗操作,Waters中國有限公司培訓中心,啟動液相色譜儀器的流程,開啟HPLC系統(tǒng)各個設備的電源打開泵、自動進樣器、檢測器電源，待設備通過自檢后，打開計算機，啟動色譜管理軟件準備流動相過濾,脫氣色譜泵排氣用新配制的流動相灌注泵,啟動液相色譜儀器的流程,用準備好的流動相平衡色譜系統(tǒng)可在泵的控制面板上設定流速參數(shù)(155泵需在軟件控制下操作)系統(tǒng)大約需平衡0.5-1小時方能穩(wěn)定工作準備樣品用流動相溶樣或重組樣品編制儀器方法,開始實驗,液相色譜對流動相的要求,色譜柱對流動相的要求過濾除去微粒純度的要求超純水，或用KMnO4處理過的雙蒸水有機溶劑：色譜純(溶劑中的雜質含量盡可能低)，并與填料相匹配緩沖液的pH值，在填料的允許范圍(一般在pH2-8)內緩沖液（鹽）的濃度不要太高(100mM)流動相對樣品的溶解度調整有機溶劑和水的比例最好用流動相溶樣,液相色譜對流動相的要求,液相色譜儀器對流動相的要求與檢測器匹配脫氣避免用含鹵素離子的緩沖鹽（不銹鋼系統(tǒng)）溶劑的粘度防止細菌的生長,流動相的脫氣,流動相脫氣的目的使色譜泵的輸液準確輸液量均勻準確，并且脈動減小保留時間及色譜峰面積的重現(xiàn)性提高提高檢測的性能防止氣泡引起的尖峰基線穩(wěn)定，信噪比增加溶劑的紫外吸收本底降低保護色譜柱減少死體積防止填料的氧化,流動相脫氣的方法,加熱簡單，如同抽真空一起使用，其效果很好。但容易造成流動相組成的變化抽真空同上，一般在溶劑抽濾的同時，也有脫氣的效果超聲波振蕩簡單，但效果不夠理想；超聲時間不要太長(1分鐘左右即可)通惰性氣體（一般用氦氣）可保持在線連續(xù)脫氣，多用于低壓梯度在線脫氣機（in-linedegasser)可保持連續(xù)脫氣，多用于低壓梯度,流動相的保存,有機溶劑流動相:室溫下密封,避光保存緩沖鹽流動相:當日現(xiàn)配現(xiàn)用低溫下密封保存,一般不超過3天防止微生物生長有機溶劑與水（緩沖鹽）混配的流動相:低溫密封保存防止有機相的揮發(fā)選用適宜的容器,分,保存于聚乙烯瓶中的超純水,測試條件水樣:40mltraceenrichment2.0ml/min色譜柱:C18反相柱(Waters)梯度:線性100%水100%乙腈波長:254nm,保存于棕色玻璃瓶中的超純水,測試條件水樣:40mltraceenrichment2.0ml/min色譜柱:C18反相柱(Waters)梯度:線性100%水100%乙腈波長:254nm,色譜泵的排氣操作,色譜泵實驗前，應先確認泵頭內沒有氣體，如有氣體要按以下步驟排氣：將泵入口管吸濾頭放入脫過氣的流動相中打開泵及在線脫氣機電源開關將排液閥打開，或斷開與色譜柱連接的管路設置流速到6-9ml/min,排液閥出口有液流連續(xù)流出必要時(600泵)用10ml注射器從泵入口注入流動相對于600,2695四元梯度泵,分別對所用各路溶劑進行排氣操作停止泵流速,關閉排液閥,恢復斷開的管路,備用注:泵排氣后,應輸液穩(wěn)定(系統(tǒng)壓力脈動小,一般在幾十Psi以內),否則,需重做排氣操作,Waters515泵的前面板,電源開關柱塞桿清洗孔排液閥,Waters600泵的前面板,柱塞桿清洗孔,電源開關,排液閥,泵控制器,泵體,泵灌注閥,Waters2695分離單元,2695排氣操作示意圖,面板操作:打開狀態(tài)(Statas)畫面按右下角DirectFunction功能鍵選DryPime或WetPrime命令選OK即可進行泵的排氣注:當流路中充滿空氣時,按圖示做DryPrime若只是更新流動相時,只須作WetPrime,關于色譜系統(tǒng)的反壓,什么是反壓(backpressure)流動相流經(jīng)管路及色譜柱時會有阻力,即所謂的反壓,又稱系統(tǒng)反壓或系統(tǒng)壓力Waters習慣用的壓力單位是Psi(磅/平方英吋)其它單位有:Bar,Mpa影響系統(tǒng)反壓的主要因素:流動相的溶劑組成溫度流速,反壓與溶劑組成的關系,流動相的粘度是產生反壓的主要原因有機溶劑水的粘度隨組成而改變其壓力隨組成變化如下圖所示,反壓與流速的關系,流速對反壓的影響是線性關系流速增加，反壓亦增大下圖的實驗條件：2.130mmSymmetryC18柱,20,反壓與溫度的關系,溫度對反壓的影響是反比關系溫度升高,反壓降低,對某些流動相的影響更大一些,影響系統(tǒng)反壓的其它因素,反壓與色譜柱長度成正比反壓與填料顆粒度的平方成反比2.5m填料比3.5m填料反壓高反壓與管路直徑的四次方成反比(1/D4)反壓與管路的長度成正比,色譜泵的運行,排氣后的色譜泵即可用于實驗運行注意排氣后，先設流速為0恢復排氣時斷開的部分，如:進樣器、色譜柱如需要，恢復排氣時斷開的控制線根據(jù)色譜柱的不同，逐漸提高流速到設定值若使用緩沖鹽流動相,用前和用后均需用水過渡(包括排氣操作),色譜泵的維護保養(yǎng),流動相要過濾常用緩沖液時，停泵前要用水清洗泵頭，并用水沖洗柱塞桿清洗孔關閉排液閥時，不要太用力擰緊，以不滲液為準更換流動相時，要保證兩種溶劑的互溶性,如不互溶，要用一種中間溶劑過渡色譜泵在停用時,應先用水洗去緩沖鹽,然后用純甲醇充滿泵頭及管路,并保存在純甲醇中,液相色譜系統(tǒng)的清洗與鈍化,色譜泵吸濾頭,進出口閥及管路(包括進樣器和檢測池)若被污染,應作清洗和鈍化處理一般采用30磷酸水溶液作為清洗劑，用6M硝酸作為鈍化劑，先清洗再鈍化清洗的目的是去除不銹鋼管路及系統(tǒng)內的污垢鈍化的目的是使不銹鋼管路的內表面形成光滑均勻的氧化膜,色譜泵及系統(tǒng)的清洗,清洗液用30%磷酸水溶液30%磷酸配制:取85%濃磷酸35ml與65ml水混勻清洗步驟如下:取下色譜柱，用兩通(Union)連接進樣器和檢測器用純水灌注泵頭(四元泵的A,B,C,D四路各為25%)用30%磷酸清洗液洗系統(tǒng)(1ml/min流速)45分鐘(四元泵的A,B,C,D四路各為25%)換成清水洗至出口水pH顯中性用純甲醇過渡，浸潤泵頭及管路，備用,色譜泵及系統(tǒng)的鈍化,鈍化液用6M硝酸水溶液6M硝酸的配制:取濃硝酸40ml與60ml水混勻鈍化步驟如下:在清洗步驟完成后進行鈍化處理確認清洗用的磷酸已基本洗凈用純水灌注泵頭(四元泵的A,B,C,D四路各為25%)用6M硝酸水溶液鈍化系統(tǒng)(1ml/min流速)45分鐘換成清水洗至出口水pH顯中性用純甲醇過渡，浸潤泵頭及管路，備用,實驗樣品的制備,標樣和樣品標樣:又稱對照品,它作為液相色譜定性和定量分析的參考標準物,一般是純度較高的純物質樣品:待測物,一般是成分復雜的混合物液相色譜對樣品(包括標樣)制備的要求:必須能溶于流動相如樣品的溶劑不是流動相,一定要用流動相試溶解度,以免在進樣時樣品在流動相中析出,堵塞管路和色譜柱樣品溶液要過濾除去微粒及雜質了解樣品對色譜柱的基質/填料是否有破壞作用,復雜樣品的預處理,樣品預處理的目的除去微粒減少干擾雜質濃縮微量的組份提高檢測的靈敏度及選擇性改善分離的效果有利于保護色譜柱及儀器,樣品預處理的重要性,是影響實驗成敗的決定性步驟占樣品分析時間的比例最大樣品預處理所用時間遠多于色譜分離的時間占分析消耗總成本的比重最大消耗大量的溶劑及其它化學品對分析結果的重現(xiàn)性及準確性影響最大的環(huán)節(jié)影響實驗結果好壞的最重要因素,樣品預處理常用的方法,高速離心取上清液過濾、超濾選擇性沉淀衍生反應液-液萃取固相提取(SolidPhaseExtract,SPE)Oasis和Sep-Pak固相提取小柱其它,去除微粒的方法,過濾過濾膜/過濾裝置有機濾膜(0.5m)/水溶性濾膜(0.45m)膜片可更換一次性使用的膜“Cartridge”使用方便簡單，交叉污染小有更小內徑，可用于微量樣品的處理高速離心大于：10,000rpm,超濾,機理超濾是一種基于分子量分離的技術目的根據(jù)分子量的不同把分子、細胞及病毒等分為不同的餾份除去小分子樣品中的大分子蛋白脫鹽,選擇性沉淀,常用于生化樣品中除蛋白有機溶劑乙腈，甲醇強酸三氯乙酸，高氯酸鹽50%硫酸銨10%TCA(三氯乙酸鈉),樣品衍生,提高檢測的靈敏度增加紫外基團以增強紫外檢測的靈敏度增加熒光基團以便使用高靈敏度熒光檢測器改變分離的選擇性改變組份的基團，如：變離子型化合物為非離子型，用反相方法分離典型的例子柱前衍生氨基酸分析,AccQ-Tag衍生法,濃縮樣品,目的：富集微量或痕量組份濃縮樣品的方法萃取/吹干沉淀/再溶解色譜法固相提取Oasis小柱Sep-Pak小柱,OasisHLB固相提取小柱,親水-親脂平衡共聚物,“親水”使填料具有水可浸潤性質降低與水的接觸角,“親脂”提供對被分析物質的反相保留能力,這是適合于分析眾多基質中大多數(shù)樣品的通用操作步驟建議首先使用這種通用的操作步驟如果需要進一步降低干擾物的影響，可使用二維SPE方法注:此方法于規(guī)格為3cc,60mg的OasisHLB小柱上開發(fā),樣品預處理的通用SPE方法,SPE處理的效果,進樣器的使用,進樣器的種類:手動進樣器7725i自動進樣器717Plus，2695樣品管理系統(tǒng)進樣器與系統(tǒng)的連接：進樣器的入口與色譜泵的出口相連進樣器的出口與色譜柱的入口相連要求：出入口方向不能接錯，接頭不能留有空隙進樣器的連接管路：出口管路一定要用細管(內徑0.009),長度要短,盡量減少譜帶擴展,手動進樣器的使用,7725i手動進樣器的進樣方式:固定體積進樣:進樣量取決于Loop的體積可變體積進樣:進樣量由微量注射器量取注意:固定體積進樣需要用超過Loop體積5-10倍的樣品量進樣,以保證進樣濃度不被稀釋可變體積進樣在注射器注入樣品后,應盡快將進樣器扳至Inject位置,以避免樣品在Loop中的擴散進樣器的清洗:每次進樣前應將微量注射器清洗干凈,防止樣品間交叉污染,影響實驗結果,自動進樣器的使用,自動進樣器(717Plus和2695樣品管理系統(tǒng)):樣品瓶位置和進樣量由軟件設定注意:樣品瓶中應有超過13瓶高度的樣品量使用內襯管(Insert)時應設定針高度為2mm(2695)或75%高度(717Plus)進樣器的清洗:進樣針是流路的組成部分,運行中一直由流動相清洗進樣針外部由軟件控制在每次進樣前用洗針液清洗若注射器內出現(xiàn)氣泡，用面板操作的PurgeInject功能清除之,自動進樣器的洗針液,注意洗針溶劑瓶(內放綠色塑料管)不要放在儀器的上部，應放于與儀器同一水平面的實驗臺上,洗針溶劑根據(jù)流動相的不同應有不同：,檢測器的啟動操作,連通流路：色譜柱出口接檢測器入口注意接頭不要留有空隙連接管路要用細管(0.009)檢測器出口用適當?shù)墓苈?內徑,長度)通向廢液瓶連通數(shù)據(jù)線路:IEEE電纜(對大多數(shù)檢測器)與軟件busLAC/E卡連接手動進樣器的啟動信號線與檢測器背板上的InjectStart接口連接開啟電源開關后,需待檢測器通過自檢后,才能被軟件控制(約需5-10分鐘)通流動相平衡至少30分鐘后才能正常工作,Waters2487檢測器,2487的顯示屏幕,通道,吸光度,燈開/關,波長,靈敏度,下一畫面,運行時間(分),自控/遙控,診斷開/關,鍵盤鎖開/關,單/雙波長,Shift開/關,AUFS(AbsorbanceUnitFullScale):滿量程吸光度單位,2487的面板及操作,回車鍵,分屏顯示鍵,選項移動鍵,主屏幕,方法調用，A/B通道切換,設置及診斷,單/雙波長，自動調零,運行/停止鍵,第二功能鍵,監(jiān)視色譜圖,屏幕對比度,Waters2996PDA檢測器,PDA(PhotoDiodeArray):光電二極管矩陣,由軟件設定檢測器參數(shù),只需設定如下參數(shù)即可采集數(shù)據(jù)波長范圍分辨率每秒采集的光譜數(shù)操作極為簡便不需費神選擇參比波長及其帶寬,Waters2414示差折光檢測器,2414的顯示屏幕,沖洗參比池,折射率,極性,RIU量程,檢測器溫度,下一畫面,運行時間(分),自控/遙控,鍵盤鎖開/關,模式,Shift,2414的面板及操作,回車鍵,屏幕對比度,選項移動鍵,主屏幕,方法調用，溫度設置,自動調零,運行/停止鍵,第二功能鍵,監(jiān)視色譜圖,沖洗參比池,設置及診斷,下一頁,2414檢測器的日常操作,設定檢測器內、外(如有柱溫箱)溫度以5ml/min的流速“purge”參比池五分鐘不接色譜柱！參數(shù)設置按文獻值或實驗決定至少需要2小時以上的平衡時間通常檢測器可以在白天結束工作后不關機，保持0.1到0.5ml/min的流速循環(huán)沖洗樣品池和參比池,可節(jié)省第二天的平衡時間,使用示差檢測器的注意事項,不能做梯度實驗最大的池耐壓是100psi注意保持出口管路的暢通流速范圍是0.1-10ml/min此種類型檢測器是壓力敏感和溫度敏感型檢測器注意保持泵壓力的平穩(wěn)注意環(huán)境溫度的恒定,Waters2475熒光檢測器,2475檢測器的特點,可調波長熒光檢測器雙掃描在掃描模式下(Scan)發(fā)射波長及激發(fā)波長均可掃描高靈敏度水的RAMAN峰S/N大于200可編程時間-波長時間-增益由RS232串行口或網(wǎng)線與計算機相連,2475的主顯示屏,發(fā)射/能量,燈開/關,下一頁,運行時間(分),面板/軟件控制,鍵盤鎖/開,Shift開/關,單/多波長,通道選擇,增益,波長,診斷鍵開/關,靈敏度,2475的面板及操作,回車鍵,分屏顯示鍵,選項移動鍵,主屏幕,方法調用，通道切換,設置診斷,自動調零,運行/停止鍵,第二功能鍵,監(jiān)視色譜圖,開關燈,屏幕亮度調節(jié),光譜掃描,2475熒光檢測器的掃描功能,掃描功能由面板功能執(zhí)行Empower英文版亦能由軟件執(zhí)行,熒光檢測器使用注意事項,不是所有化合物都有熒光