單抗系列培訓(xùn)完整版PPT

單克隆抗體,分享人：李行,2017.08,單抗基本概念,單抗發(fā)展歷程,單抗制備原理,單抗實際應(yīng)用,實驗存在的問題,報告內(nèi)容,單抗簡介,1975年Kohler和Milstein建立了淋巴細胞雜交瘤技術(shù)，使經(jīng)綿羊紅細胞（SRBC）免疫的小鼠脾細胞和小鼠的骨髓瘤細胞融合，創(chuàng)立了第一個B細胞雜交瘤細胞株，獲得了抗SRBC的單克隆抗體。單抗技術(shù)的問世，不僅帶來了免疫學(xué)領(lǐng)域里的一次革命，而且它在生物醫(yī)學(xué)科學(xué)的各個領(lǐng)域獲得極廣泛的應(yīng)用，促進了眾多學(xué)科的發(fā)展。因此說單抗技術(shù)是免疫學(xué)，乃至醫(yī)學(xué)史上的一個里程碑。,抗體生產(chǎn)技術(shù)的三個時代：多克隆抗體單克隆抗體基因工程抗體,1.抗原1.1傳統(tǒng)抗原基本概念：能啟動機體的免疫應(yīng)答，且能與其免疫應(yīng)答產(chǎn)物(抗體或免疫效應(yīng)細胞)特異性結(jié)合，并產(chǎn)生一系列生物學(xué)效應(yīng)的物質(zhì)。,1.2現(xiàn)代抗原概念：能被B細胞免疫球蛋白受體識別或與主要組織相容性復(fù)合體（MHC）結(jié)合后能被T細胞受體識別的物質(zhì)統(tǒng)稱為抗原。,1.3抗原的兩種基本特性：（1）免疫原性：指抗原分子能夠刺激機體產(chǎn)生免疫應(yīng)答（產(chǎn)生特異性抗體及免疫效應(yīng)細胞）的性質(zhì)。,（2）反應(yīng)原性：指抗原分子與免疫應(yīng)答產(chǎn)物（抗體或免疫效應(yīng)細胞）發(fā)生特異性結(jié)合的性質(zhì)。,1.4完全抗原與半抗原,（1）完全抗原：具有免疫原性和反應(yīng)原性的物質(zhì)。（2）半抗原又稱不完全抗原：無免疫原性，只有抗原性的物質(zhì)。（3）載體（carrier）：與半抗原結(jié)合使其成為免疫原的物質(zhì)。如BSA，OVA半抗原+載體完全抗原,1.5抗原表位（抗原決定簇）：指抗原分子中決定抗原特異性的特殊化學(xué)基團。即抗原上可以引起機體產(chǎn)生抗體的分子結(jié)構(gòu)。一個抗原可以有許多不同的抗原決定簇。,抗體（Antibody,Ab）基本概念：機體免疫細胞被抗原激活后，由分化成熟的終末B細胞-漿細胞合成、分泌的一類能與抗原特異性結(jié)合的具有免疫功能的免疫球蛋白。,3.免疫球蛋白（immunoglobulin,Ig）：具有抗體活性或化學(xué)結(jié)構(gòu)與抗體分子相似的球蛋白。,2.抗體,備注：Ab=Ig,IgAb,Ab是功能描述，Ig是化學(xué)結(jié)構(gòu)的描述。,基本結(jié)構(gòu)：重鏈（heavychain，H）2條輕鏈（lightchain，L）2條可變區(qū)（variableregion,V區(qū)）恒定區(qū)（constantregion,C區(qū)）超變區(qū)（hyper-variableregion,HVR),又稱互補決定區(qū)（complementarydeterminingregion,CDR）骨架區(qū)（frameworkregion,FR）鉸鏈區(qū)（hingeregion）,3.1免疫球蛋白的結(jié)構(gòu),可變區(qū),Ig的兩條長鏈稱為重鏈（Heavychain，H鏈），重鏈可分為：，對應(yīng)的Ig的種類：IgM,IgG,IgA,IgD,IgE.,Ig的兩條短鏈稱為輕鏈，可分為，；每個Ig分子的兩條輕鏈完全相同。,4.多克隆抗體（polyclonalantibody,PcAb）：指由不同B細胞克隆產(chǎn)生的針對抗原物質(zhì)中多種抗原決定簇的多種抗體混合物。如：免疫血清（含多種特異性抗體）。,5.單克隆抗體（monoclonalantibody，McAb）：是由淋巴細胞雜交瘤產(chǎn)生的、只針對復(fù)合抗原分子上某一單個抗原決定簇的特異性抗體。,6.細胞克?。河梢粋€細胞增殖而成的細胞群體。,克隆能夠保持親本的絕大部分性狀。,8.多克隆抗體和單克隆抗體的優(yōu)劣勢,融合,在具有篩選作用的培養(yǎng)基中培養(yǎng),篩選出分泌抗體的細胞，進行克隆化,SP2/0,B細胞和SP2/0死亡,1.抗原制備不管是制備單抗還是多抗，抗原的設(shè)計與制備都是一個非常重要的問題，設(shè)計或者制備得不好的抗原有可能完全不能免疫出抗體來。,1.1一個良好的抗原必須具備的條件：（1）分子量：一般是分子量越大，免疫原性越強，對于多肽或蛋白質(zhì)類的抗原來說，一個抗原決定簇（又叫表位，epitope），通常由6-8個氨基酸殘基組成。而平均每5-10kD才有一個表位，因此分子太小的多肽或蛋白是很難有一個表位的。,（2）化學(xué)結(jié)構(gòu)與組成：結(jié)構(gòu)盡量復(fù)雜。簡單重復(fù)的物質(zhì)是不具有免疫原性的，拿明膠來說，它的分子量非常大，而且外源性也很強，但是組成明膠的氨基酸多為直鏈氨基酸，在體內(nèi)容易被降解，因此它的免疫原性很弱。蛋白質(zhì)：a.氨基酸組成：含芳香族氨基酸（特別是酪氨酸），免疫源性強。b.結(jié)構(gòu)：環(huán)狀的免疫原性強；直鏈，免疫原性弱。多糖：具有免疫原性，較蛋白質(zhì)弱。核酸：多無免疫原性。,（3）外源性強。在個體形成的早期就對自身物質(zhì)形成了免疫耐受，因此如果和機體內(nèi)的物質(zhì)完全一樣或者是相似就很難引起機體的免疫應(yīng)答。,（4）可降解性好。作為抗原，必須是可以降解的，塑料、不銹鋼等難降解的物質(zhì)免疫原也很弱。含L-氨基酸的蛋白質(zhì)易降解，具有免疫原性。但是由D-型氨基酸組成的物質(zhì)免疫原性很弱，同樣是因為機體不能降解D-氨基酸組成的蛋白或多肽。,2.免疫方案,2.1動物的選擇：常見的可以用來制備抗體的動物有：小鼠、大鼠、豚鼠、倉鼠、兔、綿羊、山羊、馬、驢、奶牛，還有用雞或者鴨的。需考慮的問題：第一個問題是能否具有較好的免疫效果.第二個問題是抗血清產(chǎn)量的問題.,2.2免疫佐劑：先于免疫原或同時與抗原混合注射機體可增強抗原的免疫原性的物質(zhì)。,（1）顆?？乖庖咝詮?，不加佐劑就可獲得很好的免疫效果，如細胞類抗原、電泳跑蛋白膠。（2）可溶性抗原免疫原性較弱，一般要加佐劑。油性佐劑：福氏完全佐劑、福氏不完全佐劑；無機化合物微生物及其產(chǎn)物脂質(zhì)體細胞因子,2.4抗原與佐劑的乳化,2.5免疫途徑：（1）體內(nèi)免疫：皮下，腹腔，肌肉，靜脈等（2）體外免疫：較少。,2.3免疫劑量：根據(jù)免疫原、免疫途徑、免疫動物、免疫佐劑有關(guān)。一般的免疫劑量是微克級別。,2.6免疫時間間隔：一般間隔2-3個星期。,抗體產(chǎn)生的一般規(guī)律,初次應(yīng)答：抗原初次進入機體產(chǎn)生的應(yīng)答。,特點：潛伏期（誘導(dǎo)期）長（7-10天）；抗體的種類以IgM為主；抗體的親和力低；維持時間短；總抗體水平低。,再次應(yīng)答：抗原再次進入機體所產(chǎn)生的應(yīng)答。,特點：潛伏期短（約2-3天）；抗體的種類以IgG為主；抗體的親和力比初期應(yīng)答明顯增強；維持時間長；總抗體水平高。,3.免疫鼠血清的采集和檢測,小鼠第三次免疫1周后，免疫組對小鼠進行眼球靜脈采血，收集血清，血清交由檢測負責(zé)人，該負責(zé)人對血清進行檢測。,（1）免疫酶技術(shù)：ELISA，IPMA（2）免疫熒光技術(shù)：IFA（3）間接血凝實驗（4）放射免疫檢測,4.雜交瘤細胞株的建立,SP2/0的準備,飼養(yǎng)層細胞的制備,脾細胞（B細胞）的制備,脾細胞和SP2/0的融合,單克隆抗體的制備與鑒定,雜交瘤的篩選,細胞的凍存和復(fù)蘇,實驗關(guān)鍵！,4.1試劑和耗材,4.1.1試劑：DMEM、胎牛血清（FBS）、HAT、HT、50%PEG，青、鏈霉素、生理鹽水;,4.1.2儀器：生物安全柜、二氧化碳培養(yǎng)箱、水平離心機、倒置顯微鏡；,工具：止血鉗，剪刀、直頭眼科鑷子、彎頭眼科鑷子,4.2,進行細胞融合的前一天，準備飼養(yǎng)層細胞：8-10周齡BALB/c雌性小鼠;用注射器向腹腔內(nèi)注射DMEM，輕輕揉壓小鼠腹膜，抽出腹腔內(nèi)液體，收集到一個離心管中，反復(fù)操作3次左右;離心1000rpm,5min,棄上清，重懸細胞，鋪板密度2x105。,實驗流程,4.2.2準備飼養(yǎng)層細胞:取靜止?fàn)顟B(tài)的腹腔巨噬細胞,4.2.1骨髓瘤細胞SP2/0的培養(yǎng)：對數(shù)生長期,4.2.3脾細胞（B細胞）的制備：融合前3天加強免疫小鼠,（1）注射器反復(fù)吹打法（2）研磨法,（1）生物方法：病毒誘導(dǎo)的細胞融合（2）化學(xué)誘導(dǎo)：PEG誘導(dǎo)50%PEG(10004000)（3）物理誘導(dǎo)：電融合,4.2.4脾細胞和SP2/0的融合：融合方法主要有以下幾種方法,細胞融合,融合過程中的注意事項：（1）SP2/0細胞和免疫脾細胞的數(shù)量比例適當(dāng)，1:5-1:10；（2）兩種細胞狀態(tài)要好，洗吹細胞一定要輕柔；（3）PEG融合之后，加培養(yǎng)基中和時要緩慢，以免破壞融合的細胞。,雜交瘤細胞的篩選（第一次篩選）,5、陽性雜交瘤細胞的篩選（第二次篩選）：篩選時機的把握,（1）免疫酶技術(shù)：ELISA應(yīng)用最多。,（2）免疫熒光技術(shù)：IFA（3）間接血凝實驗（4）放射免疫檢測（5）免疫印跡分析（6）免疫沉淀（7）免疫組化和功能中和試驗,重要思考：“你的抗體用于什么就用什么去篩”，篩選策略必須能夠反映所需抗體隨后的用途。,選擇篩選策略時，必須要考慮下面的因素：（1）能夠處理多達1000個樣品（約120ul/樣品）的能力；（2）48h內(nèi)能夠完成鑒定的能力；（3）是否具備必要的試劑/設(shè)備；（4）反應(yīng)的特異性；（5）實驗體系的靈敏度；（6）最重要的是否能得到結(jié)果。,篩選時融合前的免疫血清作為陽性對照，這樣確保所有的技術(shù)、試劑、設(shè)備是最合適的。同樣，用培養(yǎng)雜交瘤細胞的培養(yǎng)基作為陰性對照。,6、雜交瘤細胞的克隆化：指將抗體陽性孔進行克隆化。目的是將抗體分泌細胞、抗體非分泌細胞、特異性抗體分泌細胞和無關(guān)抗體分泌細胞分開。6.1克隆化的原則：盡早進行，一般要進行2-3次克隆。,6.3克隆化的方法主要包括以下：,克隆之前制備飼養(yǎng)細胞,6.2,（1）有限稀釋法:其原理是，將培養(yǎng)孔內(nèi)細胞用槍或吸管吹打使之懸浮，然后用計數(shù)板進行計數(shù)，最后按每孔0.5-1個細胞的量將原孔細胞稀釋滴至新的培養(yǎng)板上（事先制備好飼養(yǎng)層細胞），培養(yǎng)一段時間以后就可以看到部分孔有單個克隆形成（理論上講最終每孔的細胞個數(shù)在整體上服從泊松分布）優(yōu)點:a、最簡單的克隆化方法；b、不需要太多的儀器設(shè)備，操作也不復(fù)雜。缺點：a、由于計數(shù)不準確或者移液器的偏差，最終導(dǎo)致操作結(jié)果不理想；b、由于細胞經(jīng)過吹打的剪切力破壞，細胞也不一定能夠按期望生長。,（2）半固體培養(yǎng)法:原理和做分子克隆時的菌落篩選有點類似半固體培養(yǎng)原理和做分子克隆時的菌落篩選有點類似;其方法是將雜交瘤細胞與液體低融點的瓊脂糖或甲基化纖維素溶液混合，然后將其倒入含有事先制備的飼養(yǎng)層的培養(yǎng)板上，冷后后培養(yǎng)基呈固態(tài)，在37培養(yǎng)一段時間后，單個雜交瘤細胞會形成類似菌落的小克隆，可以用槍頭將其挑出到培養(yǎng)板上在液體培養(yǎng)基里培養(yǎng)，這樣也可以實現(xiàn)克隆化。優(yōu)點：a、操作比較直觀簡單，缺點：對半固體培養(yǎng)基的要求比較高，容易出現(xiàn)細胞不生長或者污染情況發(fā)生。,（3）顯微操作法把陽性孔里的細胞稀釋到足夠稀，靜置半小時后細胞會沉淀到孔底，然后在顯微鏡下用槍直接吸取一個單細胞轉(zhuǎn)移到含有飼養(yǎng)層細胞的孔內(nèi)培養(yǎng)即可。優(yōu)點：最初級、最直觀、最省腦力和人力的辦法，步驟簡單。,（4）熒光激活細胞分離法：流式細胞術(shù),7.細胞的凍存和復(fù)蘇,及時對各階段陽性雜交瘤細胞進行凍存,凍存步驟：（1）吹下需凍存的細胞；（2）1000rpm離心5min，棄上清；（3）用凍存液將細胞重懸，之后凍存；（4）將細胞放入細胞凍存盒內(nèi)，然后將其直接放入-80冰箱過夜（不小于12h），之后將細胞轉(zhuǎn)入液氮中。,細胞復(fù)蘇步驟：（1）從液氮中取出細胞，迅速置于37水浴鍋中融化細胞；-快?。?）直接將細胞加入瓶（25cm2）中，并加入含20%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基貼壁培養(yǎng),12小時后，充去上清，換入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。,8.單克隆抗體的生產(chǎn),8.1在產(chǎn)生特異性抗體的雜交瘤細胞分離、克隆并凍存建庫后，擴增雜交瘤細胞可以生產(chǎn)抗體。處于對數(shù)生長期的雜交瘤細胞培養(yǎng)上清可產(chǎn)生3-20ug/ml的抗體。-抗體產(chǎn)量低,8.2目前單克隆抗體生產(chǎn)包括腹水制備和細胞培養(yǎng)兩種方法。,8.2.1腹水制備流程：（1）提前7天，小鼠腹腔注射0.5ml石蠟油；（2）小心吹打細胞瓶底部，使細胞從瓶底脫落，收集細胞；（3）室溫1200r/min離心6min，棄上清；（4）用不完全培養(yǎng)液DMEM或生理鹽水按照0.5ml/只鼠懸浮細胞；（5）將細胞懸液注射到小鼠腹腔；（6）7-10天后小鼠腹腔明顯鼓起后，采集腹水。,8.2.2細胞培養(yǎng)生產(chǎn)單抗：利用滾瓶、轉(zhuǎn)瓶和CELLine瓶制備單抗。（1）在單克隆抗體的產(chǎn)量方面，滾瓶和轉(zhuǎn)瓶較一般的細胞培養(yǎng)瓶只有少許優(yōu)勢。（2）CELLine：膜式雙室技術(shù)的一種的體外細胞培養(yǎng)系統(tǒng)。,9、單抗特性的檢測：,9.1抗體特異性：除用抗原進行抗體檢測，還應(yīng)用與抗原成分相關(guān)的其他抗原進行交叉實驗，方法：ELISA等。9.2單克隆抗體亞類的鑒定商品化試劑盒9.3WesternBlot分析9.4抗體的中和活性9.5抗體的親和力9.6抗體對應(yīng)抗原的分子量9.7抗體的識別表位,10.抗體純化,（1）初步純化鹽析法有機沉淀法凝膠過濾法（2）精細純化親和層析法離子交換層析法疏水層析法反向?qū)游龇?生物安全柜,II級A2型生物安全柜最常用,生物安全水平與實驗室類型,世界通用生物安全水平標準是由美國疾病控制中心(CDC)和美國國家衛(wèi)生研究院(NIH)建立的。,級生物安全柜是一種負壓過濾排風(fēng)柜。防止操作者和環(huán)境暴露于實驗過程中產(chǎn)生的生物氣溶膠。（1）保護實驗操作者在操作時，室內(nèi)空氣被抽入前面的格柵，產(chǎn)生一個空氣屏障，防止有生物危險的懸浮微粒散入室內(nèi)。（2）保護實驗樣品層流的、HEPA過濾的空氣向下，通過工作面，防止室內(nèi)空氣進入，防止樣品存在交叉污染。（3）保護實驗室環(huán)境在空氣離開柜前，必須通過一個排氣HEPA濾膜，確保排出柜體的氣流是潔凈的，對環(huán)境無害。,細胞培養(yǎng)箱,倒置顯微鏡,含血清的DMEM,96孔細胞板,48孔細胞板,24孔細胞板,6孔細胞板,1.為什么免疫后沒有效價或免疫后效價低？,（1）設(shè)計的抗原與被免疫的動物內(nèi)源蛋白有極高的同源性或者抗原是免疫原性極差的小分子物質(zhì)。對于前一種情況應(yīng)該重新設(shè)計抗原，設(shè)計抗原時盡量選取目標蛋白特異性的序列，可以設(shè)計為短肽然后再與載體蛋白偶聯(lián)之后免疫；對于后一種情況，首先確認抗原質(zhì)量是否良好，可改用其它廠家的產(chǎn)品或改用同一廠家的其它批號，也可考慮改變抗原分子的部分結(jié)構(gòu)，或改進提取方法；制備的免疫原是否符合要求，可從偶聯(lián)劑、載體、抗原與載體的連接比例、反應(yīng)時間等多方面去考慮，并加以改進；如果偶聯(lián)沒有問題，可以更換其它的載體蛋白，如KLH。,（2）免疫的周期不正確。免疫周期過長或過短，各免疫步驟之間的間隔過長或過短都有可能影響免疫效果。,（3）免疫佐劑不合適。弗氏佐劑也不能保證完全有效，TiterMax等佐劑在免疫時，對于某些抗原可能效果不佳，此時可以考慮更換佐劑嘗試。,（4）免疫劑量不合理。過大的免疫劑量可能導(dǎo)致免疫耐受，過少的免疫劑量可能無法激活免疫應(yīng)答。,（5）免疫途徑不合理。,（6）測效價的過程存在錯誤操作，尤其考慮包被是否成功或二抗使用是否正確。同時，一抗（即血清）稀釋梯度盡量放寬，一般建議從1:500或1:1000開始作梯度稀釋。對于多肽和小分子物質(zhì)，效價達到1:2000甚至更低仍可視為免疫成功。,（7）動物的飼養(yǎng)是否得當(dāng)，如營養(yǎng)（飼料、飲水）、環(huán)境衛(wèi)生（通風(fēng)、采光、溫度）是否符合要求，動物的健康情況是否良好等。,2.為什么融合后細胞不長或者融合后克隆很少？（1）免疫用的動物品系不正確或者品系不純。免疫用的動物一般應(yīng)該與骨髓瘤來源的動物是相同品系，例如使用SP2/0骨髓瘤細胞時應(yīng)該選用Balb/C小鼠，同時必須使用品系純正的小鼠。（2）培養(yǎng)基中加入了過高濃度的HAT，或者僅A的濃度過高或HT的濃度過低，建議用純的骨髓瘤和已有的雜交瘤作HAT濃度篩選。（3）培養(yǎng)基不正確或血清濃度不正確或使用了劣質(zhì)血清。（4）未正確制備飼養(yǎng)細胞。（5）接種雜交瘤細胞的培養(yǎng)板過多。一般在5-20塊96孔板為宜。,（6）細胞被污染。在顯微鏡下仔細觀察是否有明顯的微生物污染。即使看不到有明顯的微生物，也應(yīng)該考慮是否有支原體污染，有條件的可以做支原體檢測。（7）細胞培養(yǎng)條件不正確。確保細胞培養(yǎng)在恒定的37較濕的環(huán)境，同時保證CO2濃度在4-5%左右。（8）其它與融合條件相關(guān)的不恰當(dāng)?shù)囊蛩亍?3.為什么融合后得不到陽性克?。浚?）動物未免疫成功就進行了融合。（2）融合后得到的克隆較少，故得到陽性克隆的機率也較小。（3）篩選克隆手段不正確。例如有些小分子物質(zhì)不可以直接包被到酶標板上，再如使用了不適當(dāng)?shù)亩沟戎T多因素，也有人直接不使用ELISA作為篩選方法的，成功率也有待商榷。（4）抗原成份與細胞培養(yǎng)條件中的物質(zhì)相同或類似，或者與篩選過程中有同抗原結(jié)構(gòu)相同或類似的物質(zhì)產(chǎn)生了競爭反應(yīng)。如果需要制備抗BSA的單抗，則養(yǎng)雜交瘤的培養(yǎng)基中不可以使用牛血清，否則牛血清中的BSA直接與抗體相結(jié)合，最后做ELISA篩選的時候無法得到陽性結(jié)果。解決的辦法只有使用其它的動物的血清或者使用無血清培養(yǎng)基。再如，如果需要制備酪蛋白的單抗，則做ELISA篩選時，二抗的稀釋液不可以使用脫脂奶粉。（5）其它所有能影響ELISA等相關(guān)篩選手段的因素。,4.為什么細胞生長很慢？（1）使用了劣質(zhì)的培養(yǎng)耗材、培養(yǎng)基、血清、HAT或HT。建議新手使用知名廠商的試劑或耗材。對于血清，可能需要從多個廠家選用多個批次試用，選擇出比較好的批次進行實驗。在試用血清的時候，一般可以使用相對較低濃度的血清進行骨髓瘤細胞培養(yǎng)實驗，根據(jù)骨髓瘤細胞的倍增速度確實血清質(zhì)量。（2）使用的血清或培養(yǎng)基濃度不正確。仔細檢查配方是否正確。（3）制備飼養(yǎng)細胞的方法不正確。,5.克隆原來檢測是陽性的，為什么后來轉(zhuǎn)為陰性了？首先要注意的是，正常情況下，雜交瘤也不是絕對穩(wěn)定的，確實容易發(fā)生染色體丟失的情況，尤其是當(dāng)細胞移到新環(huán)境中生長，如從小孔擴大到大孔，或者復(fù)蘇操作時，更容易發(fā)生陽性變?yōu)殛幮?。但是也有一些辦法盡量減少陽性變?yōu)殛幮?，一般可以從這幾個方面加以注意：（1）永遠保證細胞處在最佳的生長環(huán)境中。尤其是培養(yǎng)基不能長期不換，一般來說，當(dāng)細胞增長到一定密度的時候，培養(yǎng)基就開始變顏色，這個時候就要準備換培養(yǎng)基了。除了換培養(yǎng)基，同時應(yīng)該控制好細胞的密度，可以吹走過多的細胞，使新加入的培養(yǎng)基不至于很快被消耗。（2）對于重要的細胞株，每一步都把陽性的細胞保種。（3）不要過于頻繁操作細胞。當(dāng)細胞生長密度不是很大的時候，不要頻繁操作，否則細胞容易出現(xiàn)死亡或者生長形態(tài)發(fā)生明顯變化。,（4）對于傳代次數(shù)較多的細胞株需要經(jīng)常進行亞克隆，并將每一次的亞克隆株也作凍存。（5）當(dāng)細胞被支原體等微生物污染，也會發(fā)生由陽性轉(zhuǎn)為陰性的情況。,6.為什么亞克隆后長不出克隆來？（1）亞克隆時，原始孔里的細胞狀態(tài)不好，經(jīng)過有限稀釋或其它手段亞克隆的細胞活性很差，以至于長不出克隆。（2）亞克隆時，沒有按照正確的數(shù)量取出細胞，亞克隆的過程服從泊松分布，如果取出的細胞遠遠低于平均每孔一個細胞，或有效細胞遠遠低于平均每孔一個細胞，則也可能出現(xiàn)長不出克隆的結(jié)果。（3）未添加飼養(yǎng)細胞。單個細胞在完全培養(yǎng)基中極難培養(yǎng)，如果不添加飼養(yǎng)細胞，則它們很可能很快就死亡，最終就長不出克隆。,（4）使用的HAT中HT失效或A的濃度過高，或者未添加HT。雖然HT對雜交瘤的生長并不是必須的，但是HT確實可以加快細胞生長，改善細胞生長狀態(tài)。（5）使用無血清培養(yǎng)基。這一點是很冷僻的一個因素。雖然很少有人使用無血清培養(yǎng)基制備單抗，但是在某些血清可能干預(yù)篩選步驟的實驗的時候，可能會選用無血清培養(yǎng)基來培養(yǎng)雜交瘤，但是需要注意的是，在很多種無血清培養(yǎng)基中，單個細胞是很難長成克隆的。最好的解決辦法就是先用含有血清的培養(yǎng)基培養(yǎng)它們，等克隆長出后再把培養(yǎng)基徹底更換為無血清培養(yǎng)基。,7.為什么凍存的細胞很難復(fù)蘇或者復(fù)蘇不活？這個問題要從兩個方面來回答，一是凍存方面，二是復(fù)蘇問題。7.1對于凍存過程，需要注意：（1）凍存液的配方。這個問題很關(guān)鍵，一個良好的凍存液配方可以使細胞保存得非常好，而一個不好的凍存液配方可能會讓細胞傾刻死亡。凍存保護劑DMSO的含量非常重要，如果這個濃度過低，則起不到保護作用，凍存的細胞最終會死于冰晶形成時的張力，如果濃度過高，則細胞中毒而亡。,（2）凍存過程中，不可用力過大，在凍存液中重懸細胞的時候更是要輕柔，因為在DMSO存在的條件下，細胞膜變得非常脆弱，如果用力過猛，則細胞膜很容易破，復(fù)蘇成活的機會就明顯會下降。（3）凍存的程序也非常重要。實踐表明，以每分鐘1的速度下降凍存細胞是最理想的。,（5）保證被凍存的細胞處于良好的生長狀態(tài)，并且沒有被污染。,（4）如果條件簡易，可以把細胞放在4半小時左右，然后再在-20放置1小時，最后轉(zhuǎn)入-80放置過夜，最終轉(zhuǎn)入液氮保存。需要短期保存的，直接放-80也行?，F(xiàn)在有細胞凍存盒，把需要存放的細胞放進去，然后直接放-80就行，等時間夠長后直接轉(zhuǎn)至液氮中即可。,7.2對于復(fù)蘇過程，需要注意：（1）快速融化。為了防止升溫中細胞內(nèi)產(chǎn)生冰晶，強烈建議加快融化過程。一般都要用足夠體積的37熱水復(fù)蘇，并不斷晃動凍存管。（2）復(fù)蘇過程不要把凍存管全部泡入水中，也不要把蓋子弄濕，否則熱水有可能污染管口，造成復(fù)蘇的細胞被污染。（3）如果復(fù)蘇細胞時，沒有去掉凍存液，這樣就把凍存液里的DMSO帶到了新的培養(yǎng)體系里，容易對細胞造成毒害，所以對于貼壁細胞貼壁后換液或者細胞離心后去掉凍存液，然后用新的完全培養(yǎng)基重懸，再接種到新的容器內(nèi)培養(yǎng)。,8.單克隆抗體制備細胞實驗最棘手的問題-細胞污染,細胞培養(yǎng)污染是指培養(yǎng)環(huán)境中侵入了對細胞生存有害的成分和造成細胞變異的異物。細胞培養(yǎng)污染可分為以下三類:物理性、化學(xué)性及生物性。,8.1物理性污染的來源、危害及預(yù)防物理性污染通過影響細胞培養(yǎng)體系中的生化成分,從而影響細胞的代謝。（1）培養(yǎng)環(huán)境中的物理因素，如溫度、放射線、振動、輻射(紫外線或熒光)會對細胞產(chǎn)生影響。（2）細胞、培養(yǎng)液或其它培養(yǎng)試劑暴露于放射線、輻射或過冷過熱的溫度中，可以引起細胞代謝發(fā)生改變,如細胞同步化、細胞生長受抑制甚至細胞死亡。,（3）防范措施：通過實驗室的合理設(shè)計及建立規(guī)范的操作規(guī)程，可以減少環(huán)境中物理因素對細胞的影響。培養(yǎng)箱應(yīng)放在溫度較恒定的環(huán)境中，周圍不能放置能引起機械振動的設(shè)備，如離心機。培養(yǎng)液及培養(yǎng)試劑應(yīng)放在固定的位置，為避免光照試劑不能放在玻璃門的冰箱中，試劑周圍不能放同位素。培養(yǎng)液從冰箱中取出后應(yīng)在室溫中放置一段時間后再進行實驗，以避免過冷的溫度對細胞的影響。,8.2化學(xué)性污染的來源、危害及預(yù)防培養(yǎng)環(huán)境中許多化學(xué)物質(zhì)都可以引起細胞的污染?；瘜W(xué)物質(zhì)并不總是抑制細胞的生長，某些化學(xué)物質(zhì)如激素就可促進細胞的生長。不同細胞對化學(xué)物質(zhì)污染的反應(yīng)是不一樣的。未純化的物質(zhì)、試劑、水、血清、生長輔助因子及儲存試劑的容器都可能成為化學(xué)性污染的來源。細胞培養(yǎng)的必需養(yǎng)分，如氨基酸，若濃度超過了合適的范圍，也會對細胞產(chǎn)生毒性。同樣，不同細胞系其最佳培養(yǎng)條件下對血清和緩沖液的要求是不一樣的，在培養(yǎng)中應(yīng)嚴格控制。玻璃制品清洗過程中殘留的變性劑或肥皂(通常殘留在瓶蓋的內(nèi)表面)是最常見的化學(xué)性污染。,8.2.1水水是唯一一種在凝固時膨脹的化合物。因此在選擇凍存細胞的容器時應(yīng)考慮到這個因素。容器因水的膨脹而發(fā)生破裂是引起試劑污染的重要原因。為了避免金屬離子、有機分子、細胞內(nèi)毒素等物質(zhì)對水的污染，在配制液體，清洗容器時必須使用不含雜質(zhì)的超純水。需要注意的是,超純水放置過久其純度會下降。在高壓蒸氣滅菌及蒸餾水時水經(jīng)常被污染，因為高壓蒸氣鍋及純水機的常規(guī)維護后可能有少量的化學(xué)物質(zhì)殘留。為了保證水的純度,我們應(yīng)采取措施盡量避免化學(xué)物質(zhì)的殘留。,8.2.2血清動物血清是細胞培養(yǎng)中常用的天然培養(yǎng)基,但血清又是潛在的生物及化學(xué)污染的來源。由于血清采集于多個動物,而且不同廠商的生產(chǎn)工藝及質(zhì)量各不相同,因此血清中許多成分的濃度存在很大的變異。血清對不同細胞的促生長能力及毒副作用取決于這些細胞的分化功能、組織來源及培養(yǎng)基的成分等因素。在進行一系列實驗時,為了保證實驗的可重復(fù)性,最好選用同一批次的血清。,8.3.3培養(yǎng)液、培養(yǎng)附加成分、試劑培養(yǎng)液、培養(yǎng)附加成分、試劑都可能成為化學(xué)性污染的來源。細胞培養(yǎng)使用的所有物質(zhì)都應(yīng)是高純度的，并經(jīng)過權(quán)威機構(gòu)的鑒定，實驗者本人也應(yīng)對上述成分進行純度鑒定。同時,正確配置和儲存培養(yǎng)液及試劑也非常重要的,應(yīng)該采取標準的操作步驟，避免液體體積計算錯誤,混用類似化合物等錯誤。,8.3.4培養(yǎng)器皿及容器細胞培養(yǎng)過程中會使用到各種不同的培養(yǎng)器皿及容器。培養(yǎng)器皿的大小,構(gòu)形設(shè)計可能會影響到培養(yǎng)中氣體交換、濕度、培養(yǎng)液的pH值和細胞生長密度。培養(yǎng)器皿的工藝及滅菌過程中的差異可能對培養(yǎng)體系產(chǎn)生影響。塑料制品在生產(chǎn)過程中可能殘留一些有毒成形劑，生產(chǎn)工藝的不同可能引起器皿表面附著能力的不同。儲存不同物質(zhì)時應(yīng)選用合適的塑料或玻璃容器，因為酒精、強酸、強堿能夠溶解塑料或玻璃的某些成分。,8.3生物性污染的來源、危害及預(yù)防外界的微生物如昆蟲、節(jié)肢動物、原蟲、霉菌、病毒、細菌、無細胞壁的微生物(通常指支原體)和其它類型的細胞都可能侵入培養(yǎng)環(huán)境引起污染。只要在一個開放的環(huán)境中進行培養(yǎng),都難以避免發(fā)生污染。,8.3.1細菌污染細菌污染是實驗室細胞培養(yǎng)中常見的污染，即使在細胞培養(yǎng)液中加入了抗菌素(一般為預(yù)防劑量)，也可能因為操作不慎而引起污染。最常見的有革蘭氏陽性菌，如枯草桿菌以及大腸桿菌、假單胞菌等革蘭氏陰性菌，其中又以白色葡萄球菌較常見。培養(yǎng)細胞受細菌污染后，會出現(xiàn)培養(yǎng)液變混濁，pH改變。也有的培養(yǎng)液肉眼觀察無多少改變，只能在鏡下發(fā)現(xiàn)菌體才知污染。所以，每天應(yīng)仔細觀察。污染后細胞發(fā)生病理改變，胞內(nèi)顆粒增多、增粗，最后變圓脫落死亡，造成試驗失敗和細胞株(系)丟失。,8.3.2真菌污染真菌污染是細胞培養(yǎng)過程中最常見的一種，尤其在霉雨季節(jié)進行細胞培養(yǎng)更易污染。最常見的真菌有煙曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。培養(yǎng)細胞受真菌污染后，可見培養(yǎng)液中漂浮著白色或淺黃色的小點，有的散在生長，培養(yǎng)液一般不發(fā)生混濁；倒置顯微鏡下可見絲狀、管狀或樹枝狀的菌絲縱橫交錯在細胞之間或培養(yǎng)基中，有的呈鏈狀排列。念珠菌和酵母菌呈卵圓形散在細胞周邊和細胞之間。個體細小，有增多趨勢。鏡下看時，要將培養(yǎng)瓶用酒精棉球擦干凈，以防止與瓶外尤其瓶底外面生長的菌絲相混淆。真菌污染后，細胞生長變慢，但最后由于營養(yǎng)耗盡及毒性作用而使細胞脫落死亡。,8.3.3支原體污染支原體是介于細菌與病毒之間能獨立生活的最小微生物，最小直徑0.2m，一般過濾除菌無法去除它，光鏡下難以看清它的形態(tài)結(jié)構(gòu)。開始不易發(fā)現(xiàn)，能在偏堿條件(pH7.68.0)下生存，對青霉素有抗藥性，多吸附于細胞表面或散在于細胞之間。電鏡下可見其有三層結(jié)構(gòu)，無細胞壁，中央有電子密度大的密集顆粒或絲狀的中心囊。培養(yǎng)細胞受支原體污染后，部分敏感細胞可見細胞生長增殖變慢，部分細胞變圓，從瓶壁脫落。但多數(shù)細胞污染后無明顯變化，或略有變化，若不及時處理，還會產(chǎn)生交叉污染。,8.3.4病毒污染采用組織細胞培養(yǎng)法生產(chǎn)疫苗，如果沒有除去潛在病毒的組織培養(yǎng)物，會產(chǎn)生病毒污染。目前，從原代猴腎細胞的培養(yǎng)中已發(fā)現(xiàn)不少于20種血清性病毒。盡管病毒污染的細胞不影響原代培養(yǎng)，但生產(chǎn)疫苗是不安全的。若二倍體細胞系有SV40或多發(fā)瘤病毒，B淋巴細胞含EB病毒，細胞和會發(fā)生變異、轉(zhuǎn)化，形成異倍體的細胞系。因此潛在病毒是細胞大量生產(chǎn)和疫苗、干擾素等生物制品制作中的難題。,8.3.5非同種細胞污染由于細胞培養(yǎng)操作時各細胞株所需的器材和溶液沒有嚴格分開，操作不當(dāng)，往往會使一種細胞被另一種細胞污染。如“靈長類”細胞系發(fā)現(xiàn)猴和鼠類細胞的混合物，ERK/KD細胞是從兔腎中分離出來的，而現(xiàn)在句卻認為是HeLa細胞。目前，世界上已有幾十種細胞都被HeLa細胞所污染，致使許多實驗宣告無效。非細胞培養(yǎng)物所造成的化學(xué)成分的污染也偶有發(fā)生，大多是由于細胞培養(yǎng)所需物品清洗消毒不徹底而帶入一些有毒化學(xué)物質(zhì)所致。,預(yù)防措施：（1）在進行多種細胞培養(yǎng)操作時，所用器具要嚴格區(qū)分，最好做上標記便于辨別。并按順序進行操作，避免一起進行時易發(fā)生混亂。（2）在進行換液或傳代操作時，注射器和滴管不要觸及細胞培養(yǎng)瓶瓶口，以免把細胞帶到培養(yǎng)液中污染其他細胞。（3）所有細胞一旦購置，或從別處引入，或自己建立，均應(yīng)及早留種凍存，一旦發(fā)生污染可棄之復(fù)蘇，重新培養(yǎng)。,9.單克隆抗體面臨的問題,9.1如何進一步縮短單抗研發(fā)周期,降低生產(chǎn)成本,傳統(tǒng)方法制備單克隆抗體包括抗原制備、動物免疫、抗體檢測方法的建立、細胞融合、雜交瘤細胞的篩選、亞克隆、凍存復(fù)蘇、雜交瘤細胞及單克隆抗體特性的鑒定及單克隆抗體的大量生產(chǎn)等一系列復(fù)雜步驟，一般要花費6個月以上的時間，研發(fā)周期較長。同時每只小鼠自始自終只能免疫一種純化抗原，將這種免疫小鼠的脾臟B淋巴細胞與骨髓瘤細胞進行融合后，形成的雜交瘤細胞也只能分泌針對這一種純化抗原的單一單克隆抗體，工作效率低,生產(chǎn)成本高。因此，如何利用分子生物學(xué)技術(shù)，克服現(xiàn)有生產(chǎn)技術(shù)的局限性,縮短單抗研發(fā)周期，降低生產(chǎn)成本，建立生產(chǎn)雜交瘤細胞株的高效方法，是當(dāng)前需解決的問題。,9.2如何進一步提高體外用單抗的品質(zhì),研制高親和性單抗是免疫化學(xué)技術(shù)的重要發(fā)展方向之一，將會進一步提高單克隆抗體在微量分析領(lǐng)域內(nèi)的應(yīng)用。同時，隨著單抗在診斷與治療中應(yīng)用的快速發(fā)展，對單抗種類及數(shù)量的需求越來越多,如何進行大規(guī)模的生產(chǎn)也已成為抗體純化的主要問題。另外，單克隆抗體對抗原的識別,與多克隆抗體有很大的不同。不同試劑盒因使用的單克隆抗體不同,識別抗原的位點不同，導(dǎo)致檢測結(jié)果有一定差異。因此,體外用單抗標準化問題還需要進一步研究。,9.3如何進一步提高治療用單抗的品質(zhì),如何進一步降低單抗藥物的免疫原性，提高單抗藥物在腫瘤組織的濃度是研制治療用單抗的發(fā)展方向。,一、鼠源性單克隆抗體,發(fā)展歷程,二、人源化抗體,1.概念：是指抗體的可變區(qū)部分（即Vh和Vl區(qū)）或抗體所有全部由人類抗體基因所編碼。,2.人源化抗體包括嵌合抗體、改型抗體、表面重塑抗體和全人源化抗體等。,2.1嵌合抗體（1）概念：是利用DNA重組技術(shù)，將異源單抗的輕、重鏈可變區(qū)基因插入含有人抗體恒定區(qū)的表達載體中，轉(zhuǎn)化哺乳動物細胞表達出嵌合抗體，這樣表達的抗體分子中輕重鏈的V區(qū)是異源的，而C區(qū)是人源的，這樣整個抗體分子的近2/3部分都是人源的。,（2）特點：減少了鼠源性抗體的免疫原性；保留了親本抗體特異性結(jié)合抗原的能力。,2.2改型抗體（1）概念：改型抗體也稱CDR植入抗體(CDRgraftingantibody)，抗體可變區(qū)的CDR是抗體識別和結(jié)合抗原的區(qū)域，直接決定抗體的特異性。將鼠源單抗的CDR移植至人源抗體可變區(qū)，替代人源抗體CDR，使人源抗體獲得鼠源單抗的抗原結(jié)合特異性，同時減少其異源性。,2.3表面重塑抗體,（1）概念：表面重塑抗體是指對異源抗體表面氨基酸殘基進行人源化改造。該方法的原則是僅替換與人抗體SAR差別明顯的區(qū)域，在維持抗體活性并兼顧減少異源性基礎(chǔ)上選用與人抗體表面殘基相似的氨基酸替換。,2.4全人源化抗體,（1）概念：是指將人類抗體基因通過轉(zhuǎn)基因或轉(zhuǎn)染色體技術(shù)，將人類編碼抗體的基因全部轉(zhuǎn)移至基因工程改造的抗體基因缺失動物中，使動物表達人類抗體，達到抗體全人源化的目的。,三、小分子抗體,完整抗體分子具有體積大（相對分子質(zhì)量約為150103）、組織穿透能力差等不足，促進了抗體分子的小型化。小分子抗體具有組織穿透能力強、免疫原性弱、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、制備簡單和表達效率高等優(yōu)點，是基因工程中制備人源單抗的主要產(chǎn)物，目前小分子抗體主要