嗜肝病毒大衣殼蛋白雙重拓撲結構決定因子.doc

-專業(yè)文檔，值得下載!-專業(yè)文檔，值得珍藏！-原文：Assessmentofdeterminantsaffectingthedualtopologyofhepadnavirallargeenvelopeproteins作者：CarstenLambert,SylviaMannandReinhildPrange作者單位：DepartmentofMedicalMicrobiologyandHygiene,UniversityofMainz,Augustusplatz,D-55101Mainz,Germany發(fā)表刊物：JournalofGeneralVirology(2004),85,12211225DOI10.1099/vir.0.19737-0以下為中文翻譯稿：嗜肝病毒大衣殼蛋白雙重拓撲結構決定因子摘要：為實現(xiàn)功能多樣性，乙型肝炎病毒通過S結構域翻譯過程中的膜整合和部分pre-S亞結構域翻譯后的轉(zhuǎn)移獲得了雙重跨膜拓撲結構。因為每個過程都需要第二個跨膜區(qū)域（thesecondtransmembranesegment，TM2)，我們利用蛋白保護實驗對L蛋白突變體進行分析，探討該決定因子的行為。我們發(fā)現(xiàn)，亮氨酸拉鏈基序和TM2側(cè)翼電荷均不影響L的拓撲學再定位。表型混合試驗則表明在指引正確的L蛋白拓撲結構方面鴨HBVL蛋白的preS和S蛋白結構域不能代替HBV上的相應元件行使功能，因而兩個嗜肝病毒屬具有不同的轉(zhuǎn)移機制。由于基因組較小，病毒都是利用盡可能小的多肽序列儲存盡可能多的信息。因此，很多由病毒編碼的蛋白和蛋白結構域都具有多種功能。乙型肝炎病毒（hepatitisBvirus，HBV）（嗜肝病毒科Hepadnaviridae代表種），的大衣殼蛋白（L）即是其中的一個例子。該蛋白在病毒進入時作為受體蛋白起作用；在病毒組裝時，則是基質(zhì)類似蛋白，同時還行使調(diào)節(jié)功能（Brussetal.，1996）。這種多功能性依賴于雙重膜拓撲結構。該現(xiàn)象首先在嗜肝病毒L糖蛋白中被觀察到(Brussetal.,1994；Ostapchuketal.,1994；Prange&Streeck,1995；Guo&Pugh,1997；Swameye&Schaller,1997)。最近，越來越多的證據(jù)表明，其他一些病毒衣殼蛋白也存在有兩種或更多種拓撲異構結構行使多種不同的功能,如：豬傳染性胃腸炎病毒（transmissiblegastroenteritisvirus，TGE）的膜蛋白（Escorsetal.，2001）、丙型肝炎病毒（hepatitisCvirus，HCV）E1和E2衣殼蛋白亞結構域（Cocquereletal.,2002）、新城疫病毒（Newcastlediseasevirus）融合蛋白(McGinnesetal.,2003)等。到目前為止，對于HBVL蛋白雙重拓撲結構的形成機制仍然了解不多。L蛋白、中（M）和?。⊿）衣殼蛋白由一個開放閱讀框從不同位點起始翻譯表達而來。因此，S蛋白序列在含preS2結構域的M蛋白和含preS2和preS1結構域的L蛋白的C端得到重復（Heermann&Gerlich,1991)。這三個蛋白都在翻譯過程中整合到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)（endoplasmicreticulum，ER）膜上，該過程很可能由第一和第二個跨膜(transmembrane，TM)節(jié)段（TM1和TM2）上的信號錨定和轉(zhuǎn)移停止序列所向?qū)?Ebleetal.,1987)。這些信號也將M蛋白preS2上游區(qū)域在翻譯時導向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔(Ebleetal.,1990)。與此相反，L蛋白preS2和preS1（preS）結構域開始時-專業(yè)文檔，值得下載!-專業(yè)文檔，值得珍藏！-都停留在細胞質(zhì)中。成熟過程中，大約一半的L蛋白將preS結構域翻譯后轉(zhuǎn)移至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，從而產(chǎn)生病毒衣殼內(nèi)的雙重拓撲結構(Brussetal.,1994)(Fig.1)。通過將preS結構域定位于胞質(zhì)（病毒內(nèi)）和管腔（病毒外），L蛋白在病毒生活周期中行使兩種截然不同的功能：病毒衣殼和結合受體。我們以前的研究表明：在病毒組裝過程中，部分HBVpreS的翻譯后轉(zhuǎn)移似乎并不通過由衣殼蛋白跨膜區(qū)橫向相互作用所產(chǎn)生的特異性通道，因為該過程既不需要S和M蛋白，也不需要任何參與通道形成的雙性跨膜區(qū)域（Lambert&Prange,2001）。更確切地說L蛋白拓撲學再定位與宿主細胞跨膜運輸機制有關，因為我們發(fā)現(xiàn)它與ER膜相關。這些研究同時表明：TM2是preS翻譯后轉(zhuǎn)移的一個關鍵決定因子。第二決定因子則指向L蛋白preS1結構域內(nèi)部的一個特殊結構域。Fig.1.HBVL衣殼蛋白結構域和跨膜拓撲學結構示意圖。(A)L蛋白結構域示意圖。數(shù)字代表氨基酸位置；白框代表四個跨膜結構域，前兩個分別為1和2；代表Asn-309上的N-連接糖基化。(B)L在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上的拓撲學模型。開始隨著翻譯過程中的膜整合，pre-S位于ER的胞質(zhì)面（左）；成熟過程中，約50%L蛋白的pre-S在翻譯后轉(zhuǎn)移至內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔（右）。(C)瞬時轉(zhuǎn)染COS-7細胞表達的HA-taggedL蛋白的胰蛋白酶保護實驗分析。轉(zhuǎn)染兩天后，準備微粒體，進行胰蛋白酶和NP-40存在與否的交叉處理，樣品通過HA特異性免疫印跡進行檢測分析。L蛋白的糖基化(gp42)和非糖基化(p39)形式以及胰蛋白酶處理后的非糖基化(T)和單糖基化(gT)片段圖中都有標示。此實驗中，S和M蛋白的合成通過起始密碼子的錯義突變被抑制。該結構域被稱為胞質(zhì)錨定因子（cytosolicanchoragedeterminant，CAD），它能與同源熱休克蛋白（heat-shockprotein，Hsc70）相互作用，而阻止翻譯過程中preS的轉(zhuǎn)移(Lffler-Maryetal.,1997；Lambert&Prange,2003)。兩個拓撲學決定子都在相同的L分子中發(fā)揮順式作用。這與DHBVL同源物不同。DHBVL同源物采用相同的雙重拓撲結構，但限制pre-S特異決定子，如一系列賴氨酸殘基和Hsc70結合因子，作為順式元件起作用，；而共表達S鏈所提供的S-特異決定子,如TM1,則是作為反式因子起作用(Swameye&Schaller,1997；Grgacic,2002)。兩者更大的差異還在于DHBVL蛋白拓撲結構的轉(zhuǎn)換與衣殼形態(tài)發(fā)生和輸出相一致(Grgacic,2002)?？傊?，這些現(xiàn)象都說明這兩種嗜肝病毒L蛋白雖具有相同的表型，但其折疊方式卻背道而馳。本文將集中關注HBVL蛋白重定位過程中的拓撲學決定子以及它們的分子特性、功能和對蛋白定向的影響。我們構建了一系列蛋白突變體并通過COS7細胞中的瞬時表達對其拓撲學特征進行分析。另外，微粒體的胰蛋白酶保護實驗也被用于檢測部分L蛋白pre-S翻譯后的跨膜分布(Lambert&Prange,2001)。當L蛋白在PNI2.LHA質(zhì)粒中，以HA-tag融合進行表達時，該蛋白將以成對形式出現(xiàn)：39kDa的非糖基化蛋白(p39)和42kDa單糖基化蛋白(gp42)（S結構域Asn309被部分N-糖基化的結果）。新合成的L蛋白的preS區(qū)域?qū)σ鹊鞍酌傅那懈罘浅Ｃ舾小５S著時間遷移，部分L蛋白翻譯后轉(zhuǎn)移至ER，而對胰蛋白酶的切割產(chǎn)生保護，有達5060%的L蛋白對胰-專業(yè)文檔，值得下載!-專業(yè)文檔，值得珍藏！-蛋白酶有抗性而處于穩(wěn)定狀態(tài)（Fig.1）。因此，去污劑（NP40）不存在時，胰蛋白酶的處理將L蛋白分成兩部分：一部分L蛋白的preS翻譯后定位于ER，對胰蛋白酶具抗性，而以全長分子形式存在；另一部分L蛋白preS轉(zhuǎn)移至細胞質(zhì)，對胰白酶敏感，從而被切割為非糖基化的25kDa片段（T）和對應于C端S區(qū)域，被單糖基化的28kDa片段（gT）。當微粒體用NP40崩解后，L蛋白都被切割成T和gT兩個片段。preS蛋白的翻譯后再定位模式已被含兩個競爭性糖基化位點(Asn4和Asn123)的preS不能被N-連接糖基化的事實所證實（LfflerMaryetal.,1997）。我們以前的研究表明，在L蛋白的四個跨膜區(qū)域中，只有TM2是preS翻譯后轉(zhuǎn)移所需要的（Lambert&Prange,2001）。盡管這些結果很大程度上排除了HBV特殊衣殼結構作為preS通道的可能性，但仍有可能TM2結構域通過helicalpacking的橫向相互作用形成自主轉(zhuǎn)移通道。由此通過數(shù)據(jù)分析，我們在TM2中找到了一個可能具自身相互作用并能形成孔道結構的亮氨酸富含區(qū)(Gurezkaetal.,1999；Scholzeetal.,2002)。為了確認這個由Leu247,Leu254和Leu261組成的亮氨酸拉鏈基序是否與PreS重新定位有關，我們通過PCR方法構建了一些雙重或三重丙氨酸替代突變體。L247/254A、L247/261A、L254/261和L247/254/261A突變體在COS7細胞中表達時，其產(chǎn)物和野生型L蛋白一樣均成對出現(xiàn)，并在翻譯過程中插入內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜(Fig.2A)。拓撲結構分析顯示所有雙重突變體都具野生型的轉(zhuǎn)移特征在沒有NP40時，4050%的多肽受微粒體膜的保護而不被胰蛋白酶切割。三重突變體使preS在更大程度上表現(xiàn)出翻譯后轉(zhuǎn)移特性。因此，亮氨酸拉鏈基序不為preS翻譯后轉(zhuǎn)移所需，但似乎影響其程度。Fig.2.TM2在L蛋白pre-S翻譯后轉(zhuǎn)移過程中的作用。(A)亮氨酸拉鏈基序不為pre-S的翻譯后轉(zhuǎn)移所依賴。左圖中亮氨酸拉鏈基序的氨基酸被展示，亮氨酸用黑體標示，數(shù)字表示亮氨酸的氨基酸位置；右圖為HA融合的L突變體轉(zhuǎn)染COS-7細胞后的胰蛋白酶切割實驗分析。L蛋白非糖基形式(p39)和單糖基化形式(gp42)的位置如圖。(B)TM2側(cè)翼極性氨基酸不為pre-S的翻譯后轉(zhuǎn)移所依賴。在左圖，TM2側(cè)翼極性氨基酸R-236,R-241,R-242andD-262用黑體所標示；右圖表示突變體的拓撲學結構分析（胰蛋白酶切割試驗）。突變體以替代氨基酸命名。p39和gp42已被表示。TM2的另一顯著特點是鄰近電荷的不對稱分布，包括前面的三個精氨酸和后面緊接的一個天冬氨酸。根據(jù)對跨膜結構域兩側(cè)極性殘基功能的了解（Boyd&Beckwith,1990），這些電荷似乎對TM2的停止轉(zhuǎn)移功能很重要，另外它們的極性側(cè)鏈可能參與螺旋間氫鍵以及跨膜螺旋相互作用（VbarretxenaBelandia&Engelman,2001）在L鏈間形成蛋白與蛋白接合界面，使preS在翻譯后轉(zhuǎn)移。我-專業(yè)文檔，值得下載!-專業(yè)文檔，值得珍藏！-們將Arg236，Arg241，Arg242和Asp262依次突變成不帶電殘基，如：丙氨酸和亮氨酸，以檢驗它們對L重折疊的影響。蛋白保護實驗顯示R236L，R242A和D262A突變體均能形成正確的L拓撲結構，表現(xiàn)為在完整微粒體中對胰蛋白酶切割有部分抗性，缺乏preS耦聯(lián)的N-聚糖(Fig.2B)，而R241A突變體能更高水平地在翻譯后轉(zhuǎn)移preS。也許這種替代會導致結構上更大程度地失去對轉(zhuǎn)移的控制，從而改變定位于管腔內(nèi)的preS與定位于細胞質(zhì)的preS間的平衡。綜合這些數(shù)據(jù)表明L蛋白翻譯后的重新定位不依賴TM2上可能的跨膜helixhelixpacking基序、亮氨酸拉鏈基序、極性氨基酸，進而揭示L重折疊與衣殼組裝無關。Fig.3.DHBV衣殼蛋白亞基不能功能性取代HBVpre-SandS結構域。(A,B)preS(h):S(d)andpreS(d):S(h)嵌合體示意圖。(A)preS(h):S(d)：HBVpre-S結構域與DHBVS結構域融合；(B)preS(d):S(h)：DHBVpre-S結構域與HBVS結構域融合.圖中數(shù)字代表氨基酸的位置。為分析N-連接低聚糖，細胞裂解物分為兩部分：一部分不處理(lane1)，另一部分用PNGaseF消化(lane2)。拓撲學分析則繼續(xù)采用胰蛋白酶消化試驗。蛋白通過SDS-PAGE和HA-特異性免疫印跡進行分析。非糖基化(p)和糖基化(gp,ggp)形式產(chǎn)物用箭頭標示。右邊的數(shù)字代表標準分子量（kDa）。為了更深入的了解L蛋白的拓撲學行為，我們進行了結構域交換實驗對哺乳類和禽類HBV衣殼蛋白亞結構域進行洗牌。首先我們用DHBVS區(qū)域取代HBVL蛋白S區(qū)域，構建preS(h):S(d)嵌合體（DHBVS區(qū)域擴增自質(zhì)粒pDHBVWildneretal.,1991)。與預期的一致，preS(h):S(h)表達形成37KDa的膜結合蛋白(Fig.3A)。令人驚訝的是，另外還有兩個高分子量蛋白。在用N-glycosidaseF（PNGaseF）去糖基化后這些條帶消失，表明它們被N-連接糖基化。因為DHBVS結構域不含N-聚糖，pres(h):S(d)的修飾只可能發(fā)生在pre-S的Asn4和Asn-123。又因preS(h):S(d)的這些糖基化