低分子量海帶巖藻聚糖硫酸酯的制備工藝研究的說明材料.doc

項(xiàng)目編號(hào)1020010704自然科學(xué)項(xiàng)目分類社會(huì)科學(xué)中國(guó)海洋大學(xué)本科生研究發(fā)展計(jì)劃（OUCSRDP）項(xiàng)目結(jié)題論文項(xiàng)目名稱低分子量海帶巖藻聚糖硫酸酯的制備工藝研究負(fù)責(zé)人張晶項(xiàng)目成員李堯于萍萍聯(lián)系電子郵箱ZHANGJING10280202126COM所在學(xué)院食品科學(xué)與工程專業(yè)年級(jí)2008級(jí)食品科學(xué)與工程專業(yè)指導(dǎo)教師趙雪起止年月2010年5月至2011年4月二一一年四月二十七日本科生研究發(fā)展計(jì)劃管理委員會(huì)低分子量海帶巖藻聚糖硫酸酯的制備工藝的研究褐藻巖藻聚糖硫酸酯是一種結(jié)構(gòu)獨(dú)特的海洋硫酸多糖，因?yàn)槠淇鼓?、抗血栓、抗腫瘤、提高免疫力等方面的活性而受到廣泛的關(guān)注。本研究以我省資源豐富的褐藻海帶為研究對(duì)象，對(duì)海帶加工過程中廢棄未利用的生物活性物質(zhì)巖藻聚糖硫酸酯進(jìn)行回收利用，研究制備高效、安全的抗血栓活性的巖藻聚糖硫酸酯，用于開發(fā)海洋藥物或者海洋功能食品，可以大大提高海帶的附加值。也改變了我國(guó)海帶加工膠、碘、醇四十年一貫制的狀況，提高了海帶的綜合利用價(jià)值，可以大大推動(dòng)我國(guó)海藻加工高值化的發(fā)展。一、實(shí)驗(yàn)方法一、中分子海帶巖藻聚糖硫酸酯的分級(jí)純化和制備1確定中分子量巖藻聚糖硫酸酯的NACL洗脫濃度。稱量50MG粗糖樣品做成3的水溶液，加入到QSEPHAROSEFF陰離子交換柱（1650CM）中進(jìn)行交換，用04MOL/LNACL溶液連續(xù)梯度洗脫，分部收集，用苯酚硫酸法檢測(cè)。通過該試驗(yàn)確定分級(jí)洗脫適宜的NACL濃度。吸光值與管數(shù)曲線0010203040506070809116111621263136414651566166717681869196101管數(shù)吸光值A(chǔ)005115225335445氯化鈉濃度MOL/L系列2系列3圖1梯度洗脫得到的吸光值與管數(shù)的關(guān)系通過圖1可以看出在1MOL/L、25MOL/LNACL和35MOL/LNACL濃度吸光值較大，確定出中分子量巖藻聚糖硫酸酯的適宜的洗脫濃度為1MOL/L、25MOL/LNACL和35MOL/LNACL。2中分子量巖藻聚糖硫酸酯的制備稱量15G粗糖樣品做成3的水溶液，加入到QSEPHAROSEFF陰離子交換柱中進(jìn)行交換，分別用H2O、1MOL/L、25MOL/LNACL和35MOL/LNACL分步洗脫，用硫酸苯酚法檢測(cè)洗脫的糖的含量直到糖完全洗脫完畢。棄去H2O洗脫部分，收集到高硫高分子量（25MOL/L）和低硫高分子量（1MOL/L）三種組分。再用截留分子量為10KDA的中空纖維膜進(jìn)行超濾，去除鹽和小分子的糖。超濾內(nèi)液經(jīng)真空旋轉(zhuǎn)濃縮，凍干，得到低硫高分子量F1和高硫高分子量F2的組分。（二）低分子量巖藻聚糖硫酸酯的制備取45G巖藻聚糖硫酸酯粗糖與036GCU（AC）2H2O一起溶于675ML蒸餾水中，用2MOL/LNAOH調(diào)PH至75左右。用蠕動(dòng)泵以54ML/H的速度加入H2O2溶液，60反應(yīng)5小時(shí)。將反應(yīng)液中加入03ML2MOL/LNAOH，離心除去CU2。取上清液，并調(diào)PH至中性，加入CHELEX100螯合樹脂除去殘留的CU2。反應(yīng)液分別用截留分子量為10KDA、6KDA、25KDA和300DA的超濾膜進(jìn)行超濾，得到四個(gè)組分FA（610KDA）、FB256KDA、FC30025KDA和FD小于300，然后分別濃縮凍干。（三）、不同分子量的巖藻聚糖硫酸酯的化學(xué)分析分別對(duì)F1和F2，以及FB1和FB2進(jìn)行高效液相色譜分析確定其重均分子量和數(shù)均分子量分子量，采用氯化鋇明膠法確定其硫酸根含量，采用柱前衍生高效液相色譜分析確定各組分的單糖組成。（四）、不同的巖藻聚糖硫酸酯對(duì)動(dòng)脈血栓形成的影響試劑配制肝素鈉溶液用生理鹽水溶解肝素鈉干粉，配制成高（2MG/ML）、低（1MG/ML）兩個(gè)劑量組低分子量巖藻聚糖硫酸酯用生理鹽水溶解FA3和FB3干粉，配制成高10MG/ML、中（5MG/ML）、低（25MG/ML三個(gè)劑量組。高分子量巖藻聚糖硫酸酯用生理鹽水溶解F1和F2干粉，配制成高（025MG/ML）、低（01MG/ML兩個(gè)劑量組。對(duì)氨基甲酸乙酯麻醉液用時(shí)以超純水配成質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20的溶液。實(shí)驗(yàn)步驟1挑選100只雄性WISTAR大鼠，稱重（250300G），隨機(jī)分為10組，每組10只，分別標(biāo)記。2將實(shí)驗(yàn)動(dòng)物用對(duì)氨基甲酸乙酯05ML/KG腹腔注射麻醉后，固定于動(dòng)物解剖板上，切開大鼠頸部皮膚，剝離右側(cè)頸動(dòng)脈約13MM，剝離中盡量減輕對(duì)頸動(dòng)脈牽拉刺激，不得損傷血管表面和神經(jīng)。開啟儀器，設(shè)置好參數(shù)，將血栓探頭上的壓板打開，將剝離好的頸總動(dòng)脈勾入探頭的溝槽內(nèi)，（注意探頭上標(biāo)出的血流方向應(yīng)與被測(cè)動(dòng)物頸總動(dòng)脈的血流方向一致），輕輕放下壓板，使血栓探頭與動(dòng)物身體保持垂直，將上端軟線放入固定支架的夾子內(nèi)固定，調(diào)整好高度和方向。3剝離股靜脈給藥后，按動(dòng)運(yùn)行鍵，博動(dòng)信號(hào)穩(wěn)定時(shí),通過刺激電極給予12MA電流刺激，以損傷動(dòng)頸動(dòng)脈血管的內(nèi)皮細(xì)胞，從而激活凝血因子，啟動(dòng)凝血機(jī)制，造成血小板和纖維蛋白聚集，形成一種混合性的血栓。使用紅外血流檢測(cè)探頭對(duì)血栓形成引起的血流脈動(dòng)變化進(jìn)行全程的監(jiān)測(cè)，及時(shí)地捕捉血栓開始形成的時(shí)間，血栓阻塞血管的百分比的變化以及全阻塞時(shí)間。4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以XS表示。多組間比較采用SPSS115軟件包進(jìn)行獨(dú)立樣品T檢驗(yàn)，再進(jìn)一步應(yīng)用LSD法比較各組組間差異，以001和005顯著差異值界限。二、結(jié)果分析（一）大分子巖藻聚糖硫酸酯的化學(xué)分析圖2大分子巖藻聚糖硫酸酯的分子量和硫酸根含量的比較組分重均分子量KDA數(shù)均分子量KDA多分散系數(shù)硫酸根含量（）F12819147285057F235281253225057圖3巖藻聚糖硫酸酯各組分的單糖組成的比較組分FRACTIONS巖藻糖（）半乳糖（）甘露糖（）鼠李糖（）葡萄糖醛酸（）木糖（）葡萄糖胺（）葡萄糖醛酸F136201836177587182173252845F24620123619757713212320845根據(jù)高效液相色譜分析結(jié)果確定離子交換法制備的力量個(gè)中分子量的巖藻聚糖硫酸酯的重均分子量和數(shù)均分子量為F128000和19000，F(xiàn)235000和28000。硫酸根含量分別為285和3525。而由圖3可以看出，中分子巖藻聚糖硫酸酯的單糖組分也不同，單糖組分大多是巖藻糖、半乳糖和甘露糖，而其它糖組分含量較少或基本不含，F(xiàn)1主要含有巖藻糖（3620）、甘露糖（1775）和半乳糖（1836），F(xiàn)2主要含有巖藻糖（4620）、甘露糖（1975）和半乳糖（1236），還含有一定量的鼠李糖、木糖和D葡萄糖醛酸。其中硫酸根含量較高的F2組分，活性成分明顯高于F1。二低分子巖藻聚糖硫酸酯的化學(xué)分析1低分子巖藻聚糖硫酸酯的高效液相色譜分析結(jié)果時(shí)間圖49H2O2降解45G組分得到的小于10000DA部分的高效液相色譜分析結(jié)果圖545H2O2降解45G組分得到的小于10000DA部分的高效液相色譜分析結(jié)果主要得到峰值分子量為7KDA，4KDA和1KDA的低分子量組分。2低分子量組分的硫酸根含量分析圖6低分子量組分的硫酸根含量分析水解條件組分重均分子量KDA硫酸根含量（）得率（）粗A27442376123068FB2325253205224649H2O2降解45G組分FC215313610462158FA376830321682436FB33893248049305845H2O2降解45G組分FC315518850851215由圖6中數(shù)據(jù)可以看出，45H2O2降解45GFUCOIDAN，可以得到硫酸根含量高達(dá)3032和3248的7KDA和4KDA的高硫組分，顯著高于9的降解產(chǎn)物。因此，自由基氧化降解是一種有效的降解巖藻聚糖硫酸酯的方法。低分子巖藻聚糖硫酸酯的紅外光譜分析結(jié)果4186847006581216858845199124196505103028105751654712572016348729452934502910152025303540455056065707580TRANSMITANCE100200300WAVENUMBERSCM1圖745H2O2降解45G組分得到的峰值分子量為7KDA組分的紅外光譜分析4108758301846391019647310302105901257951639032947634565101520253035404550556065TRANSMITANCE100020003000WAVENUMBERSCM1圖845H2O2降解45G組分得到的峰值分子量為4KDA的紅外光譜圖采用紅外光譜分析45H2O2降解45G巖藻聚糖硫酸酯得到的7KDA組分圖7和4KDA組分（圖8），發(fā)現(xiàn)兩種組分在3450CM和3445CM都有很強(qiáng)的羥基OH伸縮振動(dòng)吸收峰，在2945CM和2944CM附近有CH的伸縮振動(dòng)吸收峰，在1634CM和1639CM處有CO的伸縮振動(dòng)中強(qiáng)吸收峰，7KDA和4KDA組分在12572CM和12579CM處均顯示了很強(qiáng)的SO對(duì)稱吸收峰，表明這兩個(gè)組分的硫酸根含量很高，這與離子色譜測(cè)定的硫酸根含量高達(dá)3032和3248也是吻合的。多糖的紅外吸收光譜810CM850CM吸收峰表示C0S伸縮振動(dòng)，它的位置與硫酸根在糖上的連接位置有關(guān)，MRS指出，如果糖的平伏鍵結(jié)合有硫酸酯，則COS的振動(dòng)出現(xiàn)在820CM，如果糖的垂直鍵結(jié)合有硫酸酯，則COS的振動(dòng)出現(xiàn)在850CM，由此就可以從紅外光譜來判斷硫酸基的位置。由圖7和圖8可以看出，7KDA組分和4KDA組分在84519CM和84463CM處均有較強(qiáng)的吸收峰，表明這兩個(gè)組分的硫酸根大致處于糖的垂直鍵上，且在2，4位有雙硫取代。其它水解條件下的各組分SO伸縮振動(dòng)峰和C0S的伸縮振動(dòng)峰均沒有這兩個(gè)組分顯著，這也是與前面測(cè)得的硫酸根含量數(shù)據(jù)是一致的，而且45H2O2降解45G巖藻聚糖硫酸酯，7KDA和4KDA組分總糖含量分別達(dá)到6201和6082，表明這兩個(gè)組分的純度很高，有很好的均一性。因此選擇FB3和FA3進(jìn)行氣相色譜分析圖9FA3和FB3的糖組成分析組分巖藻糖（）半乳糖（）甘露糖（）鼠李糖（）葡萄糖醛酸（）木糖（）葡萄糖胺（）FA347743735544387365080195FB365273074156221151注以氣相色譜的結(jié)果計(jì)算，氣相色譜中所有的峰的總面積為100，“”，未檢出因此選擇硫酸根含量較高的FA3和FB3組分進(jìn)行糖組分分析，結(jié)果如圖所示，重均分子里較小且硫酸根含量較高的FB3活性成分明顯高于FA3。MIN051015205NORM10203040RID1A,EFRACTIVINDEXSIGALLIFANG1032DFBFA圖10低分子質(zhì)量組分FA和FB的分子量測(cè)定曲線巖藻聚糖硫酸酯粗糖經(jīng)自由基氧化降解后，得到的重均分子量為768KDA組分在高效液相色譜分析中呈單一對(duì)稱峰，且分布范圍較窄，組分較純（見圖10），主要由巖藻糖組成，達(dá)到6425，其次是半乳糖含量上升到3074，巖藻糖和半乳糖占總單糖組成的9499，而甘露糖、鼠李糖和葡萄糖含量很低。而389KDA的組分主要由重均分子量為652KDA和473KDA的兩個(gè)組分組成，采用TSK2500的色譜柱也無法分離，其硫酸根含量最高，達(dá)到3248，主要由巖藻糖（4694）和半乳糖（3735）組成，巖藻糖含量明顯低于768KDA的組分。二、不同巖藻聚糖硫酸酯對(duì)大鼠動(dòng)脈血栓生成的影響經(jīng)12MA的電流刺激大鼠頸動(dòng)脈5MIN后，血管顏色明顯變黑，剖開血管壁厚可見血管內(nèi)血栓形成。A剝離頸動(dòng)脈B電刺激頸動(dòng)脈圖11大鼠頸動(dòng)脈模型實(shí)驗(yàn)過程關(guān)鍵點(diǎn)圖圖1208MA電刺激對(duì)大鼠頸動(dòng)脈血栓形成阻塞率變化的影響圖1310MA電刺激對(duì)大鼠頸動(dòng)脈血栓形成阻塞率變化的影響圖1412MA電刺激對(duì)大鼠頸動(dòng)脈血栓形成阻塞率變化的影響圖12、13、14為用不同的電流刺激大鼠頸動(dòng)脈時(shí)血栓形成過程中血栓阻塞血管的百分比的變化以及全阻塞時(shí)間。血栓形成過程中，血管阻塞率不斷上升，阻塞率曲線的斜率由大變小，說明大鼠血管在電刺激的條件下形成血栓的速度先快后慢。隨著電流的增大，血栓形成所需的時(shí)間逐漸減小。采用08MA成栓時(shí)間大約為11634S,但是成栓率比較低，10只大鼠僅有4只一次成拴。而電流加大到1MA和12MA，成栓率上升為80和100。12MA電流太大，成栓時(shí)間太短。所以認(rèn)為10MA電流是最適宜的電流強(qiáng)度。圖15不同的巖藻聚糖硫酸酯對(duì)動(dòng)脈血栓形成時(shí)間的影響組別劑量MG/KG全阻塞時(shí)間S生理鹽水組767270112223肝素鈉122255373F1011028192025300F20123024602530025116519651825362FB31023942952510032575284243FA310300肝素的劑量為1MG/KG時(shí)，對(duì)大鼠頸動(dòng)脈電刺激的全阻塞時(shí)間無顯著影響，當(dāng)肝素的劑量提高到2MG/KG時(shí)，可以顯著延長(zhǎng)全阻塞時(shí)間。大分子量巖藻聚糖硫酸酯中，F(xiàn)2比F1更能延長(zhǎng)全阻塞時(shí)間，低分子量巖藻聚糖硫酸酯中，隨著劑量的提高，33KD的FB3和77KD的FA3都可以顯著延長(zhǎng)大鼠頸動(dòng)脈血栓形成時(shí)血管的全阻塞時(shí)間。三、實(shí)驗(yàn)結(jié)論通過這次實(shí)驗(yàn)我們明顯可以得到一下結(jié)論1）通過QSEPHAROSFF陰離子交換制備得到大分子量巖藻聚糖硫酸酯的重均分子量和數(shù)均分子量為F128000和19000，F(xiàn)235000和28000。硫酸根含量為285和