notch信號通路在糖尿病腎病足細(xì)胞損傷中的研究論文（可編輯）

NOTCH信號通路在糖尿病腎病足細(xì)胞損傷中的研究論文河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)位論文使用授權(quán)及知識產(chǎn)權(quán)歸屬承諾本學(xué)位論文在導(dǎo)師或指導(dǎo)小組的指導(dǎo)下,由本人獨(dú)立完成。本學(xué)位論文研究所獲得的研究成果,其知識產(chǎn)權(quán)歸河北醫(yī)科大學(xué)所有。河北醫(yī)科大學(xué)有權(quán)對本學(xué)位論文進(jìn)行交流、公開和使用。凡發(fā)表與學(xué)位論文主要內(nèi)容相關(guān)的論文,第一署名單位為河北醫(yī)科大學(xué),試驗(yàn)材料、原始數(shù)據(jù)、申報(bào)的專利等知識產(chǎn)權(quán)均歸河北醫(yī)科大學(xué)所有。否則,承擔(dān)相應(yīng)的法律責(zé)任。二級學(xué)院領(lǐng)導(dǎo)蓋章,、研究生簽名勻戔導(dǎo)師簽?zāi)暝氯蘸颖贬t(yī)科大學(xué)研究生學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明本論文是在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果,除了文中特別加以標(biāo)注等內(nèi)容外,文中不包含其他人已發(fā)表或撰寫的研究成果,指導(dǎo)教師對此進(jìn)行了審定。本論文由本人獨(dú)立撰寫,文責(zé)自負(fù)。、導(dǎo)師簽章研究生簽名勻乞車目錄中文摘要英文摘要英文縮寫研究論文信號通路在糖尿病腎病足細(xì)胞損傷中的研究引言第一部分信號通路在糖尿病腎病患者腎組織中的表達(dá)及意義前言剛舌材料與方法結(jié)果附圖附表討論小結(jié)參考文獻(xiàn)第二部分信號通路在糖尿病小鼠腎組織中的表達(dá)及意義前言月舌材料與方法結(jié)果附圖附表討論小結(jié)參考文獻(xiàn)第三部分信號通路在體外高糖培養(yǎng)足細(xì)胞中的表達(dá)及意義前言日吾材料與方法結(jié)果附圖討論小結(jié)參考文獻(xiàn)結(jié)論綜述信號通路的研究進(jìn)展致謝個(gè)人簡歷中文摘要信號通路在糖尿病腎病足細(xì)胞損傷中的研究摘要目的糖尿病腎病,是糖尿病的常見并發(fā)癥,是引起終末期慢性腎功能衰竭的主要原因之一。的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜,糖脂代謝紊亂、血流動力學(xué)改變、氧化應(yīng)激反應(yīng)及多種細(xì)胞因子等是其主要起始因素。在這些起始因素的下游,又有多條信號傳導(dǎo)通路在其中發(fā)揮著重要作用。近年來發(fā)現(xiàn)信號通路在的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用。已有研究表明,通路決定胚胎發(fā)育、細(xì)胞增殖和分化,在胚胎后腎形成過程中對足細(xì)胞和腎小管的分化中起著重要的作用。近年來在腎臟疾病領(lǐng)域的研究證實(shí),信號通路與糖尿病腎病、局灶節(jié)段性腎小球硬化、腎病綜合癥等多種腎小球疾病有關(guān),參與腎小球硬化的發(fā)生。在哺乳動物體內(nèi)信號通路有四種受體和五種配體,其中受體為,配體分別為、樣配體、和。配體與受體的結(jié)合導(dǎo)致受體構(gòu)象發(fā)生改變,隨后在丫分泌酶的介導(dǎo)下發(fā)生蛋白水解作用,釋放出胞內(nèi)域,轉(zhuǎn)移至細(xì)胞核內(nèi),活化和等分化拮抗基因的轉(zhuǎn)錄,阻礙分化效應(yīng)基因的表達(dá),影響細(xì)胞的分化、增殖和凋亡。既往研究認(rèn)為,的主要病理特征是腎小球基底膜。增厚、細(xì)胞外基質(zhì),堆積、腎小球硬化、腎小管萎縮及腎間質(zhì)纖維化。近年研究發(fā)現(xiàn),足細(xì)胞損傷在發(fā)生、發(fā)展過程中起重要作用。足細(xì)胞是終末分化的腎小球上皮細(xì)胞,它附著在外側(cè),是腎小球?yàn)V過膜的重要組成部分。由于足細(xì)胞是高度分化細(xì)胞,增殖能力較差,當(dāng)足細(xì)胞受到損傷時(shí),和等足細(xì)胞相關(guān)蛋白在足細(xì)胞裂孔膜,丟失,使腎小球?yàn)V過電荷屏障減弱,促進(jìn)蛋白尿的發(fā)生。足盂蛋白,是足突項(xiàng)膜區(qū)主要的帶負(fù)電荷跨膜蛋白,當(dāng)足細(xì)胞損傷后表達(dá)減少,破壞了足突間的排斥作用使之發(fā)生粘附、融合,導(dǎo)致足細(xì)胞易于中文摘要脫落?，F(xiàn)已知主要的凋亡通路有、心等,在發(fā)生時(shí),足細(xì)胞內(nèi)的這些凋亡通路可被激活,誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡。同時(shí)受損的足細(xì)胞對生成的調(diào)節(jié)作用發(fā)生紊亂,轉(zhuǎn)化生長因子,等促進(jìn)基質(zhì)生成的因素增加,造成型膠原等基膜樣基質(zhì)增加,導(dǎo)致腎小球硬化,加速的進(jìn)展。許多學(xué)者通過不同方法證實(shí)了信號通路在足細(xì)胞分化中的作,抑制小鼠用,等使用,分泌酶抑制劑丫后腎形成過程中通路的活化,發(fā)現(xiàn)近端小管細(xì)胞和腎小球中足細(xì)胞的形成明顯減少,而伴隨非上皮細(xì)胞的增多。如果在足細(xì)胞發(fā)育過程中出現(xiàn)異常通路的活化,可抑制足細(xì)胞的終末分化,引起小鼠腎小球硬化。我們通過收集臨床糖尿病腎病標(biāo)本、建立糖尿病小鼠模型及足細(xì)胞高糖,培養(yǎng),檢測信號通路家族成員、及的表達(dá)情況,并通過應(yīng)用血管緊張素受體阻斷劑,、基因干擾技術(shù)及信號通路抑制劑抑制通路,來觀察是否信號通路參與時(shí)的足細(xì)胞損傷,促進(jìn)足細(xì)胞凋亡和細(xì)胞外基質(zhì)沉積,為糖尿病腎病的治療提供一條新的思路。方法糖尿病腎病患者腎組織中信號通路檢測收集年月年月在河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院經(jīng)病史、臨床檢查及腎穿刺活檢病理診斷為糖尿病腎病患者例,既往無其它腎臟病史,以例腎腫瘤患者遠(yuǎn)離腫瘤的瘤旁組織做為對照組。留取血和尿標(biāo)本檢測血糖、糖化血紅蛋白、小時(shí)尿蛋白定量切、肌酐、估算腎小球?yàn)V過率采用免疫組織化學(xué)檢測、及蛋白表達(dá)。信號通路在糖尿病小鼠腎組織中的作用雄性小鼠隨機(jī)分為組對照組、糖尿病組、糖尿病纈沙坦組。糖尿病模型小鼠腹腔單次注射鏈脲佐菌素,/,對照組只注射相同體積的枸櫞酸鹽緩沖液,小時(shí)后測定血糖和尿糖,中文摘要血糖值/,尿糖值卅卅者確定為糖尿病模型成功。糖尿病纈沙坦組小鼠在糖尿病模型建立后,以纈沙坦/灌胃,對照組和糖尿病組以等體積蒸餾水灌胃。分別于成模后、周每組取只小鼠,收集血液及小時(shí)尿液,用于生化指標(biāo)檢測,方法檢測尿液的含量切取腎臟中性甲醛固定用于組織化學(xué)、及免疫組織化學(xué)染色取部分腎皮質(zhì)組織置于戊二醛用于電鏡觀察部分腎皮質(zhì)組織用于提取蛋白及,檢測、及蛋白表達(dá),表達(dá)檢測、及另取部分腎皮質(zhì)組織于酒精固定,用于流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡率。高糖對小鼠足細(xì)胞信號通路的作用小鼠足細(xì)胞在,培養(yǎng)箱中,以含有胎牛血清及/的培養(yǎng)液培養(yǎng)細(xì)胞使其增殖,傳代后更干擾素培養(yǎng)箱換為不含干擾素的沖培養(yǎng)液,置入,中培養(yǎng)天,促進(jìn)細(xì)胞分化成熟。將實(shí)驗(yàn)細(xì)胞分成組正常糖對照/組/,、正常糖高滲對照組/,、高糖組,、/高糖陰性質(zhì)粒組,、高糖/、高糖質(zhì)粒組,/質(zhì)粒組,、高糖組/,。分別經(jīng)細(xì)胞同步化、/分組干預(yù)刺激、小時(shí)后收集細(xì)胞,免疫細(xì)胞化學(xué)檢測檢測、和蛋白表達(dá)、一、檢測、及及蛋白表達(dá)表達(dá)和/染色檢測足細(xì)胞凋亡率。結(jié)果糖尿病腎病患者臨床病理表現(xiàn)及信號通路檢測光鏡下觀察,對照組腎小球、腎小管及腎間質(zhì)未見明顯異常糖尿病腎病組腎小球體積增大,基底膜彌漫或不規(guī)則增厚,細(xì)胞外基質(zhì)增多,結(jié)節(jié)形成,部分腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性,間質(zhì)纖維化。糖中文摘要尿病腎病組空腹血糖、糖化血紅蛋白、尿蛋白量、肌酐較對照組均明顯增多,而腎小球?yàn)V過率糖尿病腎病組患者比對照組下降。免疫組化顯示、及在腎小球及腎小管均有表達(dá),糖尿病腎病組較對照組表達(dá)增多。糖尿病小鼠腎組織信號通路的表達(dá)及纈沙坦對信號通路和足細(xì)胞損傷的影響光鏡及電鏡下觀察,糖尿病組小鼠輕微腎小球體積增大,系膜基質(zhì)增多,基底膜不規(guī)則增厚,足細(xì)胞數(shù)量減少,足突融合,部分腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性。與對照組相比,糖尿病組小鼠尿蛋白從周開始明顯升高,隨病程延長呈逐漸升高的趨勢糖尿病小鼠血糖、尿素氮、肌酐比對照組小鼠增加,隨病程延長呈逐漸升高的趨勢與對照組相比,糖尿病組小鼠尿蛋白和尿含量明顯升高,給予纈沙坦治療后尿蛋白和含量降低。免疫組化結(jié)果顯示、和在對照組腎小球及腎小管有少量表達(dá),在糖尿病組表達(dá)明顯增加檢測顯示,與對照組比較,糖尿病組小鼠。腎組織中、及從周時(shí)開始升高,表達(dá)最高點(diǎn)在周,周時(shí)略有下降蛋白在糖尿病組比對照組表達(dá)增加,在糖尿病組各周次間表達(dá)無明顯差異糖尿病組水平與對照組相比表達(dá)增加,最、和高點(diǎn)在周,隨后下降。和顯示,糖尿病組小鼠腎小球組織、和蛋白及、水平與對照組相比增加,給予纈沙坦治療后、和降低。染色顯示在糖尿病組小鼠腎組織中觀察到凋亡細(xì)胞、及蛋白在糖尿病組小鼠腎小球組織中表達(dá)比對照組增加,給予纈沙坦治療后降低蛋白表達(dá)水平糖尿病組較對照組降低,給予纈沙坦后表達(dá)升高蛋白在各組間表達(dá)無明顯差異流式細(xì)胞術(shù)顯示糖尿病組小鼠腎小球內(nèi)細(xì)胞凋亡增加,糖尿病纈沙坦組降低,但仍高于對照組。足細(xì)胞體外高糖培養(yǎng)對信號通路表達(dá)及足細(xì)胞損傷的影響免疫細(xì)胞化學(xué)顯示,、和在正常糖對照組足細(xì)胞中有少量表達(dá),給予高糖刺激后表達(dá)量明顯增加中文摘要檢測顯示,和蛋白在高糖刺激足細(xì)胞小時(shí)升高,小時(shí)表達(dá)最高,小時(shí)略有下降蛋白在高糖刺激后其它時(shí)間點(diǎn)的表達(dá)量是高糖刺激小時(shí)表達(dá)量的倍,高糖刺激小時(shí)足細(xì)胞中蛋白水平表達(dá)無明顯差異蛋白在高糖刺激小時(shí)升高,小時(shí)達(dá)到項(xiàng)點(diǎn),小時(shí)有所降低表達(dá)在高糖刺激和小時(shí)升高,然后隨著刺激時(shí)間延長表達(dá)下降高糖刺激呈時(shí)間依賴性引起、和升高,最高峰在小時(shí)最高點(diǎn)在高糖刺激小時(shí),隨后隨著刺激時(shí)間延長而下降。和檢測發(fā)現(xiàn),高糖刺激引起、表達(dá)、蛋白及、增加,和轉(zhuǎn)染足細(xì)胞后表達(dá)下降,可抑制足細(xì)在高糖刺激后的過表胞、蛋白及、達(dá)現(xiàn)象,但、蛋白及在高糖組和高糖組之間無明顯差異。檢測發(fā)現(xiàn)高糖呈時(shí)間依賴性刺激蛋白表達(dá),小時(shí)開始增加,小時(shí)達(dá)到最高點(diǎn),而蛋白在高糖刺激后表達(dá)逐漸下降,最低點(diǎn)在小時(shí)在高糖刺激小時(shí)開始增加,小時(shí)為最高點(diǎn),之后逐漸減少蛋白在高糖刺激下表達(dá)逐漸增加,最高點(diǎn)在小時(shí)蛋白在高糖刺激各時(shí)間點(diǎn)之間表達(dá)無明顯差異。足細(xì)胞高糖培養(yǎng)并應(yīng)用或、質(zhì)粒轉(zhuǎn)染后發(fā)現(xiàn)、及蛋白較高糖組表達(dá)下降,但較正常糖對照組表達(dá)仍高,而蛋白較高糖組表達(dá)增強(qiáng),但較正常糖對照組表達(dá)仍低,蛋自在各組間表達(dá)無明顯差異。熒光染色及/染色顯示高糖組較正常糖對照組細(xì)胞凋亡率升高,轉(zhuǎn)染組及高糖組細(xì)胞凋亡率比高糖組降低。結(jié)論在糖尿病腎病患者腎組織、糖尿病小鼠腎組織、高糖培養(yǎng)足細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)信號通路成員有過表達(dá)現(xiàn)象,提示通路在糖尿病腎病足細(xì)胞中激活并可能參與足細(xì)胞損傷過程。纈沙坦抑制糖尿病小鼠腎組織中信號通路的活化,同時(shí)抑制蛋白尿和足細(xì)胞脫落,抑制凋亡相關(guān)蛋白表達(dá),減少細(xì)胞凋亡,抑制腎小球內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)沉積。提示纈沙坦可通過抑制信號通路來產(chǎn)生對糖中文摘要尿病腎病的治療效果。在高糖培養(yǎng)的足細(xì)胞中,應(yīng)用信號通路干擾質(zhì)粒及抑制劑抑制信號通路的活化后,可抑制凋亡相關(guān)蛋白表達(dá),減少足細(xì)胞凋亡。提示信號通路參與高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷。關(guān)鍵詞糖尿病腎病信號通路足細(xì)胞損傷細(xì)胞外基質(zhì)沉積凋亡英文摘要,一/,英文摘要一一,一,一,蜘英文摘要,。一,/十,/,一,。英文摘要,/,/,/,田,曲/,曲/,/,/,/,。,一,一,/,英文摘要,。,英文摘要,一,一,一,英文摘要,。,曲曲一,一曲,一,一,/,英文摘要,曲,了英文縮寫一英文縮寫中文譯名英文縮寫英文全稱血管緊張索脫嘌呤/脫嘧啶核苷內(nèi)/切核酸酶型受體血管緊張素血管緊張素受體阻斷劑糖尿病腎病細(xì)胞外基質(zhì)局灶性節(jié)段性腎小球硬化癥腎小球基底膜分泌酶抑制劑高糖正常糖胞內(nèi)域嘌呤霉素氨基核苷足盂蛋白腎素一血管緊張素系統(tǒng)裂孔膜鏈脲佐菌素轉(zhuǎn)化生長因子血管內(nèi)皮生長因子研究論文信號通路在糖尿病腎病足細(xì)胞損傷中的研究引言信號通路是一種在進(jìn)化過程中相對保守的廣泛存在于細(xì)胞間的信號傳導(dǎo)通路,在細(xì)胞的增生和分化中起到了關(guān)鍵性的作用。信號通路最早是在對果蠅的研究中發(fā)現(xiàn)的,部分通路功能缺陷后,果蠅翅膀邊緣會出現(xiàn)刻痕,因而得名。通路可影響果蠅翅膀、剛毛、眼、神經(jīng)系統(tǒng)的形成。在哺乳動物體為信號通路有四種受體和五種配體,其中受體為,配體分別為、樣配體、和。信號由受體與配體相互作用而激活。配體誘導(dǎo)受體發(fā)生構(gòu)象改變,先在細(xì)胞外金屬蛋白酶的作用下發(fā)生水解,隨后又在分泌酶的介導(dǎo)下釋放出胞內(nèi)域,。是信號的活化形式,其進(jìn)入細(xì)胞核后激活通路下游基因和,影響細(xì)胞分化、增殖和凋亡。已有研究表明信號通路在腎臟發(fā)育、形成過程中起到了關(guān)鍵性作用。和出現(xiàn)在“”形小體中,也可出現(xiàn)在集合管。表達(dá)在“”形小體的遠(yuǎn)側(cè)部分。、和主要被檢測在內(nèi)皮細(xì)胞中表達(dá)。和在腎小囊的發(fā)生過程中出現(xiàn)在血管內(nèi)皮細(xì)胞和“”形小體的近側(cè)部分。在腎臟發(fā)育過程中沒有表達(dá)。,抑制小鼠后腎形成過等使用丫分泌酶抑制劑丫程中的活化,發(fā)現(xiàn)上皮細(xì)胞形成明顯缺陷,近端小管細(xì)胞和腎小球在足細(xì)胞發(fā)育過程中中足細(xì)胞的形成明顯減少,伴隨非上皮細(xì)胞增多。出現(xiàn)異常通路的活化,可引起小鼠腎小球硬化,抑制足細(xì)胞的終末分化。這些研究提示信號通路在足細(xì)胞和近端小管的分化中起著重要的作用。最近信號通路在腎臟中的研究,已經(jīng)從腎臟的發(fā)育轉(zhuǎn)到腎小球疾病中。信號通路可能在足細(xì)胞凋亡過程中起到了關(guān)鍵性作用。臨床與實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)足細(xì)胞損傷是腎小球疾病發(fā)展的重要因素,可引起嚴(yán)重的蛋白尿。最近根據(jù)足細(xì)胞損傷原因及數(shù)量進(jìn)行腎小球疾病的組織病理學(xué)研究論文分類。信號通路的激活可能是足細(xì)胞病理損傷的一個(gè)常見機(jī)制,受影響足細(xì)胞的最終結(jié)局依賴于信號通路的水平。最近研究發(fā)現(xiàn)信號通路與局灶性節(jié)段性腎小球硬化癥,、嘌呤霉素氨基核苷腎病和綜合癥的足細(xì)胞損傷有關(guān)。信號通路在糖尿病腎病,中的研究少見。在糖尿病腎病中信號通路水平可能與足細(xì)胞的損傷程度有關(guān)。信號通路被激活后,可能通過其靶基因、和,進(jìn)一步導(dǎo)致足細(xì)胞損傷和腎小球硬化。足細(xì)胞發(fā)生損傷時(shí)可引起足細(xì)胞相關(guān)蛋白,女、整合素、等,在足細(xì)胞內(nèi)的重新分布和表達(dá)量減少,足細(xì)胞與基底膜之間粘附性減低,導(dǎo)致足細(xì)胞脫落。另外,在腎小球疾病中足細(xì)胞數(shù)量減少,還由于可發(fā)生足細(xì)胞的凋亡。足細(xì)胞損傷后可激活足細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白如、心,誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡。足細(xì)胞數(shù)目減少會造成濾過膜對蛋白選擇通透性的喪失,發(fā)生蛋白尿,而尿蛋白的增加將誘導(dǎo)腎小球纖維化和腎小管萎縮,以上不可逆的間質(zhì)改變和腎小球硬化最終將導(dǎo)致慢性腎功能衰竭。已有研究證實(shí),腎素一血管緊張素系統(tǒng),在的發(fā)生時(shí)在腎內(nèi)激活,參與腎組織高灌注、高濾過的病變過程。我們通過檢測糖尿病腎病患者和糖尿病小鼠腎組織及高糖培養(yǎng)足細(xì)胞中信號通路的表達(dá)情況,在糖尿病小鼠給予血管緊張素受體阻斷劑,在體外培養(yǎng)足細(xì)胞中應(yīng)用基因干擾技術(shù)及化學(xué)抑制劑抑錯(cuò)通路的活化,進(jìn)一步探討信號通路在糖尿病腎病中是否參與足細(xì)胞損傷,為糖尿病腎病的臨床治療提供新的靶點(diǎn)。研究論文第一部分信號通路在糖尿病腎病患者腎組織中的表達(dá)及意義上刖置糖尿病腎病,是一種常見的糖尿病并發(fā)癥,現(xiàn)在已成為晚期腎病的常見原因。不僅嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量,還常常危及患者生命,因此探討發(fā)病、發(fā)展機(jī)制,找到針對的有效治療是非常有意義的。糖尿病腎病的發(fā)病機(jī)制非常復(fù)雜,糖脂代謝紊亂、血流動力學(xué)改變、氧化應(yīng)激、炎性因子等是其主要起始因素。這些起始因素不僅參與的發(fā)展過程,還激活多條信號傳導(dǎo)通路,各種信號通路相互作用,共同參與進(jìn)程。近年來,信號通路在腎小球疾病中的作用得到了大家的重視,但其在中的作用機(jī)制還不清楚【。信號通路最早是在研究果蠅的發(fā)育過程中被發(fā)現(xiàn)的,基因的部分功能缺失可造成果蠅翅膀邊緣刻痕,因而得名【。信號通路是一種在進(jìn)化過程中相對保守的廣泛存在于細(xì)胞間的信號傳導(dǎo)通路,在細(xì)胞的增生和分化中起到了關(guān)鍵性的作用【,。在哺乳動物體內(nèi)信號通路有四種受體和五種配體,其中受體為,配體分別為、樣配體、和。信號通路配體與受體結(jié)合,誘導(dǎo)受體發(fā)生構(gòu)象改變,在丫分泌酶丫的介導(dǎo)下釋放出胞內(nèi)域。是信號的活化形式,其進(jìn)入細(xì)胞核后激活下游基因和,調(diào)節(jié)細(xì)胞轉(zhuǎn)歸,誘導(dǎo)細(xì)胞分化。近年來發(fā)現(xiàn),信號通路可能在腎小球疾病的發(fā)生、發(fā)展中起到了重要作用,并與其它信號通路有相互作用。已有研究發(fā)現(xiàn)信號通路與局灶性節(jié)段性腎小球硬化癥、嘌呤霉素氨基核苷,腎病和綜合癥的足細(xì)胞損傷、腎小球硬化有關(guān)【,。在這個(gè)部分中,我們收集臨床腎穿刺標(biāo)本,通過檢測糖尿病腎病患者腎組織中信號通路的表達(dá)情況,為進(jìn)一步研究信號通路與糖尿病腎病腎小球硬化之間的關(guān)系提供依據(jù)。研究論文材料與方法儀器石蠟切片機(jī)德國公司石蠟包埋機(jī)德國公司全自動顯微照相系統(tǒng)日本公司病理圖像分析系統(tǒng)北京航空航天大學(xué)透射電鏡日本日立公司低速離心機(jī)上海醫(yī)療器械集團(tuán)公司低溫冰箱日本三洋公司電熱恒溫孵育箱重慶實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠型醫(yī)用微波爐上海中達(dá)醫(yī)學(xué)研究所試劑美國公司兔抗多克隆抗體兔抗多克隆抗體美國公司兔抗多克隆抗體美國公司兔抗多克隆抗體美國公司美國公司兔抗多克隆抗體多聚賴氨酸河北博海生物公司三步法免疫組化試劑北京中杉生物技術(shù)有限公司顯色試劑盒北京中杉公司進(jìn)口分裝試劑配制,溶于蒸餾水中。臨床標(biāo)本收集收集年月年月在河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院腎內(nèi)科住院,經(jīng)病史、臨床檢查及腎穿刺活檢病理診斷為糖尿病腎病患者例,年齡歲,其中男例,女例。所有病人未應(yīng)用糖皮質(zhì)激素、細(xì)胞毒藥物,除外其它合并膜性腎病、局灶節(jié)段性腎小球硬化、腎病等原發(fā)性腎臟病及繼發(fā)性腎病如乙肝病毒相關(guān)性腎炎、狼瘡性腎炎、紫癜性腎炎、淀粉樣變性、骨髓瘤腎病等。研究論文以例腎臟腫瘤患者遠(yuǎn)離腫瘤的瘤旁組織做為對照組。腎組織常規(guī)石蠟包埋,切片,進(jìn)行組織化學(xué)及免疫組化檢測。收集隘床資料,包括性別、年齡、身高、體重、血壓、家族史、病程、服藥史、血糖、糖化血紅蛋白、小時(shí)尿蛋白定量、肌酐、估算腎小球?yàn)V過率等。以例無糖尿病病史,腎功能正常體檢者血尿標(biāo)本進(jìn)行檢測作為正常對照。染色切片脫蠟至水,過碘酸氧化分鐘,蒸餾水沖洗次,每次分鐘,還原液分鐘,氏液分鐘,自來水洗,蘇木素復(fù)染,脫水透明,中性樹膠封片。免疫組織化學(xué)檢測、及蛋白表達(dá)采用免疫組化法進(jìn)行檢測。制備腎組織石蠟切片,切片經(jīng)常規(guī)脫蠟至水,甲醇溶液室溫孵育分鐘封閉內(nèi)源性過氧化物酶,蒸餾水沖洗次,每次分鐘,切片加入抗原修復(fù)液/檸檬酸,采用微波修復(fù)法進(jìn)行抗原修復(fù),連續(xù)修復(fù)兩檸檬酸鈉緩沖液,次,第一次修復(fù)功率為檔,修復(fù)分鐘,第二次修復(fù)功率為檔,修復(fù)分鐘,室溫下冷卻分鐘,磷酸鹽緩沖液沖洗次,每次分鐘,加入正常山羊血清,分鐘封閉內(nèi)源性生物素,甩掉血清滴加兔抗、及多克隆抗體,孵育過夜,次日取出切片,沖洗次,每次分鐘,滴加生物素標(biāo)記的山羊抗兔,孵育分鐘,沖洗次,每次分鐘,滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素,孵育分鐘,沖洗次,每次分鐘,二氨基聯(lián)苯胺顯色,光鏡下觀察并控制顯色程度,蒸餾水沖洗,蘇木素復(fù)染,陽性部位呈棕黃色,脫水透明,中性樹膠封片。以替代一抗作為陰性對照。運(yùn)用圖像分析系統(tǒng)邶認(rèn),同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)清屏影像公司對各組切片隨機(jī)選取個(gè)高倍視野,分析腎小球免疫組化陽性信號的積分光密度值,細(xì)胞核表達(dá)的計(jì)數(shù)腎小球陽性細(xì)胞核占所在腎小球總細(xì)胞核百分比。以各組陽性表達(dá)的均值作為最終結(jié)果。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理應(yīng)用軟件分析系統(tǒng)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理。計(jì)量資料用均數(shù)標(biāo)研究論文準(zhǔn)差妊峪表示,各組間數(shù)據(jù)比較采用方差分析,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)二也巴、,思義。結(jié)果腎臟形態(tài)學(xué)改變光鏡下觀察,對照組腎小球、腎小管及腎間質(zhì)未見明顯異常糖尿病腎病組腎小球體積增大,基底膜彌漫或不規(guī)則增厚,細(xì)胞外基質(zhì)增多,嚴(yán)重者結(jié)節(jié)形成,腎小球硬化部分腎小管上皮細(xì)胞出現(xiàn)空泡變性,間質(zhì)纖維化,小動脈管壁略增厚。生化指標(biāo)檢測糖尿病腎病組患者空腹血糖、糖化血紅蛋白、尿蛋白量、肌酐較對照組均明顯增多,而腎小球?yàn)V過率糖尿病腎病組患者比對照組下降尸,。,腎組織中通路的表達(dá)免疫組化顯示對照組和在腎小球和腎小管胞漿中有少量表達(dá),糖尿病腎病組與對照組比較表達(dá)明顯增強(qiáng)氏,、及在腎小球和腎小管細(xì)胞核中表達(dá),糖尿病腎病組比對照組表達(dá)增加,。研究論文附圖互寸甕吾尸研究論文圈互譬芝勺蠹口三二血堍圈暑雹屯磊器翟。荽鱗謄一。,弋,墓每,、。五,二一,“。、王工。,”、。、黟黲,。、,“,、一、,。二凄餮菇一一二尊。露薯孓、一,一一,、。、,一冀繁鹺。肇,觚岫玎蛐,撇姻獸磐莒研究論文附表,妊嗡,”研究論文討論信號通路是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和分化的重要通路,最近在腎小球疾病中的研究越來越得到大家的重視【,。有研究通過在轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)表達(dá),結(jié)果發(fā)現(xiàn)其可通過激活途徑,引起足細(xì)胞凋亡伴系膜增生,裂孔膜變大,出現(xiàn)蛋白尿,節(jié)段性腎小球硬化和腎間質(zhì)纖維化【。,在非轉(zhuǎn)基因小鼠模型中應(yīng)用丫分泌酶抑制劑丫抑通路活化,可保護(hù)足細(xì)胞損傷,減少足細(xì)胞足突消失,阻止蛋白尿產(chǎn)生】。我們通過免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)在對照組腎小球中通路成員僅見少量表達(dá),而在糖尿病腎病患者腎小球通路配體和受體表達(dá)增加,配體和受體的結(jié)合可誘導(dǎo)受體發(fā)牛構(gòu)象改變,存分泌酶的介導(dǎo)下向細(xì)胞內(nèi)釋放出。通過觀察發(fā)現(xiàn)及其下游基因、在糖尿病腎病患者腎小球中表達(dá)較對照組明顯增強(qiáng)。這些說明在發(fā)生、發(fā)展過程中,腎組織中會出現(xiàn)通路的激活。等也發(fā)現(xiàn)在糖尿病腎病患者和糖尿病模型中存在、和表達(dá)增加,并與血糖及足細(xì)胞損傷程度呈正相關(guān),使用或敲除轉(zhuǎn)錄因子后可阻止足細(xì)胞凋亡,延緩腎小球硬化。足細(xì)胞是終末分化的腎小球上皮細(xì)胞,它附著在腎小球基底膜外側(cè),是腎小球?yàn)V過膜的重要組成部分,由于足細(xì)胞是高度分化細(xì)胞,增殖能力較差【引。在糖尿病腎病中,血糖、血流動力學(xué)改變、脂質(zhì)代謝紊亂、氧化應(yīng)激、炎癥因子等引起腎小球足細(xì)胞的損傷。我們發(fā)現(xiàn)在糖尿病腎病患者腎組織信號通路被激活的同時(shí),還發(fā)現(xiàn)糖尿病腎病患者血糖增加,尿蛋白增加,腎臟功能下降,增厚,腎小球硬化。這些提示糖尿病。腎病患者腎組織通路的活化可能與腎小球足細(xì)胞損傷有關(guān)。受損的足細(xì)胞表現(xiàn)為細(xì)胞內(nèi)固有結(jié)構(gòu)蛋白減少,粘附性下降,可發(fā)生脫落或凋亡,造成腎小球內(nèi)足細(xì)胞數(shù)量和密度減少,暴露,破壞濾過膜,產(chǎn)生蛋白尿【。同時(shí),受損的足細(xì)胞引起細(xì)胞外基質(zhì),增加,進(jìn)而導(dǎo)致腎小球硬化,造成腎臟損傷引。因此,足細(xì)胞的損傷是最終引起腎小球硬化的關(guān)鍵性因素。研究論文通過檢澳信號通路,觀察其與發(fā)展過程中腎臟損傷之間的關(guān)系及機(jī)制,將為的防治提供了一條新的途徑。小結(jié)糖尿病腎病患者腎組織中出現(xiàn)信號通路激活。糖尿病腎病患者出現(xiàn)腎功能損害及腎小球硬化。參考文獻(xiàn),一虹,一,/,/,。,研究論文,一,/,。,研究論文第二部分信號通路在糖尿病小鼠腎組織中的表達(dá)及意義一刖昌足細(xì)胞是高度分化的腎小球臟層上皮細(xì)胞,通過帕整合素和砣。蛋白聚糖復(fù)合體連接于腎小球基底膜上,足細(xì)胞足突之間形成許多裂孔,裂孔上覆蓋有裂孔膜,是維持。腎小球?yàn)V過膜的最后屏障,阻止血漿蛋白濾過,。在糖尿病腎病,中,血糖、血流動力學(xué)改變、脂質(zhì)代謝紊亂、氧化應(yīng)激、炎癥因子等引起腎小球足細(xì)胞的損傷,這一病損可早于系膜細(xì)胞和小管細(xì)胞數(shù)年,與臨床早期持續(xù)蛋白尿相關(guān),可導(dǎo)致腎小球硬化【,。首先,糖尿病腎病足細(xì)胞中的足細(xì)胞相關(guān)蛋白發(fā)生結(jié)構(gòu)改變、分布異常和表達(dá)量的減少。通過對糖尿病腎病患者研究表明,蛋白可以發(fā)生從足細(xì)胞膜到細(xì)胞質(zhì)的重新分布和表達(dá)量減少,導(dǎo)致濾過膜對蛋白選擇通透性的喪失,發(fā)生蛋白尿【】。足盂蛋白,是足細(xì)胞足突頂膜區(qū)主要的帶負(fù)電荷跨膜蛋白,也是組成腎小球基底膜電荷屏障的主要物質(zhì),當(dāng)足細(xì)胞損傷后表達(dá)減少,一方面破壞了足突間的排斥作用使之發(fā)生粘附、融合,導(dǎo)致足細(xì)胞易于脫落,另一方面裂隙膜完整性受到破壞,腎小球?yàn)V過電荷屏障減弱,促進(jìn)蛋白尿的發(fā)生,加速進(jìn)展。另外,在糖尿病腎病發(fā)生時(shí)可激活足細(xì)胞內(nèi)凋亡相關(guān)蛋白如、發(fā)生凋亡。等【】在糖尿病模型及高糖培養(yǎng)的足細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)/值和顯著升高,足細(xì)胞凋亡增加。足細(xì)胞凋亡后造成足細(xì)胞數(shù)目減少會進(jìn)一步加重蛋白尿,而蛋白尿的加重將引起細(xì)胞外基質(zhì),增加,誘導(dǎo)腎小球間質(zhì)纖維化和腎小管萎縮,以上不可逆的問質(zhì)改變和腎小球硬化最終將導(dǎo)致慢性腎功能衰竭【。因此糖尿病腎病足細(xì)胞的損傷是最終引起腎小球硬化的關(guān)鍵因素。已有研究證實(shí),腎素血管緊張素系統(tǒng),在的發(fā)生時(shí)在腎內(nèi)激活,參與腎組織高灌注、高濾過的病變過程【。研究論文作為系統(tǒng)的主要效應(yīng)因子,在,血管緊張素腎組織內(nèi)常明顯升高,通過血流動力學(xué)及非血流動力學(xué)因素,在進(jìn)可以通過多種途徑造成足展過程中發(fā)揮重要作用。在的早期通過與其受體結(jié)合從而發(fā)揮生物學(xué)細(xì)胞損傷,導(dǎo)致蛋白尿發(fā)生【引。生物學(xué)效應(yīng)主要是由血管受體有四型,其效應(yīng),至今發(fā)現(xiàn)緊張素型受體帥,介導(dǎo)。纈沙坦是血管緊張素受體阻斷劑,具有腎臟保護(hù)作用,是目前治療的常規(guī)藥物】引。大量研究表明,纈沙坦具有降低血壓,減少蛋白尿,改善腎小球損傷及纖維化的作用。在前一部分,我們發(fā)現(xiàn)信號通路在糖尿病腎病患者腎小球組織中激活。在這一部分中,我們建立糖尿病小鼠模型,通過檢測糖尿病小鼠腎組織中信號通路的表達(dá)情況,來研究信號通路與糖尿病腎病足細(xì)胞損傷之間的關(guān)系,并觀察纈沙坦對糖尿病小鼠信號通路以及足細(xì)胞損傷的影響。材料與方法儀器血糖分析儀美國強(qiáng)生公司電熱恒溫箱重慶實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠型醫(yī)用微波爐上海中達(dá)醫(yī)學(xué)研究所石蠟切片機(jī)德國公司石蠟包埋機(jī)德國公司臺式高速冷凍離心機(jī)北京四環(huán)科學(xué)儀器廠紫外可見分光光度計(jì)上海光譜儀器有限公司旋渦混合器上海精科實(shí)業(yè)有限公司超低溫冰箱青島自動三重純水蒸餾器上海亞榮生化儀器廠低速大容量多管離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠恒溫磁力攪拌器上海司樂儀器廠壓力蒸汽火菌器博迅實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠研究論文垂直電泳槽北京市六一儀器廠轉(zhuǎn)移電泳儀北京市六一儀器廠轉(zhuǎn)移電泳槽北京市六一儀器廠水浴振蕩器哈爾濱科學(xué)儀器廠凝膠成像分析儀美國公司電熱恒溫干燥箱天津市華北實(shí)驗(yàn)儀器有限公司德國公司梯度基因擴(kuò)增儀實(shí)時(shí)定量儀安捷倫科技有限公司水平電泳槽北京市六一儀器廠電子恒溫水浴鍋天津市泰斯特儀器有限公司電子天平北京賽多利斯天平有限公司型離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠透射電鏡日本日立公司電子天平重慶衡器廠光學(xué)顯微鏡日本型流式細(xì)胞儀美國公司試劑鏈脲佐菌素美國公司多聚賴氨酸河北博海生物公司美國公司兔抗多克隆抗體兔抗多克隆抗體美國公司兔抗多克隆抗體美國公司美國公司兔抗多克隆抗體美國公司兔抗多克隆抗體兔抗多克隆抗體美國公司美國公司兔抗多克隆抗體美國公司兔抗多克隆抗體鼠抗美國一單克隆抗公司體兔抗多克隆抗體美國公司北京博奧森公司兔抗多克隆抗體研究論文小鼠檢測試劑盒上海藍(lán)基生物科技有限公司組織提取試劑盒美國公司熒光檢測試劑盒美國公司增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光試劑盒美國公司北京中杉公司進(jìn)口分裝辣根酶標(biāo)記羊抗兔北京中杉公司進(jìn)口分裝辣根酶標(biāo)記羊抗小鼠預(yù)染蛋白分子量美國公司蛋白酶抑制劑美國公司膜美國公司顯色試劑盒北京中杉生物技術(shù)有限公司三步法免疫組化試劑北京中杉生物技術(shù)有限公司三羥甲基氨基甲烷天津市華東試劑廠脫氧膽酸鈉美國公司二硫蘇糖醇美國公司苯甲磺酰氟德圍公司考馬斯亮藍(lán)蛋白測定試劑盒南京建成生物工程研究所十二烷基磺酸鈉美國公司溴酚藍(lán)美國公司石家莊拜昂生物公司甘氨酸美國公司美國公司丙烯酰胺美國公司亞甲雙丙烯酰胺美國公司過硫酸銨美國公司匝美國公司美國公司美國公司脫氧核糖核苷三磷酸心汀賽百盛公司美國公司美國公司瓊脂糖葡萄牙進(jìn)口分裝研究論文溴化乙錠美國公司纈沙坦北京諾華制藥有限公司試劑配制/,蒸餾水中。,溶于,用濃調(diào)節(jié),加蒸餾水值至,加水補(bǔ)足至。含的,即為。檸檬酸檸檬酸鈉緩沖液/,液/檸檬酸蒸餾水檸檬酸溶于液/檸檬酸鈉蒸餾水檸檬酸鈉溶于取皿液,液,混合成終濃度為的緩/,沖液。配制溶于蚰檸檬酸檸檬酸鈉緩沖液中,濃度為酬,現(xiàn)用現(xiàn)配,避光。/,取液和/檸檬酸抗原修復(fù)液。液,混合后加蒸餾水定容至電泳緩沖液甘氨酸,。蒸餾水溶解后,定容至蒸餾電轉(zhuǎn)移緩沖液甘氨酸,預(yù)冷備用。水溶解,甲醇,蒸餾水定容至貯存液丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺,先用,避“蒸餾水溶解,待完全溶解至溶液透明,加水定容至光保存。/溶于蒸餾水中,用,保存。/的調(diào)值為,加水定容至/堿溶于蒸餾水中,保存。用/的調(diào)值為,加水定容至電鏡固定液液雙蒸水液唧研究論文雙蒸水組織固定液液與液混合戊二醛。后,加入戊二醛加樣緩沖液/甘油溴酚藍(lán)糖尿病動物模型建立及分組只雄性小鼠,周購自北京維通利華公司。動物隨機(jī)分為組對照組和糖尿病組。糖尿病組小鼠腹腔單次注射/,對照組只注射相當(dāng)體積的枸櫞酸鹽緩沖液,小時(shí)后尾尖取血,血糖儀測定血糖,尿糖試紙測/,尿糖者確定為糖尿病模型。分別定尿糖,血糖于注射后周、周、周及周每組取只小鼠,分別用代謝籠收集小時(shí)尿,用于尿液和檢測股動脈取血分離血清切取腎臟,取部分腎組織置于中性甲醛及戊二醛固定,用于光鏡、電鏡觀察及免疫組化檢測部分腎皮質(zhì)組織經(jīng)液氮速凍后保存于冰箱,用于和檢測部分腎皮質(zhì)用乙醇固定后用于流式細(xì)胞術(shù)檢測。血尿生化指標(biāo)檢測全自動生化分析每個(gè)樣本取血清和山尿液,采用日立儀測定血糖、尿素氮及肌酐。每個(gè)樣本取山尿液用西門子全自動免疫發(fā)光分析儀檢測尿蛋白濃度,計(jì)算尿蛋白量。檢測尿中的含量先后加入稀釋后的標(biāo)準(zhǔn)品、待測樣品于反應(yīng)孔內(nèi),立即加入山的牛物素標(biāo)記的一抗,輕輕振蕩混勻,孵育分鐘。甩去孔內(nèi)液體,震蕩洗滌次,每次秒。每孔加入山的辣根酶標(biāo)記的二抗,輕輕振蕩混勻,孵育分鐘。甩去孔內(nèi)液體,震蕩洗滌次,研究論文輕輕振蕩混勻,孵育每次秒。每孔加入底物、各山,分鐘,避免光照。取出酶標(biāo)板,迅速加入終止液,立即測定結(jié)果