Southern印跡技術(shù)應(yīng)用與注意事項.ppt

1、Southern印跡 技術(shù)應(yīng)用與注意事項,威斯騰生物技術(shù)中心 400-675-6758,（Edwin Mellor Southern UK）,Southern印跡雜交（Southern blot）是1975年由英國人southern創(chuàng)建，是研究DNA圖譜的基本技術(shù)，在遺傳病診斷、DNA圖譜分析及PCR產(chǎn)物分析等方面有重要價值。,隨后于1977年，Alwine等人應(yīng)用類似方法用于檢測經(jīng)瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝膠（PAGE）電泳中分離的特定RNA，此方法又稱為Northern blot（Northern印跡）。 1979年Towbin等再將該方法擴展到特定的蛋白質(zhì)檢測或分析上，成為Western

2、blot（Western 印跡）,一、技術(shù)簡介,具有一定同源性的兩條核酸單鏈在一定的條件下，可按堿基互補的原則特異性地雜交形成雙鏈。 一般利用瓊脂糖凝膠電泳分離經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化的DNA片段。 將膠上的DNA變性并在原位將單鏈DNA片段轉(zhuǎn)移至尼龍膜或其他固相支持物上，經(jīng)干烤或者紫外線照射固定。 再與相對應(yīng)結(jié)構(gòu)的標(biāo)記探針進行雜交，用放射自顯影或酶反應(yīng)顯色，從而檢測特定DNA分子的含量。,二、技術(shù)原理,三、操作步驟,三、操作步驟-酶切位點，探針設(shè)計,酶切位點設(shè)計原則： 1.根據(jù)實驗?zāi)康脑O(shè)計酶切位點； 2.選用酶切效率高的常用限制性內(nèi)切酶； 3.選用1-2種內(nèi)切酶。 探針設(shè)計： 1.設(shè)計引物，遵循引

3、物設(shè)計原則。 2.片段長度根據(jù)酶切后片段大小決定，不宜過長，否則會影響雜交過程中與膜上樣本的結(jié)合效率。,三、操作步驟-樣本準(zhǔn)備,DNA提取常用方法: 1.CTAB 法提取DNA 取材料，加液氮研磨成粉末狀，迅速移入1.5 ml Eppendorf管中； 加入800 l的CTAB提取緩沖液，混勻（CTAB在65水浴預(yù)熱），每5min輕輕震蕩幾次，20min后12000 r/min，離心15 min； 小心吸取上清液，加入等體積的酚：氯仿（各400l）溶液，混勻，4，12000 r/min，離心10 min； 小心吸取上清液，加入等體積的氯仿，混勻，4，12000 r/min，離心10 min。

4、重復(fù)步驟（4）1-2次，以蛋白層不出現(xiàn)為止； 取上清，-20沉淀過夜h，4，12000 r/min，離心10 min； 棄去上清液，用70%乙醇洗滌沉淀2次； 室溫下干燥后（一般干燥5-15 min），溶于30-50 l DEPC去離子水中，于-20或者-70下保存?zhèn)溆谩?2.Chelex-100樹脂法 3.試劑盒抽提 4.磁珠提取法,三、操作步驟-探針標(biāo)記,用引物TF和TR進行PCR擴增制備探針，膠回收產(chǎn)物，再用標(biāo)志物進行標(biāo)記。 常用標(biāo)志物： 同位素靈敏度高，效果好； 地高辛安全性好； 將擴增得到的探針片段煮沸處理，冰浴5min，加入DIG，37孵育過夜。 T4多聚核苷酸激酶人工合成的短寡核

5、苷酸。,三、操作步驟-酶切和電泳,酶切: 取樣本，加入限制性內(nèi)切酶，37酶切1h左右，待樣本酶切到適宜程度，即可終止反應(yīng)，用作后續(xù)試驗。,電泳： 酶切1.5 h后，取2L酶切DNA樣品于1%的瓊脂糖凝膠上進行檢測，判斷酶切程度。當(dāng)酶切充分時，制備1%的瓊脂糖電泳凝膠，樣品中加入10loading buffer，于30-40 V穩(wěn)壓電泳 4-5 h（包括DNA Marker和陽性對照質(zhì)粒）。 電泳完成之后，切下樣品及質(zhì)粒部分的凝膠，剩余DNA Marker部分則單獨浸泡在添加了10 L 10 mg/ mL溴化乙錠（EB）的100 mL 1 TAE buffer中染色30 min。,三、操作步驟-

6、轉(zhuǎn)膜、固定,電泳凝膠預(yù)處理 1) 將凝膠浸于適量變性液中（浸沒凝膠），室溫，于水平搖床上低速晃動15 min，并重復(fù)一次； 2) 再將凝膠浸于滅菌的ddH2O中，室溫，輕輕晃動10 min； 3) 將凝膠浸在中和液中，室溫輕輕晃動15 min，并重復(fù)一次； 4) 在20SSC緩沖液中平衡凝膠10 min以上。 轉(zhuǎn)膜 1) 裁剪一張大小合適（19 cm20 cm）的whatman 3mm濾紙，經(jīng)20SSC buffer浸濕后，放在比凝膠稍大的支撐平臺上，兩端浸入20SSC buffer，形成一個“橋”； 2) 將與凝膠等大的濾紙放在搭好橋的濾紙上，再將凝膠放置于濾紙上（凝膠背面向上放置），切掉左

7、上角，注意兩者之間杜絕氣泡； 3) 裁剪尼龍膜，與凝膠等大，放置在凝膠上，利用玻棒使其平整，杜絕氣泡出現(xiàn)； 4) 將三張與膜等大的whatman 3mm濾紙放在膜上，利用玻棒使其平整后，放置一疊與凝膠大小一致的吸水紙，并用玻璃板作為放置重物的平臺，壓在吸水紙上，再添加500 g左右的重物； 5) 用塑料隔板封閉凝膠四周，以防止吸水紙通過接觸凝膠的邊緣而直接接觸平板造成液流的短路； 6) 轉(zhuǎn)移3小時后，將浸濕的吸水紙換掉，添加干燥的吸水紙，整個轉(zhuǎn)移過程為18-24 h，期間根據(jù)吸水紙濕潤情況換紙1-2次； 7) DNA在膜上的固定： 將完成轉(zhuǎn)移后的尼龍膜置于2SSC緩沖液中短暫洗滌1 min，放

8、置于兩張濾紙中，120烘箱中烘干固定30 min。,三、操作步驟-雜交、顯色,雜交 1) 預(yù)雜交：將尼龍膜上沒有固定DNA的一面貼瓶壁，放入雜交瓶中，加入42預(yù)熱的Hyb高效雜交液（Hyb-100）(10 mL/100 mm2)，置于42雜交爐中預(yù)雜交2 h； 2) 標(biāo)記探針：用引物TF和TR進行PCR擴增制備探針，膠回收產(chǎn)物，再按照DIG試劑盒的操作說明標(biāo)記探針，并用PCR產(chǎn)物純化試劑盒純化探針； 3) 探針變性：將純化后的探針沸水中水浴變性10 min，立即置于冰上，冰浴2 min（現(xiàn)用現(xiàn)備）； 4) 雜交：棄去預(yù)雜交液，往雜交瓶中加入新的Hyb 高效雜交液（10 mL/1002），再加入

9、6 L變性好的探針（5-20 ng/ mL雜交液），混勻，置于雜交爐中42雜交過夜。 洗膜及DIG信號檢測 1) 雜交后，室溫下，20 mL 2SSC+0.1%SDS 洗膜5 min，重復(fù)一次 2) 將0.1SSC+0.1%SDS洗液置于65水浴鍋中預(yù)熱后，加入20 mL 進雜交瓶中，65洗滌15 min，重復(fù)一次； 3) 將膜取出，置于平板中，加入20 mL 洗滌緩沖液中輕輕晃動5 min，倒掉液體； 4) 加入100 mL 阻斷液反應(yīng)30 min（在搖床上輕輕搖動），倒掉液體； 5) 加入20 mL 含有抗體的緩沖液，搖動孵育30 min后，倒掉液體； 6) 再加入100 mL洗滌緩沖液洗

10、滌15 min，倒掉液體后，重復(fù)此步驟一次； 7) 加入20 mL檢測緩沖液，平衡5分鐘； 8) 將膜放在盛有底物顯色液的盒中（10 mL顯色液/100 mm2），15-25避光孵育3-5h； 9) 當(dāng)顯色到適合效果后用水洗膜5 min，掃描結(jié)果。,四、注意事項,02,03,04,01,探針設(shè)計和標(biāo)記 引物的特異性要高，產(chǎn)物片段長度適宜，標(biāo)記后需純化,樣本問題 獲得樣本時，需要保證DNA的完整性，防止降解，用量6ug,酶切與電泳 酶切體系，時間要合適，防止酶切不完全或酶切過度，電泳要低壓長時間電泳,轉(zhuǎn)膜 膠片用于防止轉(zhuǎn)膜過程的“短路”，做好標(biāo)記,05,雜交 將膜放置進入雜交瓶內(nèi)防止氣泡出現(xiàn)，讓

11、非片段面貼瓶壁,06,顯色 膜在與顯色液反應(yīng)時嚴(yán)格避光，隨時注意條帶情況,酶切結(jié)果展示,五、應(yīng)用范圍,Southern blot,遺傳病 診斷,DNA 圖譜分析,PCR 產(chǎn)物分析,傳統(tǒng)的基因診斷技術(shù)主要是以基因探針技術(shù) 為基礎(chǔ)而建立的一些檢測方法-Southern blot,高度的特異性 穩(wěn)定的遺傳性 體細胞穩(wěn)定性,檢測,六、案例分析,端粒酶長度檢測,Southern blot已廣泛應(yīng)用于分析DNA和端粒結(jié)構(gòu). 用限制性核酸內(nèi)切酶Hin f或Rsa消化DNA, 然后瓊脂糖電泳分離不同大小的片段, 轉(zhuǎn)移到硝酸纖維或尼龍膜上. 用32P同位素或生物素、堿性磷酸酯酶標(biāo)記的端粒特異探針與其雜交(CCCATT)n. 末端限制酶切片段(TRF)通過光密度計定量測量. TRF法得到的數(shù)據(jù)除代表所有染色體端粒的長度外, 還包括部分亞端粒區(qū)長度. 因此TRF法不能提供端粒的實際長度.,七、總結(jié),做好Southern雜交的最根本就在于熟悉每一個步驟