高效液相色譜法　講義.ppt

1、第二十章 高效液相色譜法,High-Performance Liquid Chromatography,優(yōu)點,高速：HPLC采用高壓輸液設(shè)備，流速大增加，分析速度極快，只需數(shù)分鐘；而經(jīng)典方法靠重力加料，完成一次分析需時數(shù)小時 高效：填充物顆粒極細(xì)且規(guī)則，固定相涂漬均勻、傳質(zhì)阻力小，因而柱效很高?？梢栽跀?shù)分鐘內(nèi)完成數(shù)百種物質(zhì)的分離 高靈敏度：檢測器靈敏度極高：UV10-9g, 熒光檢測器 10-12g,High-Performance Liquid Chromatography,HPLC與GC的比較,分析對象及范圍：GC分析只限于氣體和低沸點的穩(wěn)定化合物，而這些物質(zhì)只點有機(jī)物總數(shù)的20%；HPL

2、C可以分析高沸點、高分子量的穩(wěn)定或不穩(wěn)定化合物，這類物質(zhì)占有機(jī)物總數(shù)的80%。 流動相的選擇：GC采用的流動相中為有限的幾種“惰性”氣體，只起運(yùn)載作用，對組分作用?。籋PLC采用的流動相為液體或各種液體的混合，可供選擇的機(jī)會多。它除了起運(yùn)載作用外，還可與組分作用，并與固定相對組分的作用產(chǎn)生競爭，即流動相對分離的貢獻(xiàn)很大，可通過溶劑來控制和改進(jìn)分離。 操作溫度：GC需高溫；HPLC通常在室溫下進(jìn)行。,High-Performance Liquid Chromatography,第一節(jié) 高效液相色譜法的主要類型和原理,一、主要類型,化學(xué)鍵合相色譜法（Bonded phase chromatogra

3、phy, BPC) 離子抑制色譜法（Ion suppression chromatography, ISC) 離子對色譜法（Paired ion chromatography, PIC) 親合色譜法（Affinity chromatography, AC) 手性色譜法（Chiral chromatography, CC) 膠束色譜法（Micellar chromatography, MC) 電色譜法（Electrochromatography, EC),High-Performance Liquid Chromatography,二、化學(xué)鍵合相色譜法,化學(xué)鍵合相：采用化學(xué)反應(yīng)的方法將固定液鍵合

4、在載體表面上，所形成的填料 化學(xué)鍵合相色譜法：以化學(xué)鍵合相為固定相的色譜法,High-Performance Liquid Chromatography,疏溶劑理論,溶質(zhì)分子的非極性部分與固定相上的烴基之間產(chǎn)生疏溶劑締合作用 溶質(zhì)的極性部分受到極性流動相的作用，使它離開烴基，即解締合作用,High-Performance Liquid Chromatography,影響溶質(zhì)在反相鍵合相上保留行為的主要因素,溶質(zhì)的分子結(jié)構(gòu),流動相,固定相,溶質(zhì)極性 ，k ，tR 溶質(zhì)極性 ，k ，tR,表面張力 ，k ，tR 介電常數(shù) ，k ，tR 離解程度 ，k ，tR,鍵合烷基鏈 ，疏水性 ，k,High-

5、Performance Liquid Chromatography,0,0,0,0,High-Performance Liquid Chromatography,High-Performance Liquid Chromatography,反相離子對色譜,原理：將與待測物離子A電荷相反的離子B（稱為對離子或反離子）加入到含水流動相中，使待測離子A與對離子B形成離子對AB，該AB離子對的性質(zhì)與A離子或B離子的性質(zhì)不同，即間接改變了待測離子的保留特性。,由于離子對AB具有疏水性，因而被非極性固定相提取。其它待測離子A1，A2，A3.因與B離子間的成對能力不同，而形成不同疏水性的離子對，使得各待測物

6、在柱內(nèi)的保留值不同，從而達(dá)到分離的目的。,High-Performance Liquid Chromatography,影響保留因子的因素,一、離子對試劑的種類和濃度,酸類或帶負(fù)電荷物質(zhì)四丁基季銨鹽 堿類或帶正電荷物質(zhì)烷基磺酸鹽或硫酸鹽,High-Performance Liquid Chromatography,二、流動相的pH值 盡量使得試樣組分與離子對試劑全部離子化。 pH值對弱酸和弱堿的保留有很大的影響。,離子對色譜法適用于有機(jī)酸、堿、鹽的分離，以及用離子交換色譜法無法分離的離子型和非離子型化合物的混合物分離。如生物堿類、兒茶酚胺類、有機(jī)酸類、維生素類和抗生素類藥物。,High-Per

7、formance Liquid Chromatography,手性色譜法,Chiral Chromatography,High-Performance Liquid Chromatography,布洛芬,SIbuprofen,RIbuprofen,美國、日本等國的藥品管理部門已要求在申請新手性藥物時，提供每一種對映體的藥動學(xué)、藥理學(xué)和毒理學(xué)研究資料，并對研制外消旋體而不是單個對映體作出合理的解釋。,High-Performance Liquid Chromatography,手性固定相法 手性衍生化法 手性流動相添加劑法,High-Performance Liquid Chromatograp

8、hy,High-Performance Liquid Chromatography,R-Isomer,Zolmitriptan,Column: Chiralpak AD-H Mobile phase: Hexane/Isopropanol/Triethylamine 72/28/0.25, V/V/V,Yu L.S. et al., (2005) Biomedical Chromatography, 19, 191-195.,*,*,*,S/R=2.6,S/R=2.7,S/R=3.1,High-Performance Liquid Chromatography,第二節(jié) 高效液相色譜法的固定相和

9、流動相及其選擇,一、化學(xué)鍵合相色譜法的固定相 1. 鍵合相的種類,非極性鍵合相,弱極性鍵合相,極性鍵合相,C1,C8,C18,苯基,較少應(yīng)用,反相色譜,氨基 氰基,正相色譜,High-Performance Liquid Chromatography,2. 鍵合相的性質(zhì)和特點,鍵合反應(yīng),含碳量和覆蓋度,代表鍵合相表面基團(tuán)的鍵合量，其值越高說明載體上的硅醇基被鍵合的越完全，固定相吸附性能降低，穩(wěn)定性增加。,特點,a 使用過程中不流失；b 化學(xué)穩(wěn)定性好；c 適于梯度洗脫；d 載樣量大,使用注意點,流動相中水相的pH應(yīng)維持在28，否則會引起硅膠溶解 不同廠家，不同批號的同一類型鍵合相也可能表現(xiàn)不同的

10、色譜特性,High-Performance Liquid Chromatography,二、化學(xué)鍵合相色譜法的流動相,根據(jù)溶劑的極性和強(qiáng)度來選擇,High-Performance Liquid Chromatography,三、分離條件的選擇,高效液相色譜中的速率理論,H = A +Cmu + Csmu,渦流擴(kuò)散,流動相傳質(zhì)阻抗,靜態(tài)流動相傳質(zhì)阻抗,粒度,根據(jù)速率理論，HPLC的實驗條件應(yīng)該是：,小粒度，均勻的球形化學(xué)鍵合相 低粘度流動相，流速不宜快 柱溫適當(dāng),High-Performance Liquid Chromatography,固定相顆粒對色譜分離的影響,High-Performan

11、ce Liquid Chromatography,High-Performance Liquid Chromatography,High-Performance Liquid Chromatography,正相鍵合相色譜法的分離條件,通常采用烷烴加適量極性調(diào)節(jié)劑,反相鍵合相色譜法的分離條件,一般以極性最強(qiáng)的水為基礎(chǔ)溶劑，加入甲醇、乙腈等極性調(diào)節(jié)劑,反相離子對色譜法的分離條件,離子對試劑的選擇 流動相pH的選擇 有機(jī)溶劑及其濃度的選擇,High-Performance Liquid Chromatography,第三節(jié) 高效液相色譜儀,High-Performance Liquid Chroma

12、tography,一、輸液系統(tǒng),等強(qiáng)度洗脫 梯度洗脫,High-Performance Liquid Chromatography,二、分離和進(jìn)樣系統(tǒng),High-Performance Liquid Chromatography,三、檢測系統(tǒng),對檢測器的要求：,靈敏度高,噪音低,線性范圍寬,重復(fù)性好,適用范圍廣,High-Performance Liquid Chromatography,PDAD,紫外檢測器,適用于具有紫外吸收的組分,High-Performance Liquid Chromatography,蒸發(fā)光散射檢測器,適用于糖類、高級脂肪酸、氨基酸、甘油三酯等,High-Perfo

13、rmance Liquid Chromatography,安培檢測器,適合于具有氧化還原活性的物質(zhì)，如生物胺，酚、羰基、巰基化合物,High-Performance Liquid Chromatography,化學(xué)發(fā)光檢測器,雙（2，4，6）三氯苯基草酸酯,High-Performance Liquid Chromatography,四、控制/記錄系統(tǒng),High-Performance Liquid Chromatography,第四節(jié) 高效液相色譜分析方法,一、定性分析方法,二、定量分析方法,1. 外標(biāo)法,外標(biāo)一點法,A標(biāo),A樣,C標(biāo)V,C樣V,標(biāo)準(zhǔn)曲線法,A = a + bC,High-Performance Liquid Chromatography,2. 內(nèi)標(biāo)法,以待測組分和內(nèi)標(biāo)物的峰高比或峰面積比求算試樣含量的方法。 使用內(nèi)標(biāo)法可以抵消儀器穩(wěn)定性差、進(jìn)樣量不夠準(zhǔn)確等原因帶來的定量分析誤差。,